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滇重楼无公害栽培关键技术
滇重楼产区由于长期缺乏系统、科学的种植技术规范,规范化生产程度较低、病虫害严重、滥用化肥和农药等情况普遍存在,严重制约了滇重楼的可持续利用和区域经济的发展.开展滇重楼的无公害栽培是解决该问题的关键.本研究针对滇重楼的无公害栽培技术进行探讨,包括GMPGIS-II指导基地选址、田间管理、病虫害综合防治技术等,该体系可为滇重楼无公害精细化栽培提供参考.
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滇重楼品质评价及其甾体皂苷类成分积累规律分析
目的:探讨滇重楼居群内品质差异及甾体皂苷活性成分的积累规律,为该药材的品质评价及优质种质资源筛选提供实验依据.方法:采用超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)测定滇重楼居群内根茎、茎、叶中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的含量,建立各部位的UPLC指纹图谱,分析该药材居群内的品质差异及其甾体皂苷类成分的积累规律.结果:滇重楼居群内根茎和叶中总皂苷含量均＞0.6％,不同部位中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅶ含量具有显著性差异,而重楼皂苷Ⅵ含量无显著性差异;UPLC指纹图谱中5个共有峰为根茎、茎、叶共有,各部位共有峰UPLC指纹图谱相似度均＞0.753.结论:重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ主要在植物的叶绿体中合成并进行储藏和分配,经茎向下运输,主要在根茎和叶中积累和储存,总皂苷含量在不同部位的积累规律为叶＞根茎＞茎;滇重楼不同部位中主要活性成分含量及种类差异较大.
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滇重楼贮藏期间化学成分的变化
目的:研究滇重楼贮藏期间化学成分的变化,为指导滇重楼采收、经营、贮藏、加工提供依据.方法:将9份滇重楼密封后在室温下贮藏1年;运用HPLC测定重楼皂苷在贮藏前后的变化.结果:滇重楼药材贮藏1年后化学成分发生了很大变化,必然引起药材质量和功效的变化.重楼皂苷Ⅵ含量有所增加,重楼皂苷Ⅱ含量有所减少,重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅶ含量变化无规律,增减均有.结论:为保证药材的质量和药用功效,滇重楼不宜久藏.
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七叶一枝花和滇重楼提取物的制备、表征及其体外溶血作用分析
目的:比较七叶一枝花和滇重楼提取物体外溶血作用强弱,探讨不同结构类型重楼皂苷的溶血作用特点.方法:采用75％乙醇对七叶一枝花和滇重楼根茎进行提取,采用大孔吸附树脂对各类物质进行富集,采用快速制备色谱技术对目标组分群进行定向制备,基于对照品对照和在线紫外吸收光谱对总取物、部位和组分进行化学信息表征,采用分光光度法测定各样品的溶血率.结果:根据质量浓度-溶血率曲线计算七叶一枝花和滇重楼总提物的50％溶血浓度分别为34.97,46.52 mg·L-1.在2.5 ～ 10 mg·L-1时,七叶一枝花部位中仅有70％乙醇洗脱部位(PPC-D)显示了较强溶血作用,滇重楼部位中70％乙醇和95％乙醇洗脱部位(PPY-D和PPY-E)均显示溶血作用.5.0,10 mg·L-1时PPC-D的溶血率分别为78.00％和95.68％,PPY-D (PPY-E)的溶血率分别为31.86％和63.29％(15.82％和55.25％).在2.5 ～5.0mg·L-1时,七叶一枝花的组分呋甾皂苷和薯蓣皂苷未显示溶血作用,偏诺皂苷组分在质量浓度为2.5,5.0 mg·L-1的溶血率分别为5.89％和90.33％;滇重楼的呋甾皂苷组分同样未显示溶血作用,偏诺皂苷(薯蓣皂苷)组分在质量浓度为2.5,5.0mg·L-1的溶血率分别为0.51％和57.75％(4.29％和49.39％).结论:七叶一枝花和滇重楼均具有溶血作用,其中七叶一枝花强于滇重楼;七叶一枝花溶血成分群主要为偏诺皂苷类,滇重楼溶血成分群为偏诺皂苷和薯蓣皂苷;两者呋甾皂苷均无溶血作用;总提物溶血作用强弱主要由其中所含偏诺皂苷和薯蓣皂苷类成分的绝对含量和相对比例来决定.
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不同种植基地滇重楼根茎和叶中甾体皂苷类有效成分的差异及相关性分析
目的:探讨不同种植基地滇重楼根茎和叶中主成分及甾体皂苷类有效成分的差异及相关性.方法:采用液质联用技术(LC-MS)定性分析不同种植基地滇重楼根茎和叶中甾体皂苷类有效成分、主成分的差异及相关性,流动相水(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0 ～ 12 min,45％ ～ 60％ B;12 ～ 25 min,60％ ～ 30％ B;25 ～ 28 min,30％ ～ 100％ B;28～30 min,100％B;30 ～35 min,100％ ～45％B;35～40 min,45％B),检测波长203 nm,采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描,毛细管电压4 kV,终板抵消电压500 V,雾化器压力253.8 kPa,干燥气体为氮气,气体流速8 L·min-1,干燥温度350℃,离子源温度220℃.结果:定性检测到不同种植基地滇重楼根茎和叶中重楼皂苷Ⅰ,重楼皂苷Ⅱ,重楼皂苷Ⅲ(薯蓣皂苷),重楼皂苷Ⅴ,重楼皂苷Ⅵ,重楼皂苷Ⅶ,重楼皂苷H,纤细薯蓣皂苷8种甾体皂苷有效成分;重楼皂苷Ⅰ,重楼皂苷Ⅲ(薯蓣皂苷),重楼皂苷Ⅴ,重楼皂苷Ⅶ是不同种植基地滇重楼根茎中的主要存在形式,重楼皂苷Ⅴ和重楼皂苷Ⅵ是不同种植基地滇重楼叶中的主要存在形式;根据不同种植基地滇重楼根茎、叶正离子模式下液质数据的主成分分析模型可将其分为4类,其中巍山、南涧、弥渡、曲靖4个种植基地滇重楼根茎中主成分和不同种植基地滇重楼叶中主成分聚为一类.结论:不同种植基地滇重楼根茎和叶中8种主要甾体皂苷类有效成分存在较大差异;不同种植基地滇重楼根茎中主成分差异较大,而叶中主成分无显著差异.
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多茎滇重楼地上叶和茎中主要次生代谢产物的积累
目的:探讨不同居群多茎滇重楼叶和茎中主要次生代谢产物的积累规律.方法:采用HPLC测定不同居群多茎滇重楼叶和茎中主要活性成分重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的含量,流动相水(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0～40 min,30％ ～60％ B;40～50 min,60％ ～ 30％ B),检测波长203 nm,运用单因素方差分析、聚类分析和HPLC图谱分析探讨其次生代谢产物的积累规律.结果:不同居群多茎滇重楼叶中重楼皂苷Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ含量及总含量具有显著差异;除个别居群外,不同居群多茎滇重楼茎中重楼皂苷Ⅶ含量差异较小.叶中主要检测到重楼皂苷Ⅱ和Ⅶ,茎中只检测到重楼皂苷Ⅶ.多茎滇重楼和滇重楼比较的地上部分叶和茎HPLC图谱相似度均较低,6个居群叶中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ总质量分数达到了2015年版《中国药典》规定的限量标准.结论:多茎滇重楼与滇重楼地上部分叶和茎存在一定差异,但多茎滇重楼叶中有效物质成分较高,该研究为多茎滇重楼地上部分叶和茎的开发利用提供了一定的参考依据.
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中药重楼全球产地生态适宜性分析
在野外调查和数据收集的基础上,结合药用植物全球产地生态适宜性分析系统(geographic information system for global medicinal plants,GMPGIS),对中药重楼全球产地生态适宜性区域进行分析和评价.以重楼药材基原物种云南重楼Paris polyphylla var.yunnanensis和七叶一枝花P.polyphylla vat.chinensis道地产区、主产区与野生分布区的采样点为依据,选取冷季平均气温、热季平均气温、年平均气温、年均降水量、年均相对湿度、年均日照强度和土壤类型7个生态指标作为主要参考因子,经过生态相似性比对分析得出云南重楼与七叶一枝花在全球范围内的生态适宜性产区和潜在种植区.结果表明云南重楼和七叶一枝花的大生态相似度区域相似,在全球范围内主要分布在中国、巴西、美国、赞比亚、刚果、缅甸、坦桑尼亚、墨西哥、安哥拉及玻利维亚等19个国家.其中,中国的大生态适宜性产区主要包括云南、四川、广西、湖南、湖北、广东、贵州、江西、福建和安徽等16个省区.该研究表明GMPGIS可以较好地应用于中药材引种及生产区划,研究结果可为重楼药材的资源保护和可持续利用提供参考依据.
关键词： 滇重楼 华重楼 产地适宜性 生态因子 药用植物全球产地生态适宜性分析系统 -
滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的研究
目的:在无菌培养条件下探讨植物激素对滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的影响.方法:以滇重楼成熟种子为试验材料,在无菌培养条件下采用正交试验设计研究赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)、吲哚乙酸(IAA)及活性炭(AC)对滇重楼种子休眠破除的影响,并对无菌萌发过程中植株形态发生进行观察.结果:滇重楼种子无菌培养过程中种子萌动的佳配比是GA3-ZR-IAA-AC(1.0 mg·L-1∶1.0 mg·L-1∶0.1 mg·L-1∶0.5 g·L-1),种子萌动率达80.00％,4种因子对滇重楼种子萌动率作用大小为IAA＞ GA3＞ZR ＞AC;滇重楼种子无菌培养过程中种子萌发的佳配比是GA3-ZR-IAA-AC(1.0 mg·L-1∶1.0 mg·L-1∶0.1 mg·L-1∶0.5 g·L-1),种子萌发率达66.66％,4种因子对滇种楼种子发芽率作用大小为AC＞IAA ＞ZR＞GA3.结论:培养基添加植物激素GA,ZR,IAA,AC对滇重楼种子休眠破除、种子萌动及萌发有重要影响.
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云南省不同地区滇重楼4种皂苷含量的比较
目的:研究云南省不同产地滇重楼中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ4种皂苷的含量.方法:采用WatersC18柱(4.6mm×150mm,5μm),乙腈-水梯度洗脱,流速1mL/min,柱温30℃,检测波长203nm.结果:4种甾体皂苷在0.384-8.16μg范围内线性良好,R=0.9994-0.9998,平均加样回收率97.7％-99.1％;云南省不同产地的滇重楼中4种皂苷含量差异较大,依次为Ⅰ(0.979％)＞Ⅱ(0.492％)＞Ⅶ(0.097％)＞Ⅵ(0.004％)；野生滇重楼皂苷的总含量(1.52％)高于人工栽培滇重楼(1.26％).结论:该方法准确、简捷,可用于重楼中4种皂苷的含量测定.
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不同干燥方法对滇重楼总皂苷含量和抗氧化活性的影响
目的：研究9种不同干燥方法对滇重楼根茎中总皂苷含量的影响及抗氧化性的差异。方法采用紫外-可见分光光度法测定滇重楼药材中总皂苷的含量，通过1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）法、2,2'-连氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS+）自由基清除法评价其皂苷提取物的抗氧化能力。结果不同干燥方法滇重楼根茎中总皂苷含量存在显著差异，35℃烘干样品的总皂苷含量高，为17.557 mg/g，其次为自然阴干样品13.740 mg/g。综合2种抗氧化能力检测结果，不同干燥方法滇重楼皂苷提取物均有很好的抗氧化能力，其中35℃烘干样品抗氧化能力强，均表现一定的浓度依赖效应。结论35℃烘干干燥处理是获得高品质和高活性滇重楼药材的较好方法。
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滇重楼丛枝菌根的研究
目的:研究滇重楼根部丛枝菌根真菌(AMF)侵染情况及根际土中AMF孢子的种类与数量.方法:采用Phillips和Hayman染色法挑选滇重楼丛枝菌根.同时,采用Gendemann的湿筛倾析法获得AMF孢子,进行形态学鉴定.结果:丛枝菌根真菌能侵染滇重楼根系并形成典型的丛枝菌根(AM),侵染率在35.3%～98.6%,且侵染强度较强.从滇重楼根际采集的10个土样中共分离出24种AMF,Acaulospora属11种,Glomus属7种,Gigaspora属3种,Scutellospora属3种,分别是附柄无梗囊霉、双网无梗囊霉、凹坑无梗囊霉、孔窝无梗囊霉、浅窝无梗囊霉、光壁无梗囊霉、柯氏无梗囊霉、多果无梗囊霉、波兰无梗囊霉、瑞氏无梗囊霉、细凹无梗囊霉、白色球囊霉、双型球囊霉、沙荒球囊霉、草莓球囊霉、纯黄球囊霉、微丛球囊霉、凹坑球囊霉、微白巨孢囊霉、珠状巨孢囊霉、分支巨孢囊霉、美丽盾巨孢囊霉、透明盾巨孢囊霉、吉尔莫盾巨孢囊霉.其中,双网无梗囊霉是滇重楼的优势种.结论:AMF是滇重楼丰产栽培中的一种潜在应用价值的生物资源.
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滇重楼的抗肿瘤活性成分研究
目的:研究滇重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis根茎中具有抗肿瘤作用的活性成分.方法:利用硅胶柱色谱,Sephadex LH-20,反相制备HPLC等手段进行分离纯化,并通过波谱技术进行结构鉴定.采用MTT法对分离到的化合物进行抗肿瘤活性筛选.结果:从醋酸乙酯和正丁醇层中分离得到了6个化合物,鉴定为薯蓣皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→)-β-D-葡萄糖苷(1)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基(1→4)-β-D-葡萄糖苷(2)、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、乙基-α-D-呋喃果糖苷(4)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(5)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4),[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(6).结论:化合物1～4为首次从滇重楼中分离得到,化合物3和4为首次从重楼属植物中分离得到,化合物5为首次从滇重楼的根茎中分离得到.药理实验表明,化合物1～3,5和6对小鼠肺腺癌细胞LA795都显示出一定的抑制作用,其中化合物5和6显著.
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滇重楼皂苷对10种肿瘤细胞株的细胞毒谱及构效关系研究
滇重楼Paris polyphylla Snfith vat.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.为百合科重楼属植物的干燥根茎.重楼味苦,性微寒,有小毒,归肝经,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等.已有研究表明,重楼的水、甲醇和乙醇提取物对A549(人肺癌)、MCF-7(人乳腺癌)、HT29(人结肠腺癌)、A498(人肾腺癌)、PACA-2(人胰腺癌)、PC-3(人前列腺癌)等多种人体肿瘤细胞均有抑制作用,甾体皂苷类是其主要活性成分[1].本实验将从滇重楼分离纯化得到的6种皂苷采用MTT检测方法,针对10种不同类型的肿瘤细胞株的细胞毒活性、构效关系进行了比较研究;
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川滇地区重楼属药用植物资源质量初评
中药重楼,又名七叶一枝花,为延龄草科重楼属Paris植物华重楼P.polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara和滇重楼P.polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz的干燥根茎[1].
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滇重楼内生真菌分离与多样性研究
通过研究滇重楼内生真菌菌群的多样性,为探讨内生真菌作为生物活性物质的价值提供科学依据.该文通过对云南省嵩明县、鹤庆县、保山市野生滇重楼植株的采集,从其根、块茎、叶中分离内生真菌,并基于ITS序列分析和形态学方法进行分类鉴定.试验分离得到内生真菌749株,分别归属于41个属,其中3个属仅在根部出现,12个属仅在块茎出现,8个属仅在叶部出现.各个样地分离出的内生真菌表现出一定的差异,其中鹤庆样地块茎部位分离的内生真菌多样性高,各样地间,各部位间的内生真菌组成相似性系数低.研究认为,不同样地、不同部位的滇重楼内生真菌的差异性可能与生境以及各部位结构、成分等因素有关.
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AM真菌对滇重楼光合参数及生理指标的影响
通过室温盆栽接种试验与室内分析相结合的方法,观察灭菌土壤条件下接种28种丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼光合参数和生理生化指标的影响.结果表明,滇重楼与AM真菌形成了良好的共生关系.AM真菌诱导处理后,不同AM真菌对滇重楼叶片的光合参数和生理生化指标的影响有所差异,AM真菌的施用能够提高滇重楼叶肉细胞的光合作用强度,提高滇重楼叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量及保护酶活性,增强了滇重楼抗不利环境的能力,促进了滇重楼的生长,而滇重楼与AM真菌之间存在一定的相互选择性.从综合接种效应来看,瑚状盾巨囊霉Racocetra coralloidea、美丽盾巨孢囊霉Scutellospora cal-ospora、近明球囊霉Claroideoglomus claroideum、透明盾巨孢囊霉S.pellucida和明球囊霉Rhizophagus clarus是适宜滇重楼大田栽培时推广应用的优良备选菌株.
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滇重楼总皂苷含量和菌根侵染率与土壤因子的关系
目的:通过滇重楼总皂苷含量和AM菌根侵染率与根际土壤性质的相关研究和通径分析,探讨土壤因子在滇重楼品质形成中的作用.方法:测定了25个主要分布区滇重楼根茎总皂苷含量、土壤理化性质和养分状况、根系AM菌根侵染率,并应用相关分析和通径分析研究了滇重楼总皂苷含量和菌根侵染率与土壤因子的关系.结果:在自然条件下,滇重楼根系能与AM真菌形成良好的共生关系,侵染率在36.41％～83.37％.总皂苷与脲酶活性、碱性磷酸酶活性、有机质含量呈显著正相关,与土壤容重呈显著负相关.AM菌根侵染率与碱解氮呈显著正相关.通径分析结果表明,滇重楼总皂苷含量主要受其根际土壤碱解氮的影响,其次为土壤有机质和脲酶活性.而菌根侵染率主要受土壤pH制约,其次为碱解氮、脲酶活性和速效磷.结论:滇重楼品质形成与土壤因子密切相关,通径分析更能反映土壤因子对滇重楼总皂苷含量和菌根侵染率的贡献.
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滇重楼灰霉病及其病原鉴定
灰霉病是滇重楼的主要病害之一,常引起滇重楼花器腐烂而导致种子绝收,该研究通过田间病害调查,掌握了该病发生的基本情况,通过带病组织和菌核培养分离获得病原菌,并依据柯赫氏法则验证其致病性.结果表明,病原菌分生孢子梗葡萄状分枝,分生孢子椭圆形,长9.70～13.70 μm,平均(11.32±0.82) μm,宽(7.05 ～9.12) μm,平均(8.24±0.48) μm,精孢子球形,直径(3.34±0.31) μm,病原菌在发病植株及PDA培养基上均易产生黑色菌核,基于形态特征鉴定病原菌为一种葡萄孢属Botrytis真菌.基于病原菌RPB2,HSP60,G3PDH基因及其联合基因构建的系统发育树,支持该病原菌为葡萄孢属真菌一个新种,该菌适培养温度为20℃,适pH为8,持续光照会抑制病原菌生长.
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接种不同AM真菌对滇重楼菌根侵染率和入药品质的影响
通过室温盆栽接种试验与室内分析相结合的方法,观察灭菌土壤条件下接种28种丛枝菌根(AM)真菌对药用植物滇重楼根系AM真菌侵染能力和入药质量的影响.结果显示,与对照组(CK)相比,接种外源AM真菌对滇重楼根系AM真菌的孢子密度、侵染率、侵染强度具有调控(增减)作用,增强根内菌丝的琥珀酸脱氢酶(SDH)和碱性磷酸酶(ALP)活性,从而提高滇重楼菌根生活力.AM真菌诱导子处理后,不同AM真菌对滇重楼根茎中不同甾体皂苷的影响有所差异,AM真菌的施用能够提高滇重楼的药用品质,但在实验期间未造成滇重楼甾体皂苷质量的变异.实验结果表明,滇重楼与AM真菌之间的共生关系具有一定的相互选择性,近明球囊霉Claroideoglomus claroideum和瑚状盾巨囊霉Racocetra coralloidea是适宜滇重楼大田栽培时推广应用的优良接种菌剂.
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云南省不同地区滇重楼皂苷含量的对比及影响因子分析
用HPLC对采自云南省不同地区的22份滇重楼样品进行6种皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ,PA,H含量测定,用SPSS 17.0进行数据分析不同产区对皂苷含量的影响;结果表明滇重楼生长的海拔对皂苷含量的影响并不显著,而生长地区对皂苷含量影响较为显著,滇西的滇重楼明显高于其他各产区,具有明显的地区依赖性.
