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RNA干扰抑制ERα对E2诱导HeLa细胞增殖的影响
目的 RNA干扰抑制雌激素受体-α(estrogen receptor-α,ERα)对雌二醇(estradiol,E2 )诱导HeLa细胞增殖的影响.方法 针对不同浓度的雌二醇干预前后克隆转染ERα siRNA的HeLa 细胞,检测细胞活力、细胞周期及细胞成瘤能力.结果 转染后ERα基因表达被显著抑制;随雌二醇浓度增加,转染前后HeLa细胞活力皆加强,呈一定的浓度依赖性(P<0.05);但对于每一个雌二醇浓度,抑制ERα皆可使细胞活力显著增强(P<0.05);另外,高浓度雌二醇的HeLa细胞周期中,S、G2/M期细胞显著增加(P<0.05);抑制ERα使细胞种植的瘤重量增加(P<0.05).结论 雌二醇可促进HeLa细胞的增殖作用,ERα的存在可抑制雌二醇的促HeLa细胞增殖作用.
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紫杉醇诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及对端粒酶活性的影响
目的研究紫杉醇对人宫颈癌Hela细胞的作用.方法将紫杉醇处理Hela细胞后,用MTT法测定宫颈癌Hela细胞的生长抑制率.光镜下观察细胞凋亡形态的改变.流式细胞仪和原位末端标记技术检测细胞周期及细胞凋亡率,流式细胞仪检测bcl-2水平,TRAP法测定端粒酶活性的变化.结果 0.01～1μmol/L的紫杉醇能引起Hela细胞的凋亡.表现为Gz/M期阻滞,且呈时间依赖性及剂量依赖性.紫杉醇在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调和bcl-2表达水平下降.结论紫杉醇诱导宫颈癌Hela细胞凋亡,并抑制端粒酶活性,bcl-2参与了紫杉醇诱导的宫颈癌细胞凋亡过程中端粒酶活性的调控.这一机制将为临床治疗提供理论依据.
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Lactacystin及联合顺铂对子宫颈癌HeLa细胞的影响
目的 探讨蛋白酶体抑制剂Lactacystin (LAC)及其与顺铂(DDP)联合对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞技术(FCM)检测宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率和凋亡率.细胞并分为4组:对照组、LAC组、DDP组及LAC+DDP,每组均干预HeLa细胞48 h.结果 MTT检测结果显示,LAC可有效抑制HeLa细胞的增殖,呈浓度(r=0.864,P＜0.05)及时间依赖性(r=0.926,P＜0.05),48 h时的半数抑制量(IC50)为4.98μmol/L;与DDP组比较,LAC+ DDP组对细胞增殖的抑制作用明显增强(P＜0.05).DDP的IC50由63.71 μmol/L下降至28.93μmol/L.FCM检测结果显示,细胞凋亡率随LAC作用时间的延长而上升,具有时间依赖性(r=0.869,P＜0.05);与DDP组凋亡率[(17.49±3.82)％]和LAC组[(24.98±4.61)％]比较,LAC+ DDP组[(38.06±5.72)％]诱导细胞凋亡的作用显著增强(P＜0.05).结论 蛋白酶体抑制剂LAC可有效抑制宫颈癌HeLa细胞的体外增殖作用,并通过诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡,增强DDP对宫颈癌HeLa细胞株的作用.
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低糖高乳酸环境下吉非替尼诱导HeLa细胞EGFR-TKI耐药的研究
目的 探讨低糖高乳酸微环境对表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)抑制HeLa细胞的影响和可能机制.方法 HeLa细胞在常糖(葡萄糖10 mmol/L)和低糖高乳酸(葡萄糖3mmol/L+乳酸2.5 mmol/L)环境下培养,并分别给予2.67 μ mol/L吉非替尼干预.采用CCK-8法测定HeLa细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期,荧光定量RT-PCR检测EGFR和mTOR mRNA水平的表达.结果 与常糖组比较,低糖乳酸组24h和72 h细胞抑制率均显著升高(P＜0.01),48 h细胞抑制率略高于常糖组.与吉非替尼阴性组比较,常糖+吉非替尼组和低糖乳酸+吉非替尼组在24、48、72 h三个时点细胞抑制率均显著上升(P＜0.01).与常糖组相比,低糖乳酸组48 h细胞诱导凋亡率显著上升(P＜0.01),低糖乳酸+吉非替尼组细胞诱导凋亡率较低糖乳酸组显著降低(P＜0.01).与常糖组比较,低糖乳酸组存活细胞的EGFR和mTOR mRNA表达水平上调(P＜0.05).常糖+吉非替尼组的EGFR和mTOR mRNA水平均上调(P＜0.05).与低糖乳酸组比较,低糖乳酸+吉非替尼组的EGFR和mTOR mRNA上调水平有显著差异(P＜0.01).结论 高乳酸低糖环境下吉非替尼可大幅度上调存活HeLa细胞EGFR和mTOR表达水平,可能是诱导HeLa细胞抵抗EGFR-TKI的机制.
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HDAC6小分子RNA对子宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制
宫颈癌的发生位居女性肿瘤的第3位,每年全球范围大约有371 200例新病例被诊断,由于其高达51％的病死率而成为公众关注的健康问题[1].然而,目前对于宫颈癌的治疗主要是基于铂类药物为基础的化疗以及手术和放疗,这些治疗的效果十分有限[2].组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)6属于Ⅱ型HDAC家族,在所有的18个HDAC家族成员中,HDAC6具有独特的结构和生物学特性,即具有两个功能性的去乙酰化结构域和一个锌指基序,这两个功能性的去乙酯化结构域是HDAC6发挥生物学活性所必需的[3-4].目前,越来越多的研究显示,HDAC6与肿瘤的发生、发展关系密切,包括卵巢癌[5]、小儿急性髓细胞样白血病[6]、神经母细胞瘤[7]、胃癌和结肠癌[8]等.本研究利用RNA干扰技术探讨HDAC6表达下调对宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖和细胞凋亡的影响,并初步探讨其相应的分子机制.
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小剂量甲磺酸伊马替尼对缺氧的子宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响
缺氧是导致肿瘤细胞放疗抵抗的主要原因之一.缺氧在实体瘤中是一个常见的现象,实体瘤中缺氧细胞占10%～50%,对放射线有较强的抵抗,成为肿瘤放疗后复发和转移的潜在根源[1].甲磺酸伊马替尼(其他名称:格列卫)是一种高效特异的酪氨酸激酶抑制剂,通过阻止酪氨酸激酶受体如Bcr-Abl、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、干细胞因子(c-Kit)等的自身磷酸化,影响细胞信号传导,从而影响肿瘤细胞的增殖、分化与凋亡.本研究将分子靶向药物--甲磺酸伊马替尼作用于正常和缺氧状态下的宫颈癌细胞系HeLa细胞,研究小剂量甲磺酸伊马替尼对于缺氧状态下HeLa细胞放射敏感性的影响及其作用机制,为甲磺酸伊马替尼进一步应用于宫颈癌的放射增敏治疗提供实验依据.
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维甲酸对人子宫颈癌细胞系HeLa细胞间隙连接蛋白转导途径调控作用的研究
目的 探讨维甲酸对人子宫颈癌细胞系HeLa 细胞间隙连接蛋白（Cx）43信号转导途径的调控作用。方法 应用特异性钙指示剂（Fluo-3 AM）在激光扫描共聚焦显微镜下动态观察维甲酸作用后的细胞质内信号转导分子游离钙的分布及强度变化。采用流式细胞仪、结合蛋白印迹技术分析，检测外源信号分子对Cx43的表达以及蛋白酪氨酸磷酸化状态的影响。结果 HeLa细胞内游离钙经维甲酸作用后明显超载，细胞内游离钙浓度（［Ca2+］i） 由静息状态下的35.73 μmol/L上升至58.16 μmol/L。流式细胞仪分析，Cx43阳性细胞表达率由1.9%上升至26.3%。蛋白印迹技术分析，HeLa细胞出现Cx43酪氨酸磷酸化。结论 维甲酸对HeLa细胞Cx43信号转导途径的调控是在细胞质内游离钙的参与下，使Cx43阳性细胞表达率上升，并在酪氨酸位点出现明显的磷酸化作用下实现的。
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端粒酶RNA反义核酸联合其催化亚单位反义核酸对子宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用
目的探讨端粒酶RNA反义核酸(反义hTR)联合端粒酶RNA催化亚单位反义核酸(反义hTERT),对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及作用机理.方法实验分为空白对照、脂质体对照、正义hTR 、正义hTERT、反义hTR、反义hTERT及反义hTR+反义hTERT组.分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、PCR-端粒重复序列扩增(TRAP)-酶联免疫吸附实验(ELISA)、吖啶橙染色法、流式细胞术检测宫颈癌Hela细胞转染反义hTR和反义hTERT后细胞的增殖、端粒酶活性及细胞形态学、细胞凋亡和细胞周期阻滞的变化.结果宫颈癌Hela细胞转染端粒酶反义核酸后,出现明显的细胞增殖抑制、端粒酶活性下降、细胞凋亡形态学改变、细胞凋亡率升高及细胞周期阻滞.反义hTR、反义hTERT组与空白对照、脂质体对照及正义hTR、正义hTERT组比较,差异有统计学意义(P< 0.01) .Hela细胞转染反义核酸(0.2 μmol/L)3 d 后,反义hTR+反义hTERT组,细胞增殖抑制率、相对端粒酶活性(相对于空白对照组)、细胞凋亡率分别为69.3%、19.6%、28.6%,与反义hTR组和反义hTERT组比较,差异均有统计学意义( P< 0. 01),Q值分别为0.867、0.919、1.075.反义hTR+反义hTERT组 G0/G1期细胞比例增加.结论端粒酶反义核酸能通过特异性抑制端粒酶活性、诱导细胞凋亡及增强细胞周期阻滞等途径抑制宫颈癌Hela细胞生长,端粒酶反义hTERT和反义hTR联合应用有协同作用.
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2-甲氧雌二醇对子宫颈癌细胞及其移植瘤的作用
目的探讨2-甲氧雌二醇(2-ME2)对HeLaS3细胞的作用,以及对鼠荷人宫颈癌移植瘤的作用.方法应用细胞增殖检测和细胞周期分析,检测加入不同浓度2-ME2 的HeLaS3细胞及二甲基亚砜(实验组)的生长情况和细胞周期变化,以仅加入二甲基亚砜的HeLaS3细胞作为对照(对照组);采用荧光显微镜观察HeLaS3细胞的形态变化,以DNA电泳检测细胞凋亡情况;采用蛋白印迹法检测2-ME2 对诱生型一氧化氮合酶(iNOS) 的表达.此外,建立鼠荷人宫颈癌移植瘤模型,口饲2-ME2(75 mg/kg)14 d,检测肿瘤体积的变化,并通过原位细胞凋亡检测,分析肿瘤中的细胞凋亡情况. 结果 1 μmol/L 2-ME2 作用48 h后,HeLaS3新生细胞数是对照组的81% (P<0.05),作用96 h,是对照组的19% (P<0.01 ).5 μmol/L 2-ME2 作用20 h后,凋亡细胞由对照组的4%增至16%,G2/M期细胞由对照组的16%增至55% (P<0.01 );荧光显微镜发现典型的核固缩及形态异常的有丝分裂中期细胞,DNA电泳发现典型的梯状DNA条带.iNOS 的表达随2-ME2作用时间延长和浓度增加而变化,与凋亡变化相似,而且iNOS 抑制剂1400W抑制了2-ME2诱导的细胞凋亡.在动物实验中,与对照组相比,2-ME2治疗组宫颈癌移植瘤体积下降34%;原位细胞检测发现,2-ME2治疗组肿瘤切片中凋亡和坏死细胞增多.结论 2-ME2具有抑制人类宫颈癌细胞HeLaS3及鼠荷人宫颈癌移植瘤生长的作用,有可能成为宫颈癌抑制剂.
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吉西他滨对人子宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用及其机理研究
目的研究低浓度[即处理24 h时的10%药物致死剂量,24 h IC10]吉西他滨对人宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用及其机理.方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选吉西他滨增敏实验的浓度(即24 h IC10);以该浓度吉西他滨处理HeLa细胞4、8、12及24 h,弃药后立刻行60Coγ射线照射(4、6、8 Gy),计数细胞存活分数,计算增敏比;同时采用流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡效应,蛋白印迹杂交法分析p53、bcl-2及bax蛋白表达量的变化.结果吉西他滨的24 h IC10为0.01 μmol/L,该浓度吉西他滨分别处理细胞4、8、12及24 h,弃药后立刻照射,增敏比分别为1.19、1.35、1.72、1.93.流式细胞仪分析显示,S期细胞比例随吉西他滨处理时间延长而逐渐升高(P＜0.01),其中处理24 h时,S期细胞占51.8%.吉西他滨处理后照射,凋亡细胞比例占21.6%,同时,凋亡相关基因p53、bcl-2及bax蛋白的表达量,与单纯吉西他滨处理及单纯照射相比无明显变化(P＞0.05).结论低浓度吉西他滨对HeLa细胞具有放射增敏作用,其增敏比随吉西他滨处理时间延长而增加.增敏机理与细胞S期阻滞密切相关,而与引发细胞凋亡关系不明显.
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子宫颈癌HeLa细胞中Bcrp1+细胞的生物学特性
目的 探讨宫颈癌HeLa细胞中Bcrp1+细胞的生物学特性.方法 采用细胞免疫荧光标记及流式细胞仪分选HeLa细胞中Bcrp1+及Bcrp1-细胞,透射电镜观察两种表型细胞的形态,倒置显微镜观察两种表型细胞培养不同时间(24、48、72 h)后的生长情况;采用流式细胞仪检测两种表型细胞的细胞周期及细胞凋亡情况;采用蛋白印迹法检测两种表型细胞中增殖周期相关蛋白--增殖细胞核抗原(PCNA)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达情况(结果均以"表达丰度"表示).结果 (1)分选结果显示,宫颈癌HeLa细胞中,Bcrp1+细胞占7.1%,Bcrp1-细胞占92.9%.透射电镜观察,与Bcrp1-细胞相比较,Bcrp1+细胞核大、核仁明显、胞质内线粒体丰富、粗面内质网增多.倒置显微镜观察,分选后的Bcrp1+细胞迅速进入分裂状态,培养24 h即贴壁生长,而Bcrp1-细胞培养48 h方有少量贴壁生长;培养24、48、72 h时,Bcrp1+贴壁细胞分别占72.8%、81.1%、80.4%,Bcrp1-贴壁细胞分别占3.3%、18.7%、12.6%,各个时间点两种表型细胞的贴壁细胞所占百分比分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(2)流式细胞仪检测显示,Bcrp1+细胞中S期细胞比例(54.1%)和增殖指数(55.6%)均高于Bcrp1-细胞中S期细胞比例(21.1%)和增殖指数(47.0%),差异均有统计学意义(P<0.05);而Bcrp1-细胞中G0/G1及G2/M期细胞比例(分别为53.0%、25.9%)均高于Bcrp1+细胞(分别为44.4%、1.5%),差异均有统计学意义(P<0.05).Bcrp1+细胞的凋亡率为0.2%,Bcrp1-细胞为5.3%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)蛋白印迹法检测显示,在Bcrp1+细胞中PCNA蛋白的表达水平(表达丰度为3140)高于Bcrp1-细胞(表达丰度为2255),而caspase-3蛋白的表达水平(表达丰度为1970)低于Bcrp1-细胞(表达丰度为3551),分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 宫颈癌HeLa细胞中Bcrp1+细胞具有较强的抗凋亡能力及旺盛的生命力,高表达PCNA蛋白、低表达caspase-3蛋白,是一群具有肿瘤干细胞特征的细胞.Bcrp1+的HeLa细胞中可能含有宫颈癌干细胞.
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外源性人乳头状瘤病毒16型E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响
目的 了解外源性人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响.方法 从宫颈癌标本中经PCR扩增回收HPV16E7基因片段,将正确的E7基因片段插入到穿梭质粒pAdTrack-CMV中,与骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌Bj5183中同源重组,重组腺病毒质粒转染人胚肾细胞株HEK-293细胞,包装表达E7基因的腺病毒,然后转染HPV18阳性的宫颈癌细胞株HeLa细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染后HeLa细胞的增殖情况,以吸光度(A)值表示;流式细胞仪检测转染前后HeLa细胞的细胞周期和细胞周期蛋白D1表达的变化.结果 在HEK-293细胞中,可以收获高转染效率的腺病毒.在荧光显微镜下,可以观察到HEK-293细胞和HeLa细胞中均有绿色荧光蛋白的表达.提取HEK-293细胞RNA,RT-PCR技术可以检测到E7基因的表达.MTT比色法检测结果显示,转染后HeLa细胞的A值低为0.38±0.02,高为0.96±0.01,分别与转染前的0.27±0.03比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).流式细胞仪检测结果显示,转染12 h后,S期细胞占(36.0±2.0)%,转染24 h后为(49.9±4.2)%,分别与转染前的(26.0±0.4)%比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);转染前、后细胞周期蛋白D1阳性表达率分别为22.4%、55.2%,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 携带HPV16 E7基因的腺病毒可转染子宫颈癌HeLa细胞,并在HeLa细胞内表达,HPV16E7基因的表达进一步影响HeLa细胞的细胞周期蛋白的表达,促进HeLa细胞增殖,可望用于治疗宫颈癌.
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1,3-O,N螺杂环类乙酰肝素酶抑制剂对子宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用
目的：通过观察乙酰肝素酶（HPA）抑制剂对子宫颈癌HeLa细胞体外生长的抑制作用及HPA表达的影响，为子宫颈癌HPA分子靶向治疗提供理论依据。方法优化设计并合成了两个系列共13种1，3-O，N螺杂环类化合物，产品编号为10～22号，其中21号为HPA抑制剂——DMBO化合物，余12种为新合成的化合物。其中，1个系列含甲氧苯基，产品编号为10～14号；另1个系列不含甲氧苯基，产品编号为15～22号。（1）采用乙酰肝素降解检测试剂盒检测新合成的化合物（选择与DMBO结构类似度高的6个化合物，即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性的作用，以50%抑制浓度（IC50）表示作用的强弱；（2）四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测新合成的化合物（7个化合物，即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用后HeLa细胞生长的抑制作用，选择抑制作用大的化合物（即16号化合物）用于以下实验；（3）细胞划痕实验观察16号化合物作用后HeLa细胞迁移能力的变化；（4）流式细胞仪检测16号化合物作用后HeLa细胞的细胞周期比例和细胞凋亡率的变化；（5）实时定量逆转录（RT）-PCR技术、蛋白印迹法和免疫组化法检测16号化合物作用后HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白表达的变化。结果（1）6个新合成的化合物（即14、15、16、20、21、22号化合物）对HPA活性均有不同程度的抑制作用，除22号化合物抑制作用不明显无法测出IC50值外，14、15、16、20、21号化合物的IC50值分别为4.47、21.81、8.36、14.13、47.19μmol/L。（2）MTT比色法检测显示，不同浓度（分别为1、5、15、30、60、120、180、240μmol/L）的7个新合成的化合物（即11、12、14、15、16、20、22号化合物）作用48 h对HeLa细胞的生长均有抑制作用，并呈明显的浓度依赖性（P<0.01），其中16号化合物的抑制效果显著（IC50值为48.16μmol/L）；进一步检测显示，16号化合物作用不同时间（分别为24、48、72、96 h）后对HeLa细胞生长的抑制作用呈明显的时间依赖性（P<0.01）。（3）细胞划痕实验观察显示，作用24 h后，实验组（加入50μmol/L的16号化合物，下同）HeLa细胞迁移能力明显受到抑制，其划痕的宽度明显大于对照组（不加16号化合物，下同）。（4）流式细胞仪检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞G0/G1期、G2/M期比例分别为（75.85±1.77）%、（11.65±0.64）%，均明显高于对照组[分别为（49.10±3.11）%、（0.17±0.24）%；P<0.01]；S期细胞比例为（12.50±1.13）%，明显低于对照组的（50.70±2.83）%（P=0.003）。实验组HeLa细胞的凋亡率为（11.9±1.2）%，明显高于对照组的（6.6±1.8）%（P=0.013）。（5）实时定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测显示，作用48 h后，实验组HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白的表达水平分别为1.23±0.46和0.46±0.31，明显低于对照组的3.43±0.45和1.30±0.58（P<0.05）；免疫组化法检测显示，实验组累积吸光度（IA）值为0.39±0.04，对照组为0.50±0.09，两组比较，差异有统计学意义（P=0.026）。结论新型1，3-O，N螺杂环类HPA抑制剂可能通过凋亡途径显著抑制子宫颈癌HeLa细胞的生长；该类抑制剂可明显抑制HeLa细胞的HPA活性，并下调其HPA mRNA和蛋白的表达。
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σ1受体在子宫颈癌组织中高表达的意义及其配体化合物对子宫颈癌细胞生长的作用
目的 探讨σ1受体(σ1R)在子宫颈癌组织中高表达的意义及其配体化合物对子宫颈癌细胞生长的作用.方法 (1)收集2007年1月至2012年12月郑州大学第二附属医院病理科存档的经手术切除或活检的不同程度子宫颈病变组织蜡块160份,其中子宫颈癌组织88份、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)组织42份、正常子宫颈组织30份(因子宫肌瘤、单纯良性卵巢囊肿行子宫全切除术);另选择HPV18型阳性的子宫颈腺癌细胞系HeLa细胞和HPV16型阳性的子宫颈鳞癌细胞系SiHa细胞.采用免疫组化SP法检测上述组织和细胞中σ1R蛋白的表达,并分析σ1R蛋白表达与子宫颈癌患者不同临床病理特征及预后的相关性.(2)从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中筛选出临床资料和σ1R基因数据均完整的子宫颈癌患者249例,分析σ1R表达与子宫颈癌患者不同临床病理特征的相关性.(3)合成σ1R配体化合物(共4个,分别为化合物14a、14e、15c、15f)并作用于HeLa、SiHa细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况及细胞对奈达铂的敏感性,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞周期比例和凋亡率.结果 (1)免疫组化SP法检测显示,正常子宫颈组织中σ1R蛋白少量表达于胞质,HSIL组织中σ1R蛋白中等量表达于胞质及个别胞核,子宫颈癌组织中σ1R蛋白大量表达于胞质和胞核;子宫颈癌HeLa和SiHa细胞中σ1R蛋白大量表达于胞质和胞核.子宫颈癌患者σ1R蛋白的阳性表达率与病理类型明显相关(P=0.020),而与患者年龄、临床分期、病理分化程度均无明显相关性(P>0.05).子宫颈腺癌患者σ1R蛋白的胞核表达阳性率(10/18)明显高于子宫颈鳞癌(27.1%,19/70;P=0.024).70例子宫颈鳞癌患者中,47例σ1R蛋白阳性患者的中位生存时间[(45.8±3.1)个月]明显低于23例σ1R蛋白阴性表达患者[(51.7±2.9)个月;t=4.037,P=0.045];该47例患者中,15例为胞质表达伴胞核表达,32例仅胞质表达,中位生存时间前者明显短于后者[分别为(38.9±3.8)、(48.7±2.1)个月;t=5.239,P=0.022].18例子宫颈腺癌患者中,10例为胞质表达伴胞核表达,8例仅胞质表达,中位生存时间前者也明显短于后者[分别为(35.0±6.3)、(44.2±4.2)个月;t=4.505,P=0.034].(2)对TCGA数据库中筛选出的249例σ1R mRNA表达相关的子宫颈癌患者资料的分析显示,208例鳞癌患者中,σ1R mRNA表达与患者年龄明显相关(P=0.005);41例腺癌患者中,σ1R mRNA表达与临床分期、淋巴结转移、脉管浸润明显相关(P<0.05).208例鳞癌患者中,σ1R mRNA表达与患者中位生存时间无明显相关性(P=0.930);而41例腺癌患者中,σ1R mRNA表达与中位生存时间明显相关(P=0.034).(3)MTT比色法检测显示,4个化合物作用后对HeLa和SiHa细胞增殖均有抑制作用,并均呈明显的浓度依赖性(P<0.01);化合物14a(6μmol/L)联合奈达铂作用于HeLa、SiHa细胞48 h后,其细胞增殖的抑制率明显高于单纯奈达铂作用后的细胞(P<0.01).细胞划痕实验显示,化合物14a(30μmol/L)作用24 h后,HeLa、SiHa细胞迁移率分别为(19.6±0.6)%、(15.8±0.8)%,均明显小于相应对照细胞[分别为(43.0±1.2)%、(29.3±1.0)%,P<0.01].流式细胞仪检测显示,化合物14a(30μmol/L)作用48 h后,HeLa、SiHa细胞的凋亡率[分别为(16.3±1.1)%、(21.3±1.9)%]均明显高于相应对照细胞[分别为(1.8±0.3)%、(2.8±0.3)%;P<0.01];HeLa、SiHa细胞的G0/G1期比例均明显高于相应对照细胞(P<0.05),HeLa细胞的S期比例无明显变化(P=0.948)、G2/M期比例显著降低(P=0.042),而SiHa细胞的S期比例显著降低(P=0.003)、G2/M期比例无明显变化(P=0.810).结论 σ1R蛋白在子宫颈癌和HSIL组织中呈过度表达,且σ1R蛋白的胞核表达是子宫颈腺癌的重要特征,σ1R蛋白阳性表达尤其是胞核表达与子宫颈癌患者的不良预后有关.新合成的σ1R配体化合物14a可显著抑制子宫颈癌HeLa和SiHa细胞的增殖,并提高细胞对奈达铂的敏感性,抑制细胞迁移能力,其可能通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期而发挥抗肿瘤作用.
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RNAi技术沉默子宫颈癌HeLa细胞中HPA基因的表达对细胞侵袭力的影响
目的 利用RNA干扰(RNAi)技术沉默宫颈癌细胞系HeLa细胞中乙酰肝素酶(HPA)基因的表达,并探讨其对宫颈癌细胞侵袭力的影响.方法 根据GenBank数据库提供的HPA基因核苷酸序列,设计4对针对HPA基因的短发夹状RNA(shRNA)特异性寡核苷酸序列(即shRNA-HPA-592、shRNA-HPA-995、shRNA-HPA-1351、shRNA-HPA-1658),并设计1条随机无关序列作阴性对照,分 别克隆到pYr-1.1质粒中.用脂质体法将上述质粒转染入HeLa细胞,以未转染质粒者为空白对照,采用逆转录(RT)-PCR技术、免疫荧光法分别检测转染后HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白的表达,筛选出其中对HPA基因沉默效果佳的质粒.将该质粒转染入HeLa细胞,采用穿膜(transwell)小室体外侵袭实验检测转染后HeLa细胞侵袭力的变化.结果 RT-PCR技术检测显示,转染shRNA-HPA-592、shRNA-HPA-995、shRNA-HPA-1351、shRNA-HPA-1658质粒后,HeLa细胞中HPA mRNA的表达水平分别为0.54±0.05、0.89 ±0.18、0.82±0.22、0.91 ±0.47,阴性对照和空白对照细胞中HPAmRNA的表达水平分别为1.31 ±0.72和1.09±0.16；免疫荧光法检测显示,转染上述不同质粒后HeLa细胞的胞质中均可见绿色荧光,HPA蛋白均呈阳性表达,其中转染shRNA-HPA-592质粒后HeLa细胞的胞质中绿色荧光强度弱.故筛选出的对HPA基因沉默效果佳的质粒即为shRNA-HPA-592质粒.体外侵袭实验检测显示,转染shRNA-HPA-592质粒后HeLa细胞的穿膜细胞数为(44±4)个,明显低于空白对照、阴性对照[分别为(182±6)、(258±17)个],差异有统计学意义(P＜0.01)；而阴性对照与空白对照比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 本研究成功筛选出了靶向HPA基因的shRNA表达质粒,转染宫颈癌HeLa细胞后可高效抑制其HPA基因的表达,明显降低宫颈癌细胞的侵袭力,为进一步研究HPA基因的表达与宫颈癌侵袭的机制奠定了基础.
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槲皮素对子宫颈癌细胞中乙酰肝素酶表达的影响
目的 探讨槲皮素对宫颈癌细胞中乙酰肝素酶(HPA)表达的影响.方法 免疫荧光法检测宫颈癌细胞系HeLa、Caski细胞中HPA蛋白的表达.实验分为3组,槲皮素组:在HeLa、Caski细胞中加入含不同浓度(20、40、80 μmol/L)槲皮素的RPMI 1640培养基；阳性对照组:小分子RNA(siRNA)转染HeLa、Caski细胞沉默其HPA的表达后,加入RPMI 1640培养基；空白对照组:在HeLa、Caski细胞中仅加入RPMI 1640培养基.3组HeLa、Caski细胞分别培养24、48、72 h后,采用实时定量PCR技术和蛋白印迹法检测其HPA mRNA和蛋白的表达.结果 (1)免疫荧光法检测显示,HeLa和Caski细胞中均有HPA蛋白的表达,均位于细胞核与细胞质中,呈红色荧光.(2)实时定量PCR技术检测显示,槲皮素组HeLa、Caski细胞中HPA mRNA的表达水平均随槲皮素浓度(分别为20、40、80 μmol/L)的升高、处理时间(分别为24、48、72 h)的延长而明显下降(P＜0.01),呈浓度和时间依赖性.与空白对照组相比,槲皮素组中40、80 μmol/L槲皮素处理后HeLa、Caski细胞中HPA mRNA表达水平均明显下降(P＜0.05)；与阳性对照组相比,槲皮素组中80 μmol/L槲皮素处理后HeLa细胞中HPA mRNA表达水平无明显变化(P＞0.05),而Caski细胞中HPA mRNA表达水平明显升高(P＜0.01).(3)蛋白印迹法检测显示,槲皮素组HeLa、Caski细胞中HPA蛋白的相对表达水平均随槲皮素浓度(分别为20、40、80 μmol/L)的升高、处理时间(分别为24、48、72 h)的延长而明显下降(P＜0.01),呈浓度和时间依赖性.与空白对照组相比,槲皮素组中40、80 μmol/L槲皮素处理后HeLa、Caski细胞中HPA蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)；与阳性对照组相比,槲皮素组中80 μmol/L槲皮素处理后HeLa、Caski细胞HPA蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05).结论 槲皮素对宫颈癌细胞中HPA mRNA和蛋白的表达均有明显抑制作用,且这种抑制作用与槲皮素浓度与处理时间均呈明显依赖关系.
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沉默DNA甲基转移酶1基因对子宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响
目的 利用RNA干扰技术沉默宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)1基因的表达,探讨沉默DNMT1基因后对HeLa细胞增殖及凋亡的影响.方法 针对DNMT1基因构建短发夹状RNA(shRNA)重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒,并行酶切鉴定和测序分析.采用RT-PCR技术筛选出其中RNA干扰效果佳的重组载体,通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞(转染组),以空载体组(转染空载体pSilencer3.1-H1质粒)和未转染组(未作任何处理)为对照.采用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检测转染前后HeLa细胞中DNMT1 mRNA和蛋白表达的变化,活细胞计数(CCK-8)法和双染法流式细胞术分别检测转染前后HeLa细胞增殖和凋亡的变化.结果 (1)酶切鉴定和测序分析证实,靶向DNMTI的3个shRNA重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒构建成功.RT-PCR技术筛选显示,重组载体pshRNA-DNMT1-B质粒的干扰效果佳.(2)RT-PCR技术检测显示,转染组转染24、48及72 h时HeLa细胞中DNMT1 mRNA的相对表达水平分别为0.406±0.057、0.191±0.036、0.104±0.015,明显低于空载体组和未转染组(分别为0.520±0.020、0.537±0.041,P＜0.05).蛋白印迹法检测显示,转染组转染24、48及72 h时细胞中DNMT1蛋白的相对表达水平分别为0.197±0.024、0.075±0.015、0.040±0.013,明显低于卒载体组和未转染组(分别为0.273±0.010、0.283±0.016,P＜0.05).(3)CCK-8法检测显示,转染组转染24、48、72、96、120 h时HeLa细胞存活率分别为70.8%、64.8%、51.6%、45.3%、38.0%,分别与空载体组和未转染组各时间点比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).双染法流式细胞术检测显示,转染组转染24、48及72 h时的细胞凋亡率分别为(17.7±1.3)%、(35.3±1.3)%、(47.6±1.6)%,明显高于空载体组及未转染组[分别为(4.9±0.5)%、(5.1±0.7)%,P＜0.05].结论 RNA干扰技术能成功沉默宫颈癌HeLa细胞中DNMT1基因的表达,通过下调DNMT1基因的表达可抑制宫颈癌细胞增殖、促进细胞凋亡.
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Bcrp1+表型子宫颈癌HeLa细胞侵袭及成瘤能力的研究
目的 通过对宫颈癌细胞系HeLa细胞中Bcrp1+表型细胞的侵袭和成瘤能力的研究,探讨Bcrp1成为宫颈癌干细胞表面标志物的可能性.方法 根据实验中所用HeLa细胞表型的不同分为两组,即Bcrp1+组和Bcrp1 -组,利用穿膜小室——boydon小室体外侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力；将不同细胞密度梯度(1×104、1×105、1×106个/ml)的Bcrp1+及Bcrp1-组细胞分别接种于6～8周龄非糖尿病-严重免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内,比较两组小鼠的体内成瘤情况,包括成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积及肿瘤质量.结果 体外侵袭实验显示,Bcrp1+组穿膜细胞数为(99± 14)个,侵袭深度为(366±52) μm,明显高于Bcrp1-组的(57±13)个和(301±54) μm,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).体内成瘤实验显示,接种细胞密度为1 ×104个/ml时,Bcrp1+ 组小鼠体内即可形成移植瘤；接种细胞密度为1×105和1×106个/ml时,Bcrp1+组和Bcrp1-组小鼠体内均可形成移植瘤；与Bcrp1-组小鼠比较,Bcrp1+组小鼠接种相应细胞密度的成瘤时间早、成瘤率高、肿瘤体积和肿瘤质量大,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Bcrp1+表型的HeLa细胞与Bcrp1-表型相比,具有较强的成瘤及侵袭能力,具备肿瘤干细胞的部分特征,其中可能富集了宫颈癌干细胞.
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槲皮素以及槲皮素联合顺铂对子宫颈癌细胞黏附、迁移和侵袭的影响
目的 探讨槲皮素以及槲皮素联合顺铂对宫颈癌细胞黏附、迁移和侵袭的影响.方法 以不同浓度(20、40、80 μmol/L)槲皮素以及槲皮素联合顺铂(10 μmol/L)处理宫颈癌细胞株HeLa细胞,采用细胞黏附实验、划痕实验和穿膜小室侵袭实验分别检测处理前后HeLa细胞黏附率、迁移速度以及侵袭力(以穿膜细胞数表示)的变化.结果 不同浓度的槲皮素处理后,随着槲皮素浓度从20 μmol/L增加至80 μmol/L,细胞黏附率由(82.2±1.5)%降至(48.4±1.1)%;细胞迁移速度由(7.26±0.20)μm/h降至(3.78±0.64)μm/h;穿膜细胞数由(124.3±1.5)个降至(90.7±2.1)个,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).顺铂联合槲皮素处理后,随着槲皮素浓度从20 μmol/L增加至80 μmol/L,细胞黏附率由(42.6±1.2)%降至(27.5±1.7)%;细胞迁移速度由(2.20±0.33) μm/h降至(0.72±0.19) μm/h;穿膜细胞数由(78.7±2.5)个降至(44.0±4.0)个,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).槲皮素联合顺铂处理后对HeLa细胞黏附、迁移和侵袭的抑制作用明显强于单纯槲皮素处理者(P<0.05).结论 槲皮素以及槲皮素联合顺铂能抑制HeLa细胞黏附、迁移及侵袭,槲皮素能增强顺铂对HeLa细胞黏附、迁移及侵袭的抑制作用.
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小分子干扰RNA对子宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒18型E6、E7mRNA表达的影响
目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)对宫颈癌细胞系HeLa细胞中人乳头状瘤病毒(HPV)18型E6、E7 mRNA表达的干扰作用.方法采用体外转录方法合成HPV18E6、E7 siRNA,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定HeLa细胞活性[以吸光度(A)值表示],筛选出适宜转染浓度.通过阳离子脂质体将HPV18E6、E7 siRNA转染入靶细胞HeLa细胞中.实验分为3组,E6转染组(转染HPV18E6 siRNA),E7转染组(转染HPV18E7 siRNA),设未转染细胞为对照组.RT-PCR技术分别检测转染24、48、72 h后HeLa细胞中HPV18E6、E7 mRNA的表达.流式细胞仪检测细胞周期.结果MTT比色法检测结果显示,HPV18E6、E7 siRNA的适宜转染浓度为20 pmol/L,以此浓度HPV18E6、E7 siRNA转染后,E6转染组细胞活性为0.57±0.05,E7转染组细胞活性为0.62±0.04,分别与对照组的0.87±0.05比较,差异有统计学意义(P<0.05).E6转染组转染前HPV18E6 mRNA表达水平为0.63±0.04,转染后24、48、72 h,其表达水平分别为0.53±0.04、0.46±0.02、0.56±0.03;E7转染组转染前HPV18E7 mRNA的表达水平为0.66±0.03,转染后分别为0.60±0.05、0.52±0.04、0.59±0.02,E6、E7转染组各转染时间点分别与其转染前比较,差异均有统计学意义(P< 0.05).E6转染组S期细胞比例低为(0±5.5)%,G2期细胞高为(66.9±3.5)%;E7转染组S期细胞比例低为(5.6±4.2)%,G2期细胞高为(47.2±0.5)%,E6、E7转染组各细胞周期分别与对照组[S期细胞为(39.4±0.4)%,G2期细胞为(1.4±1.2)%]比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论宫颈癌HeLa细胞中存在RNA干扰现象,对外源性HPV18E6、E7 siRNA的干扰具有特异性.
