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多重耐药因子A在临床菌株中的检测与分析
目的 调查大肠埃希菌临床菌株中多重耐药因子A (MarA)的表达情况,并分析其与第3、4代头孢菌素耐药的关系.方法 随机抽取2003至2009年间大肠埃希菌49株,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测外膜孔通道蛋白F(OmpF)的反义RNA-F因子(MicF)、主动外排系统AB (AcrAB)和MarA的相对表达量,纸片扩散法检测抗菌药物的敏感性.结果 49株大肠埃希菌中,7株(14.29％) AcrAB转录水平上调；13株(26.53％)膜孔蛋白MicF转录水平上调；11株(22.45％)MarA转录水平上调；3种耐药因素同时升高的有2株.49株大肠埃希菌对头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟的耐药率依次为79.59％、75.51％和51.02％,其中AcrAB表达升高组对此3种抗菌药物的耐药率依次为100.00％、100.00％和57.14％,MicF表达升高组为80.00％、86.67％和53.33％,MarA表达升高组为75.00％、100.00％和58.33％,3种耐药因素同时存在时耐药率则均为100.00％.结论 MarA在大肠埃希菌临床菌种中起到一定的调控AcrAB和膜孔蛋白MicF的作用,当MarA同时调控二者高表达时可引起耐药率大幅升高.
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耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床分离株的流行病学与耐药机制研究
目的：了解耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌流行病学情况以及耐药机制，帮助临床合理使用抗菌药物，为控制医院感染提供依据。方法收集耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌110株及敏感株6株，进行来源病区和标本种类的统计分析；应用重复序列聚合酶链反应（REP-PCR）进行基因型分型；使用PCR检测β-内酰胺酶基因（OXA、IMP、VIM等）及外排泵编码基因（adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG）的携带情况；采用实时荧光定量PCR对比耐药菌株与敏感菌株的外排泵基因表达量的差异。结果110株菌株主要来自痰标本，重症监护病房（ICU）分离率高；所有菌株REP-PCR电泳图谱分为A～G 7型，110株耐药菌株均为A型，且均被检测到含有OXA-23、OXA-51基因，均未检测到含有OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因；外排泵编码基因adeA、adeB、adeC、adeJ及adeG的阳性率均为100％；耐药菌株外排泵编码基因adeA、adeB、adeC表达量明显高于敏感菌株。结论耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的流行型别基本相同，均为A型，应引起临床医护人员的高度重视；β-内酰胺酶基因（OXA-23、OXA-51）的表达以及外排泵基因（adeA、adeB、adeC）的过度表达与其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性有关。
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白念珠菌唑类耐药和生物膜相关基因的表达
目的：研究白念珠菌临床分离株唑类耐药和生物膜形成相关基因的表达。方法收集上海市公共卫生临床中心2006至2011年92例感染性疾病患者[病毒性肝炎、结核、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）]血液、无菌部位和黏膜分离鉴定的白念珠菌104株，选用ATB FUNGUS3检测抗菌药物（氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑）的低抑菌浓度（MIC），采用半定量逆转录聚合酶链反应（PCR）分析唑类敏感、浓度依赖性敏感（S-DD）和耐药菌株之间药物外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1和药物靶酶基因ERG11表达的差异，同时通过甲基四氮盐（XTT）代谢试验筛选强生物膜形成能力菌株（HBFs），研究其与弱生物膜形成能力菌株（LBFs）相关基因ALS3和HWP1表达的差异。结果104株白念珠菌中共检测出16株至少对1种唑类药物耐药，6株至少对1种唑类药物S-DD。药物靶酶基因ERG11在耐药株、S-DD株和敏感菌之间比较，差异有统计学意义（P＝0．0078），且耐药株、S-DD株分别与敏感菌比较，差异有统计学意义（P＜0．05），然而CDR1、CDR2和MDR1表达量在3种菌株间无明显差异。生物膜形成能力试验显示16株菌生物膜形成能力增强，其HWP1表达量与LBFs比较差异有统计学意义（P＝0．0079），ALS3表达量差异无统计学意义。结论 ERG11基因的过度表达为白念珠菌唑类耐药的重要机制。菌丝细胞壁蛋白HWP1基因的高表达与白念珠菌生物膜形成增强相关。
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体外氟康唑诱导光滑念珠菌和近平滑念珠菌耐药及相关机制研究
目的:研究光滑念珠菌和近平滑念珠菌对氟康唑耐药的易感性及其诱导耐药株的耐药机制.方法:选取对氟康唑敏感的光滑念珠菌、近平滑念珠菌临床株各1株以及对氟康唑敏感的光滑念珠菌标准株ATCC2001、近平滑念珠菌标准株ATCC22019,利用浓度递增法,在体外用氟康唑诱导使其成为耐药株,采用实时定量PCR检测外排泵相关基因、其转录因子和靶酶编码基因表达,并对光滑念珠菌PDR1转录因子、近平滑念珠菌MRR1转录因子和ERG11基因进行PCR扩增和测序.结果:光滑念珠菌较近平滑念珠菌更易被氟康唑诱导为耐药株,CDR1的过度表达为其主要的耐药机制,对PDR1转录因子测序后发现了新的突变位点Y932C、V847F.近平滑念珠菌诱导耐药株的MDR1表达显著增加,其MRR1转录因子中亦存在新的突变位点P295S、I799S.结论:光滑念珠菌和近平滑念珠菌对氟康唑的耐药易感性不同,耐药机制也存在差异.新发现的转录因子突变位点有待验证其功能.
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白假丝酵母对氟康唑耐药机制的研究进展
白假丝酵母通常不引起人体感染,但对于免疫低下或免疫缺陷者,其却可导致机会性感染,如咽喉部感染、阴道感染,甚至可发生危及生命的系统性真菌感染.临床治疗白假丝酵母感染的常用药物为氟康唑,且已取得了良好的治疗效果.但近年来,随着艾滋病患者的增多、广谱抗生素的不合理应用、癌症患者接受放化疗及免疫抑制剂在器官移植患者中的应用,白假丝酵母的感染率显著升高,而氟康唑的反复应用则导致了耐氟康唑白假丝酵母菌株出现,这使得临床治疗变得更为棘手.要解决白假丝酵母的耐药问题,必须先了解其耐药机制,故对其耐药机制的探讨成为了研究热点.
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3种念珠菌对氟康唑耐药的易感性及耐药机制比较
目的 研究比较3种念珠菌对氟康唑耐药的易感性及其体外诱导耐药株的耐药机制.方法 选取同一患者中同时分离的对氟康唑敏感的白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌各1株,在体外氟康唑的作用下诱导其成为耐药株.采用罗丹明6G试验比较敏感株与耐药株的外排泵作用,RT-PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2以及靶酶编码基因ERG11的表达,并对ERG11基因进行PCR扩增和测序,同时通过罗丹明123试验对3种念珠菌的线粒体膜电位(△ψm)进行检测.结果 光滑念珠菌易被氟康唑诱导为耐药株,其CDR1的过度表达引起外排泵作用增强.白念珠菌和热带念珠菌的诱导耐药株以ERG11表达增加为主,其中白念珠菌的ERG11存在V437I、A430V、S263L和T128K突变位点.此外,白念珠菌和光滑念珠菌的诱导耐药株表现为呼吸缺陷.结论 不同念珠菌对氟康唑耐药的易感性不同,耐药机制也存在差异.
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铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用
目的 探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用.方法 选取36株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌,采用琼脂二倍稀释法,测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC及进行泵抑制剂碳酰氰基对-氯苯腙(CCCP)存在情况下的干预试验；用实时定量RT-PCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况；用PCR法分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机制.结果 在CCCP作用下,36株铜绿假单胞菌中24株菌对环丙沙星的敏感性(MIC)由20～320 mg/L提高到2.5～40 mg/L,主动外排表型阳性率为66.7％ (24/36),15株菌高表达MexAB-OprM外排系统(41.7％),21株高表达MexXY-OprM外排系统(58.3％).15株高表达MexAB-OprM外排系统铜绿假单胞菌同时表达MexXY-OprM外排系统；12株干预试验阴性的铜绿假单胞菌均无mexA、mexX高表达；随机选择mexA、mexX高表达的4株细菌均发生mexR、mexZ基因突变,出现氨基酸替代.结论 主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达是铜绿假单胞菌多重耐药的机制之一；外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关.
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碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵和外膜孔蛋白表达水平的研究
目的 探讨我国临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM和外膜孔蛋白OprD 2 表达水平及其与碳青霉烯类抗生素耐药性之间的关系.方法 收集我国15个省市28所医院临床分离的铜绿假单胞菌655株,琼脂稀释法测定该菌加入外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(CCCP)前后对亚胺培南和美罗堵南的MIC;RT-PCR检测外排泵MexAB-OprM和孔蛋白OprD 2 的表达水平;十二烷基硫酸钠一聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)检测外膜孔蛋白OprD 2 .结果 收集到的655株铜绿假单胞菌菌株对亚胺培南和美罗培南敏感率分别为52.5%和59.2%,加入CCCP前后其对亚胺培南和美罗培南的敏感率无明显变化;52.0%(51/98)美罗堵南耐药株MexAB-OprM显著高表达(P<0.05),43.7%(59/135)亚胺培南耐药株OprD 2 显著低表达(P<0.05),14.8%(20/135)亚胺培南耐药株OprD 2 表达缺失;SDS-PAGE和Western-blot显示与标准菌株PAO1相比.OprD2 表达水平减低菌株ZZ20显影减低,表达缺失菌株BJ1不显影.结论 MexAB-OprM表达升高和OprD<.2 表达降低甚至缺失是我国铜绿假单胞菌对美罗培南和亚胺培南耐药的重要机制.
关键词： 铜绿假单胞菌 外排泵 外膜孔蛋白 羟基氰氯苯腙 实时荧光定量反转录聚合酶链反应 -
替加环素和其他广谱抗菌药物对产丝氨酸碳青霉烯酶和金属β内酰胺酶的肠杆菌科细菌的抗菌活性:SENTRY监测网络的报告
肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性可以由过量产生AmpC酶且同时外膜孔道蛋白大量缺失和(或)外排泵过量表达,或产生能水解碳青霉烯类的β内酰胺酶引起.这些碳青霉烯酶可以分为金属β内酰胺酶(MβL)和丝氨酸碳青霉烯酶两类.替加环素是一类半合成的甘氨酰环素类抗菌药物,对其他类抗生素耐药的细菌通常对替加环素无交叉耐药.
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哌拉西林-他唑巴坦治疗铜绿假单胞菌感染:延长滴注时间的临床意义
铜绿假单胞菌是医院感染的重要病原菌,近年来因细菌产生β内酰胺酶、外排泵机制和外膜蛋白通透性改变等多种耐药机制导致抗感染药物对其所致感染疗效欠佳.
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连翘酯苷B对肺炎克雷伯菌外排泵活性的影响
目的 研究连翘酯苷B对肺炎克雷伯菌外排泵活性的影响,探讨连翘酯苷B抗菌的作用机制.方法 收集10株临床对环丙沙星敏感的肺炎克雷伯菌,用环丙沙星逐步诱导直至细菌MIC不再升高为止,将诱导后菌株作为实验对象,与连翘酯苷B共培养,采用溴化乙锭(EB)蓄积实验比较连翘酯苷B作用前后菌株外排泵活性的变化.结果 连翘酯苷B的亚抑菌浓度为512 mg·L-1.连翘酯苷B作用前后的菌株在加入外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)后胞内荧光量均明显高于各自未加CCCP的荧光量.有8株细菌不论加或不加CCCP,其经连翘酯苷B作用后的荧光量均高于连翘酯苷B作用前的荧光量;2株细菌在连翘酯苷B作用前后外排泵活性无明显变化.结论 外排泵普遍存在于肺炎克雷伯菌中,连翘酯苷B可抑制肺炎克雷伯菌外排泵的活性.
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临床分离光滑假丝酵母菌唑类药物耐药机制研究
目的 了解光滑假丝酵母菌临床分离株中唑类耐药株的耐药机制.方法 收集2009年和2010年5家医院28例患者的38株光滑假丝酵母菌,根据CLSI M27-A3指南采用微量肉汤稀释法测定5种常用抗真菌药物(两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑)的小抑菌浓度.采用Real-Time PCR法检测CDR1、CDR2及SNQ2等外排泵基因以及ERG11和转录因子PDR1的表达;流式细胞仪分析罗丹明6G外排能力,考察细胞膜外排泵功能;同时,PCR扩增ERG11基因全长以及PDR1基因主要功能区并测序比对.结果 38株光滑假丝酵母菌对两性霉素B和5-氟胞嘧啶均敏感,其中17株为唑类耐药菌.唑类耐药株CDR1基因表达明显高于敏感株(P =0.001),并且对罗丹明6G外排能力也显著强于敏感菌(P=0.001).光滑假丝酵母菌敏感和耐药菌株ERG11表达差异无统计学意义(P =0.283),且ERG11基因未发现突变.此外,17株光滑耐药菌株PDR1基因表达量与敏感菌株比较差异无统计学意义(P =0.086),但每株耐药菌株PDR1基因均分别发现1处有义突变.结论 转录因子PDR1突变、外排泵基因CDR1表达上调以及外排泵功能增强是目前临床上光滑假丝酵母菌唑类药物耐药的主要机制.
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光滑假丝酵母菌氟康唑耐药机制研究
目的 探讨光滑假丝酵母菌CDR1、CDR2、SNQ2和ERG11基因mRNA表达差异以及ERG11基因突变在氟康唑耐约形成中的作用.方法 采用罗丹明6G试验比较氟康唑耐药组与敏感组的外排泵作用,Real-Time PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2、SNQ2和ERG11表达情况.同时,对ERG11基因进行PCR扩增和测序,比较耐药组和敏感组的突变位点.结果 耐药组光滑假丝酵母菌外排泵功能明显强于敏感组,差异有统计学意义(P＜0.01).耐药组的CDR1和CDR2 mRNA表达水平显著高于敏感组(P＜0.01,P＜0.05);但两组间SNQ2和ERG11 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).检测到ERG11基因4个突变位点,均为同义突变,其中3个突变位点在耐药组和敏感组中均出现,1个突变位点只在敏感组中出现.结论 外排泵功能在光滑假丝酵母菌氟康唑耐药过程中起重要作用.ERG11基因序列存在多态性,但未发现与氟康唑耐药相关的突变位点.
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白假丝酵母菌唑类耐药相关的转录调控研究进展
近30年来,白假丝酵母菌已成为导致免疫功能低下患者发病和死亡常见的条件致病性真菌.随着临床上唑类药物的频繁使用,耐药菌株不断被检出,其耐药机制研究也备受关注.近年来,其在转录调控水平的机制研究也取得了很大进展,明确了耐药相关编码基因的顺式作用元件和反式作用因子,并部分阐述了相应的作用机制.文章就白假丝酵母菌唑类药物耐药相关的转录调控研究进展作一综述.
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多重耐药鲍曼不动杆菌外排泵基因和外膜蛋白基因的检测
目的 了解鲍曼不动杆菌主动外排系统和外膜蛋白基因的表达情况,探讨其在介导细菌多重耐药中的作用.方法 K-B法和琼脂二倍稀释法检测100株鲍曼不动杆菌临床分离株的药物敏感性；PCR扩增adeB、adeJ、carO基因；实时荧光定量PCR检测外排泵AdeABC、AdeIJK的mRNA表达水平.结果 100株中有75株多重耐药株,对米诺环素和多黏菌素B的耐药率分别为60.0％和0％；多重耐药组与敏感组adeB基因阳性率分别为82.7％(62/75)和44.0％(11/25),carO基因阳性率分别为98.7％ (74/75)和40.0％(10/25),差异均有统计学意义(x2分别为14.223和48.016,P均＜0.05).敏感和多重耐药两组间adeB基因相对表达量差异有统计学意义(t=4.209,P＜0.01),而两组间adeJ基因相对表达量结果无显著性差异.结论 鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药情况严重；adeB基因在多重耐药及部分敏感株中表达量明显增加；AdeA BC主动外排系统在鲍曼不动杆菌多重耐药性的形成中具有一定的作用.
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碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的药物敏感性及分子特征分析
目的 分析碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae without producing carbapenemase,CRKPPC)的抗菌药物敏感性、β-内酰胺酶基因和外排泵基因的分布及外排泵抑制剂的抑制作用.方法 收集2012-2014年我院碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌108株,用Mastdiscs combi Carba plus纸片系统检测碳青霉烯酶表型.用微量肉汤稀释法测定CRKPPC菌株对抗菌药物的敏感性;用PCR和DNA测序技术检测β-内酰胺酶耐药基因,包括超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase,ESBL)和质粒介导的头孢菌素酶(AmpC)编码基因及外排泵基因acrAB-tolC、kexD、kdeA、kpnEF和kpnGH;外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和利血平抑制试验分析外排泵在碳青霉烯耐药中的作用;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析细菌外膜孔蛋白OmpK35和OmpK36的表达.结果 碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌菌株中有26株细菌为CRKPPC;这26株细菌对β-内酰胺类药物高度耐药,对阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均较高,但对替加环素、多黏菌素、头孢他啶/阿维巴坦和氨曲南/阿雏巴坦等有很好的敏感性;blacTx-M和blaSHV检出率依次为76.9％和57.7％;外膜孔蛋白OmpK35和OmpK36均有不同程度的缺失,缺失率分别为57.7％和19.2％;80％以上的细菌中存在acrAB-tolC、kexD、kdeA、kpnEF和kpnGH基因;CCCP对碳青霉烯类药物具有显著的抑制作用,而利血平没有明显的抑制作用.结论 替加环素、多黏菌素可以作为CRKPPC联合用药的基础药物.CRKPPC菌株中存在AmpC、ESBLs及不同程度的外膜孔蛋白OmpK35和OmpK36缺失,但外排泵对碳青霉烯类药物的外排作用是CRKPPC对碳青霉烯耐药的主要机制,外排泵抑制剂可能在这种细菌引起的感染治疗中有重要价值.
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不动杆菌多药外排泵研究进展
不动杆菌是引起院内感染的常见病原菌,近年来由于大量使用广谱抗菌药物,多重耐药和泛耐药菌株日益增多,给临床治疗造成严重困难.不动杆菌耐药机制较为复杂,主要包括产生抗菌药物水解酶,药物作用靶位改变,膜通透性下降和外排泵等.国内外研究主要集中于产生水解酶和药物靶位改变,对于外排泵机制报道较少,但其介导的细菌耐药现象普遍存在[1].
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细菌外排泵抑制剂研究进展
细菌外排泵造成了抗生素耐药的严重问题,为此,近年来外排泵抑制剂研究广受关注.外排泵抑制剂可以抑制耐药细菌对药物的外排,从而恢复其对抗生素的敏感性.简要介绍几类外排泵的结构,综述化学合成和天然产物来源的各类外排泵抑制剂的研究进展,以期为研究者们提供新的思路,设计或筛选出活性更好的新型外排泵抑制剂.同时还提出了外排泵抑制剂的研究方法和药敏实验的规范化问题,希望人们更全面而准确地筛选、评价外排泵抑制剂及其临床应用价值.
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细菌外排泵抑制剂
细菌外排泵与细菌耐药有关,为解决细菌耐药性问题,近年来外排泵抑制剂的研究受到关注.细菌外排泵抑制剂在结构上有差异,其共同特点是能抑制细菌对药物的外排从而恢复耐药菌对抗菌药物的敏感性.本文综述了近年来细菌外排泵NorA、Mex、Tet(B)和AcrAB-TolC抑制剂的研究进展情况.所发现的外排泵抑制剂在结构上有差异,其共同特点是能抑制细菌对药物的外排从而恢复耐药菌对抗菌药物的敏感性.植物是细菌外排泵抑制剂的来源之一,开发中草药资源对解决耐药菌感染问题具有实际意义.
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多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排机制
铜绿假单胞菌(PA)对多种抗菌药物都有不同程度的耐药,其耐药机制包括酶的产生、生物被膜的形成、外排泵的高表达和外膜孔蛋白表达的降低或缺失,其中多药外排泵能排出多种结构和功能不相关的抗菌药物,包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素、氯霉素等,目前被认为是导致PA固有和获得性多重耐药的重要原因.
