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四川省2007-2014年急性弛缓性麻痹病例中埃可病毒6型的基因特征分析
目的 描述四川省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中埃可病毒6型(echovirus 6,E6)的基因特征.方法 对四川省2007-2014年AFP病例中分离到的11株E6进行全VP1区逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增和核酸序列测定,进行序列比对和构建进化树.结果 从2889份AFP病例的粪便标本中分离出11株E6病毒.经测序鉴定为C2基因亚型10株,C4基因亚型1株.来源病例的临床诊断分别为:肠道病毒感染6例,周围神经炎l例,格林巴利综合征2例,肌炎2例.C4亚型与10株C2亚型VP1区核酸序列同源性为83.9％-85.2％,氨基酸同源性为96.5％-97.2％;10株C2亚型VP1区核酸序列同源性为94.0％-100.0％,氨基酸同源性为98.9％-100％.结论 2007-2014年四川地区AFP病例中分离到的E6为C2和C4基因亚型,其中以C2基因亚型为主.
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安徽省六安市一起埃可病毒6型脑膜炎暴发的调查
目的 分析2005年安徽省六安市一起埃可病毒6型(Echo6)脑膜炎暴发疫情的流行病学、临床、实验室特征.方法 对所有病例进行流行病学、临床特征分析,通过病例对照调查危险因素.采用病毒分离方法确定病原,运用分子生物学检测进一步确证,利用血清学检测分析隐性感染情况.结果 105例病例分布在金寨县30个乡镇中的17个,41.0%病例集中在斑竹园镇,该镇罹病率为203/10万,具有学校和班级聚集性.发病年龄在3～15岁之间,以6～10岁小学生为主,平均年龄7.8岁,罹病率为10.9/10万,男性和女性的罹病率分别为24.2/10万和8.4/10万.大部分患者主要临床表现为发热、头痛、呕吐.从72例患者脑脊液中分离出25份Echo6,占35%.病例组与对照组比较,喝饮料OR=4.1,95% CI:1.4～12.0;尤其喝袋装饮料OR=3.3,95% CI:1.3～8.8.在生产袋装饮料的7名职工中有6人粪便检出Echo6.100名7～14岁健康人血清中和抗体阳性46人,阳性率46.0%,与病例组阳性率73.5%相比差异有统计学意义(X2=12.526,P=0.000).结论 为一起主要由Echo6感染所致的病毒性脑膜炎的疫情,病例组喝饮料尤其袋装饮料的比例明显高于对照组.
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云南省2009年埃可病毒6型分离株KM57-09全基因序列分析
目的 对云南埃可病毒6型(Echo6)分离株KM57-09全基因序列进行分析和研究,了解其遗传特性.方法 设计针对Echo6引物,提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列.利用Mega 5.05、RDP 3和SimPlot 3.5.1等生物学软件分析全基因序列.结果 获得KM57-09全基因组核苷酸序列长度为7419 bp,编码含2191个氨基酸残基的多聚蛋白；与其他Echo6参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为79.3％ ～ 80.2％和93.3％～ 94.4％,与原型株D' Amor核苷酸和氨基酸同源性分别为79.3％和93 6％.在基因组各个区段上,Echo6KM57-09分离株的2C和3A区,与HN-2-E25核苷酸同源性高,分别为86.3％和85.0％,而其5'UTR、VP4、3D和3'UTR区则与CoxB5-Henan-2010核苷酸同源性高,分别为91.7％、81.2％、89.7％和96.9％.在VP1区上,与中国其他省份分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.0％～96.0％和95.8％～ 99.0％,而与其他国家分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为77.6％ ～ 96.0％和95.2％ ～ 99.0％.进化分析发现Echo6可分为5个分支,中国分离株分属C和E分支,其中KM57 09属于E分支,且5个分支之间核苷酸的差异为15.6％ ～23.3％.3D基因序列种系进化分析以及RDP3和SimPlot 3.5.1软件分析发现KM57-09序列在非结构区可能存在重组.结论 Echo6可分为5个基因型,KM57- 09分离株属于E基因型；中国大陆曾存在不同 Echo6株传播链的流行.
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湖南省2009～2014年分离埃可病毒6型的基因特征分析
为了解中国埃可病毒6型(Echovirus type 6,ECHO6)的基因特征.通过对2009～2014年从湖南省手足口病病例监测中分离到的6株ECHO6病毒部分VP1序列测定,并与来自中国5个省和世界范围的138株ECHO6病毒进行序列对比和构建系统进化树.中国ECHO6病毒形成2个彼此独立的进化分支,分支1和分支2.湖南省ECHO6病毒均聚集在2c亚分支中,可能具有共同的进化来源.分支2病毒在我国分布较广且流行时间较长,可能是我国的优势流行株.以核苷酸差异＞30％为分组依据,可将ECHO6病毒划分为4个基因组A～D,以核苷酸差异在15％～30％之间分组,将D基因组再划分为10个基因亚组,D1～D10.湖南省ECHO6病毒均属于D7基因亚型.研究结果显示,2009～2014年期间,湖南省存在着具有共同进化来源的ECHO6病毒流行.中国至少存在4个不同进化分支的ECHO6病毒流行.
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山东省脑膜炎和脑炎病例中埃可病毒6型的基因特征分析
为分析山东省脑膜炎和脑炎病例中埃可病毒6型(Echovirus 6,E6)的基因特征,本研究对山东省2007～2012年间采集的脑膜炎和脑炎病例脑脊液标本进行了病毒分离,阳性分离物采用血清学和分子生物学方法鉴定型别,与国内外其他E6进行同源性分析,并构建VP1完整编码区系统进化树.本研究共分离到6株E6病毒,同源性分析显示:这6株分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为78.6％～99.8％和95.5％～100.0％,与原型株(D'Amori)核苷酸和氨基酸同源性分别为为76.9％～78.4％和92.3％～95.1％.系统进化树分析显示:山东省E6分离株可分为A、B、C和D4个基因簇,这6株分离株属于A、B、D3个簇.山东省E6分离株之间存在较大的遗传差异,E6在山东的循环存在不同的传播链.
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河北省儿童病毒性脑炎和脑膜炎患者埃可病毒6型VP1基因特征分析
目的 阐明河北省儿童病毒性脑炎/脑膜炎患者中埃可病毒6型(Echovirus 6,ECHO6)分离株的基因特征及与国内外其他流行株的进化关系.方法 对河北省2013-2015年间儿童病毒性脑炎/脑膜炎病例中鉴定为肠道病毒阳性的157份脑脊液标本进行毒株分离,通用引物分段扩增毒株VP1基因获得序列;BLAST比对确定ECHO6毒株,并与来自中国9个省和其他国家的175株ECHO6病毒VP1基因序列进行同源性及亲缘关系分析.结果 获得19株ECHO6分离株;我国ECHO6流行株属于C及D基因型,本研究中19株河北分离株分属C及D9c基因亚型.19株分离株间VP1基因核苷酸同源性为79.3％-100％,氨基酸同源性为95.8％-100％,与原型株(D'Amori)核苷酸和氨基酸同源性分别为76.2％-78.3％和92.3％-95.1％.VP1基因的序列分析显示,19株ECHO6分别与我国云南、浙江和山东的ECHO6分离株存在较高核苷酸和氨基酸同源性.结论 2013-2015年间引起河北省儿童病毒性脑炎/脑膜炎的ECHO6病毒流行株主要为C及D9c基因亚型,同时存在多个传播链.
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埃可病毒6型分离株KM57-09VP1基因的遗传特征
目的:分析2009年昆明市无菌性脑膜炎患儿脑脊液埃可病毒6型(ECHO virus 6,E6) KM57-09分离株VPI基因的遗传特征.方法:采用RD、Hep-2细胞对无菌性脑膜炎患儿脑脊液样本进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增VP1基因,并进行测序；采用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对；采用Omiga软件对所测定节段序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、比对、拼接；采用Mega4.1软件分析,并与18个参考株的VP1基因序列进行比较.结果:分离株为E6,其VPI区的核苷酸长度与其他E6均为867 bp; KM57-09株与其他E6分离株核苷酸同源性在77.6％-96.0％之间,氨基酸同源性在95.2％～99.0％之间,与山东株2010D0010005核苷酸和氨基酸的同源性高,分别为96.0％和99.0％,与中国其他几种分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7％～80.9％和95.8％～97.2％；基因进化树分析显示,KM57-09株与山东株2010D0010005株属于同一个进化分枝,与中国其他几种分离株属不同分枝.结论:KM57-09分离株为埃可病毒6型,为中国3个分离株分枝中的一枝.
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埃可病毒6型表面特异性抗原VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达埃可病毒6型表面特异性蛋白VP1,并制备其多克隆抗体.方法 筛选VP1蛋白氨基酸序列中抗原性强的片段,优化基因序列,分别构建重组表达质粒pGEX-4T-2-vp1和pET-28a-vp1.将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,进行15％ SDS-PAGE鉴定.将融合蛋白VP1-GST及VP1-His分别用Glutathione resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化.以纯化后的VP1-His融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,以VP1-GST融合蛋白为检测抗原,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性.结果 经双酶切及测序鉴定证明,重组质粒pGEX-4T-2-vp1和pET-28a-vp1构建正确.VP1-GST和VP1-His融合蛋白的相对分子质量分别为38 000和19 000,两种融合蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的60％和30％,纯化后的纯度均＞90％.兔抗VP1血清效价为1:320 000,可与融合蛋白VP1-GST和VP1-His发生特异性结合.结论 成功原核表达了融合蛋白VP1-His和VP1-GST,且VP1-His具有良好的免疫原性,其制备的多克隆抗体的特异性较好,为埃可病毒快速检测技术的建立奠定了基础.
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龙岩市病毒性脑炎病例埃可病毒6型的基因特征
目的 分析埃可病毒6型(ECHO6)龙岩市分离株的分子生物学特征.方法 从2011年10株(7例儿童,3例成人)分离自脑脊液标本经血清中和鉴定的6株ECHO分离株中,选取3株(2例儿童,1例成人)进行VP1区核苷酸序列分析,并进行同源性比较及遗传进化分析.结果 3株ECHO6分离株VPl区序列长度为600个核苷酸,编码200个氨基酸;3株之间的核苷酸同源性为99％～100％,氨基酸同源性为96％～100％;与2010年福建龙岩分离株之间核苷酸同源性为94％,氨基酸同源性为95％～99％,基因分型一致,同属C2型.结论 龙岩市2011年病毒性脑炎病例的ECHO6为C2型,成人感染病例值得关注.
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一起儿童病毒性脑炎暴发肠道病毒ECHO6型分离株VP1基因特征分析
目的 对埃可病毒6型(ECHO6)福建龙岩分离株进行分子生物学分析,阐明ECHO6病毒福建龙岩分离株的分子生学特征及其与世界其它分离株的基因关系.方法 采集暴发病例脑脊液标本,用RD细胞进行分离病毒,阳性分离物采用中和试验及PCR序列分析确定其血清型别;RT-PCR扩增VP1基因全长,测定序列进行同源性及亲缘进化树分析.结果 13例细胞培养阳性分离物经中和试验及序列分析结果均为ECHO6.随机选取4株病毒株进行VP1全基因序列分析显示:4个病毒株之间同源性＞99%;与山东病毒株E6/SD/sewage/081226/2-2同源性高于其他参考株.在遗传进化树上,4株分离病毒株同属一个分支,为C2亚型.结论 ECHO6是引起本次福建省龙岩市长汀县儿童病毒性脑炎暴发的病原体,其基因型为C2亚型.
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1起埃可病毒6型所致无菌性脑膜炎暴发的血清流行病学调查
[目的]了解埃可病毒6型(ECHO6)所致无菌性脑膜炎暴发流行后长汀县≤15岁健康儿童以及非流行区健康儿童的中和抗体水平.[方法]采集流行区和非流行区健康儿童血清,用微量板法测定血清中和抗体水平.[结果]流行区(长汀县)≤15岁健康儿童中和抗体GMT为1∶62.17,显著高于非流行区(漳平市)的GMT(1∶10.72);流行区中和抗体阳性率为36.74％,非流行区阳性率为5.60％；ECHO6在各年龄组间感染情况无显著差异(P＞0.05).[结论]ECHO6所致疾病流行后,人群具有较高的免疫力.
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2011年济南市某污水河中肠道病毒的分离鉴定与序列分析
目的：监测济南市区地表河水中的人类肠道病毒（HEV），分析其基因特征。方法于2011年5、6、7月份对流经济南市中心城区的西泺河各采集1份河水标本，经过阴离子膜吸附的方法浓缩后，接种RD、HEp-2和L20b细胞进行病毒分离。测定分离株VP1编码区序列并进行序列分析。结果共分离到HEV 9株，其中埃可病毒6型（Echovirus 6，E6）4株，柯萨奇B2病毒（Coxsackievirus B2，CVB2）5株。VP1核苷酸序列分析显示，4株E6病毒与2010年山东省临沂市脑膜炎病例分离株的同源性较高（95．9％～96．7％），提示当地有发生E6引起的脑膜炎病例的可能性；与济南市2010年污水分离株的同源性为94．5％～99．7％。5株CVB2病毒之间有较高的核苷酸同源性（98．4％～100％），与往年山东省急性弛缓性麻痹病例分离株之间同源性为80．9％～95．2％。结论生活污水的排入河可作为HEV环境监测的采样点，我国无专门HEV病例监测系统，环境监测是了解一个地区HEV流行的重要途径。
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昆明市病毒性脑炎病例中埃可病毒6型分离株的VP1编码序列基因特征分析
目的 对2010-2014年昆明市病毒性脑炎病例中分离的4株埃可病毒6型(echovirus 6,E6) VP1编码序列特征进行分子流行病学分析.方法 对昆明市2010-2014年传染病重大专项脑炎综合征实验室监测系统分离到的4株E6病毒的VP1区基因进行基因扩增和测序;按参考文献下载基因库中E6病毒VP1编码序列参考序列,用MEGA5.1软件计算不同毒株的核苷酸和氨基酸差异率,并构建系统进化树,进行VP1编码序列特征和分子流行病学分析.结果 2010-2014年云南省病毒性脑炎病例中分离到的103份肠道病毒中共检出E6病毒4株,占3.88％ (4/103),E6病毒的阳性总检出率为0.29％ (4/1 376).VP1编码序列特征分析表明,云南4株E6毒株均为C2基因亚型(genotype C2).结论 除原型株为A基因型外,其他E6毒株可分为3个基因型(基因型B、C和D),C基因型又分为4个亚型,云南分离株分布在C2基因亚型,且2010年和2011年的云南分离株与部分山东地区的分离株较为接近,而2013年和2014年的云南分离株自成一簇,为云南省特有的亚型,该病毒可能在昆明地区存在小范围流行.
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北京市丰台区2012年污水中埃可病毒6型分离株VP1区的基因特征分析
目的 了解北京市丰台区污水中埃可病毒6型(echovirus 6,ECHO6)的基因特征.方法 选择吴家村污水处理厂为监测点,2012年1～12月,每月采集监测点污水进行肠道病毒(enterovirus,EV)分离和鉴定,并对分离到的ECHO6进行VP1编码区核苷酸序列测定和分析.结果 在吴家村污水处理厂监测点,共分离到64株病毒,其中ECHO6病毒12株,在非脊髓灰质炎(脊灰)肠道病毒(non-poliomyelitis entero-viruses,NPEV)分离株中比例高.选择10株ECHO6进行VP1编码区核苷酸序列分析,结果表明10株病毒的VP1区核苷酸同源性为92.9％～100.0％,与D5基因型代表株的VP1区核苷酸同源性高,为88.7％～94.2％.进化树分析结果显示,北京市丰台区ECHO6分离株与D5基因型代表株处于同一分支,并在D5进化分支的不同簇中.结论 北京市丰台区污水中ECHO6分离株为D5基因型并在D5进化分支的不同簇中,并为丰台区人群肠道病毒的监测提供重要的补充信息.
