SARS-CoV 核衣壳蛋白表达方法的研究进展

2012年引起中东呼吸综合征的新型冠状病毒 hCoV-EMC，与2003年引起广东暴发性流行的严重急性呼吸综合征的 SARS-CoV 同属于β群冠状病毒，两种病毒存在许多相似之处［1-2］。研究表明 SARS-CoV 核衣壳蛋白（SARS-CoV N 蛋白）可诱导产生强烈的体液和细胞免疫，是主要的抗原分子［3］和临床诊断的佳靶标［4］。获得重组 SARS-CoV N 蛋白，是进一步研究 SARS-CoV、hCoV-EMC 以及其他可能出现的新型人冠状病毒 N 蛋白之间关系的前提。本文将目前研究SARS-CoV N 蛋白的重组表达体系、表达蛋白的特性及存在问题等进行了综述。

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的:用分段表达纯化的SARS冠状病毒(SARS-CoV)的核衣壳蛋白(nucleocapsid N蛋白)制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体(McAb),初步定位单克隆抗体识别表位所在区域.方法:用分段表达纯化的SARS-CoV的、N蛋白(分别记为N1蛋白、N2蛋白)分别免疫Balb/c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析.结果:筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价105以上;亲和常数达108以上.Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoV N蛋白发生特异性反应.ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位.结论:通过分段表达纯化的SARS-CoV N蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端(1～549bp),N2单抗识别N蛋白C端(496～1269bp),可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域.

SARS冠状病毒N蛋白的真核细胞定位研究

目的:为进一步探讨SARS-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)在病毒复制及细胞通路中的作用,观察了核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.方法:应用核定位序列分析软件分析N蛋白序列,找出其中的核定位信号序列;构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SARS-CoV不同长度核衣壳蛋白区段融合表达的pEGFP-C1重组载体,对293细胞进行瞬时转染,在荧光显微镜下观察核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.结果:不同的核定位信号分析软件分析的结果不同,Prosite找到的核定位信号位于N蛋白第373-389或374-390aa,而PredictNLS server找到的核定位信号位于N蛋白第36-44aa;全长核衣壳蛋白及第161-422aa区段均定位于细胞质,第1-187aa区段定位于细胞质和细胞核.结论:SARS-CoV核衣壳蛋白的核定位信号可能位于N蛋白第36-44aa.

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及单克隆抗体制备

目的 获得原核表达的PRRSV N蛋白,并制备N蛋白的单克隆抗体.方法 将已构建的含有PRRSV N蛋白基因的重组表达载体阳性菌,在37℃条件下,用终浓度l mmol/L的IPTG诱导表达4h.经SDS-PAGE分析,表明N基因在大肠杆菌中得到了高效表达.经镍柱亲和层析纯化,以此蛋白作为抗原采用长程免疫法免疫Balb/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合.结果 获得了纯度较高、免疫学活性较好的N蛋白,细胞融合率为81.3％.建立间接ELISA,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体.初检阳性率为17.3％,经2次亚克隆反复筛选获得了2株分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株,命名为4G10和2F9.ELISA证实所获得的单抗是特异性针对PRRSV共同的抗原表位,4G10和2F9经反复冻存、复苏及多次传代,仍能分泌高效价抗体.结论 成功制备出高效价的抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体,为建立一种快速、特异的PRRSV检测方法奠定了基础.

重组冠状病毒核衣壳蛋白血清抗体检测

目的SARS冠状病毒的核衣壳(Nucleocapsid)蛋白(N蛋白)是病毒的主要结构抗原,重组N蛋白可用作抗原检测患者血清中相应抗体.方法以纯化的目的蛋白N-1,N-2分别包被96孔板,检测正常人群及患者血清中抗SARS病毒抗体.结果检测SARS感染患者血清,N-1阳性检出率为55.68%,N-2阳性检出率为56.82%,与华大基因试剂盒相比符合率分别为90.12%和87.65%.结论重组核衣壳蛋白可做为检测SARS抗体的抗原蛋白.

施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其特性分析

目的 制备施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(mAb)并分析其特性.方法 将SBV N基因分别构建至pET-28a-c(+)和pMAL-c5X载体中,在大肠杆菌中诱导表达带组氨酸标签的融合蛋白His-SBV-N和带麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的融合蛋白MBP-SBV-N,分别用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)树脂和直链淀粉树脂纯化两种蛋白;用纯化的His-SBV-N免疫BALB/c小鼠制备mAb,以MBP-SBV-N为包被抗原间接ELISA筛选分泌mAb的杂交瘤细胞和测定mAb效价,利用蛋白G琼脂糖凝胶从腹水中纯化mAb;应用Western blot和间接免疫荧光分析mAb的反应性和特异性.结果 筛选并纯化出1株抗SBV的mAb(命名为1F2),效价为1∶32 000,重链亚型为IgG2α,轻链为κ;1F2既能与重组SBV N蛋白发生反应,又能识别SBV,但与布尼亚病毒科内亲缘关系较近的沙门达病毒、道格拉斯病毒和赤羽病病毒的N蛋白存在交叉反应,而与裂谷热病毒N蛋白无交叉反应.结论 成功制备了抗SBV核衣壳蛋白的mAb,为SBV的血清学检测提供了工具.

诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

目的:建立能稳定分泌抗诺如病毒(Norovirus)N蛋白的单克隆抗体(mAb)细胞株, 制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb, 为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料.方法:用E.coli表达的GⅡ组广州株NVgz01(DQ369797)Norovirus-N蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 使用HAT选择性培养基培养融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对.结果:通过细胞融合和克隆化, 共筛选出4株分泌抗Norovirus-N蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9.间接ELISA和Western blot检测结果表明, 这4株mAb都可以与E.coli表达的GⅡ组广州株Norovirus-N蛋白产生特异性反应, 并且能与天然粪便标本中的GⅡ组Norovirus产生特异性反应.配对结果显示N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度.结论:获得了诺如病毒GⅡ组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础.

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白), 并以表达产物为免疫原制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 采用RT-PCR方法, 从灭活的病毒抗原标本中扩增编码N蛋白的基因.测序确认后, 再亚克隆至原核表达载体中.从SDS-PAGE凝胶中回收原核表达产物后免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 从标本中扩增出1 269 bp的DNA, 测序结果证实为N蛋白基因. 将该基因克隆至原核表达载体中后, 在大肠杆菌中获得了较好的表达.表达产物经SDS-PAGE后, 在Mr约为43 000处可见1条明显的诱导表达带.Western blot的结果表明, 该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异的免疫反应.从SDS-PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠, 制备出3株抗N蛋白的mAb.这些mAb与SDS-PAGE凝胶上Mr约为43 000的蛋白带也呈现很强的免疫反应.结论: 所获的重组N蛋白及特异性mAb, 将为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的方法奠定了基础.

汉滩病毒核蛋白羧基端多肽真核表达载体的构建及其表达产物的鉴定

目的探讨汉滩病毒(HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性,为建立分型检测方法奠定基础.方法设计并合成S基因编码区及其3端825 bp片段引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出目的片段,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,并通过脂质体转染至Vero细胞中进行瞬时表达,表达产物用间接免疫荧光法进行鉴定.结果成功构建了pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-C真核表达载体,间接免疫荧光法可检测到真核表达质粒转染的Vero细胞表达的核蛋白羧基端多肽.结论 pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-C真核表达载体有较高的转染效率,能在宿主细胞中表达,为制备分型用核蛋白多肽抗原打下了基础.

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

汉滩病毒核衣壳蛋白C-端T细胞表位鉴定

汉滩病毒核衣壳蛋白主要B细胞表位的识别及其基因定位

汉坦病毒糖蛋白的结构及功能研究进展

汉坦病毒感染人类可导致肾综合征出血热和汉坦病毒肺综合征,其包膜糖蛋白(GP)是重要的结构蛋白,本文就汉坦病毒糖蛋白的结构和功能的研究进展作一综述.

SARS冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白N(nucleocapsid protein)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)的制备及鉴定.方法:用基因重组的SARS-CoV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备McAb,并采用间接ELISA、免疫印迹法进行筛选和鉴定.结果:筛选出2株抗SARS-CoV N蛋白McAb杂交瘤细胞株,间接ELISA证实这组单克隆抗体仅与SARS-CoV产生特异性反应,而与其他病原体无交叉反应,IgG亚类鉴定1株为IgG1,另1株为IgG2b.2株抗体亲和常数分别为4.14×10-9和3.19×10-9.结论:获得特异性针对SARS-CoV的单克隆抗体,为SARS-CoV早期诊断试剂的研制奠定了基础.

HBOV病毒VP1蛋白的重组表达及在感染检测中的应用

[目的]建立检测HBOV感染的免疫学检测方法和进行儿童人群中感染调查.[方法]采用PCR扩增克隆HBOV病毒VP1核衣壳蛋白部分基因,将其基因克隆至PET32a,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中以包涵体形式获得表达.诱导表达后采用凝胶电泳切胶纯化目的蛋白.用重组蛋白作包被抗原建立了间接酶联免疫检测方法.[结果]病人血清及献血员血清均以1:50稀释,经检测北京和深圳的85份标本,阳性6人,阳性率7.06%,而正常献血员150人均为阴性,人群中感染率较低.[结论]成功重组表达了VP1蛋白,建立了检测抗体的ELISA方法.国内存在该病毒感染,被调查的人群中HBOV感染率较低.

重组核衣壳蛋白免疫滴金检测肾综合征出血热抗体差异的研究

目的 比较重组核蛋白抗原制备的胶体金免疫试剂盒与病毒悬液抗原制备的胶体金免疫试剂盒在检测肾综合征出血热特异性抗体的差异.方法 以汉坦76-118病毒M14626株S片段为模板,克隆334bp片段,重组表达核衣壳蛋白,以此蛋白作为抗原,制备胶体金试剂盒,与以病毒悬液为抗原的胶体金试剂盒进行平行检测300例肾综合症出血热血清IgM和IgG抗体.并与酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光法(IFA)对比检测.结果 成功构建了重组核蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-S,获得高纯度的抗原,分子量约12kD,以此蛋白为抗原制备胶体金试剂盒.检测300例HFRS病人血清抗HFRS IgM, rNP CGIDA阳性检出率为90.7%,后者高于前者,差异有显著性(x2=32.9,P＜0.05).用rNP与天然NP平行检测蛋白表达法HFRS IgM 76.3%,HFRS IgG 84.2%;细胞培养法HFRS IgM 86.8%, HFRS IgG 92.1%.HFRS IgM符合率达89.7%,HFRS IgG符合率达92.3%;CGIDA法检测HFRS IgM的敏感性为75.O%,特异性为100%;CGIDA法检测HFRS IgG的敏感性为83.1%,特异性为100%.结论 该重组核蛋白的CGIDA对HFRS的早期诊断具有较好的应用价值.但是敏感性及特异性均低于细胞培养法的CGIDA.