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重组汉坦病毒核衣壳蛋白抗原用于胶体金标记免疫层析法检测肾综合征出血热抗体
目的 制备高表达量、高活性的HV NP重组抗原,以此为基础建立一个可同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体的快速胶体金标记诊断试剂盒.方法 从TA-A537中扩增出截短的HV S基因片段p6-119,定向克隆至原核表达载体pET-30a中进行原核表达,采用亲和层析法纯化重组蛋白.以胶体金标记重组抗原,应用金标快速免疫层析法同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体.结果 金标快速免疫层析法可同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体,与IFA比较,IgG抗体检测的敏感性和特异性分别为94.9%、100%.与ELISA比较,IgM抗体检测的敏感性和特异性均为100%.结论 截短的重组汉坦病毒NP蛋白表达量高且具有良好的抗原性.以此为基础建立的金标快速免疫层析法显示出很高的敏感性和特异性,且具有简便、快速等优点,非常适用于各种层次尤其是缺乏实验条件和专业人员的基层医疗单位对HFRS疑似患者作出早期诊断.
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我国疫区HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性CTL克隆的建立
目的探讨汉滩病毒核衣壳蛋白(HTNV-NP)诱生的特异性细胞免疫的分子基础,阐明HFRS的发病机理. 方法分离HFRS患者的PBMC,建立HTNV-NP特异性的CTL克隆,同时将克隆有HTNV S基因不同片段的真核表达载体转染患者自身的B淋巴母细胞系(BLCL),建立CTL靶细胞系,并进行细胞杀伤试验. 结果建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应,平均杀伤率分别为50.2%、39.0%和25.4%. 结论 HTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端.
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中东呼吸综合征冠状病毒N蛋白的原核表达、纯化和鉴定
目的：对中东呼吸综合征冠状病毒（ middle east respiratory syndrome coronavirus， MERS-CoV）的核衣壳蛋白（ nucleocapsid，N）进行原核表达、纯化和鉴定，了解其免疫原性。方法通过人工合成N基因，构建重组质粒pET30a-MERS-CoV-N，然后转化E．coli BL21（DE3），利用 IPTG进行诱导表达，并优化确定表达条件；采用镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。结果原核表达成功并纯化获得与预期大小（46×103）一致的高纯度可溶性N蛋白。 Western blot表明重组蛋白可与免疫阳性兔血清及His标签抗体发生特异性反应，但与北京地区2008年收集的30份成人血清无反应。结论 MERS-CoV的N蛋白成功在原核系统中实现表达并纯化、鉴定，为MERS-CoV的免疫学诊断和免疫原性研究奠定了基础。
关键词： 中东呼吸综合征冠状病毒 核衣壳蛋白 原核表达 纯化 鉴定 -
SARS病毒核衣壳蛋白抗体消长规律
研究SARS病毒抗体的消长规律对于评价患者的愈后及SARS疫苗的使用效果具有重要意义.本项目选用了军事医学科学院生物工程研究所研制的双抗原夹心SARS N蛋白抗体ELISA诊断试剂.对279例临床确诊的、发病不同时间SARS患者的血清进行检测,并同时跟踪检测了41例SARS患者在不同发病时间(发病3 d至160 d)的血清标本,对抗体产生的时间规律进行了研究.
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乙肝病毒表面抗原基因启动子Ⅱ的结构及调节研究
0引言乙型肝炎病毒(HBV)为含有一段单股区的双链环状DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科,其基因组结构紧密,可分为结构基因序列和调节基因序列两部分,二者可具有相互重叠的特点.HBV基因的负链核苷酸序列中,至少有4个开放读码框(open reading frame,ORF),包括编码外膜蛋白的S基因区,编码核衣壳蛋白的C基因区,编码聚合酶的P基因区和调节病毒基因转录水平的X基因区,4种ORF分别有各自的启动子.HBV的外膜蛋白能使病毒由感染的细胞分泌,并能附着和侵入新的细胞;同时其也是引起宿主保护性应答的免疫原表位[1-6].因此,作为指导S基因组RNA转录的SP启动子序列,在HBV的生活周期中,具有较为重要的作用.
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呼吸道合胞病毒感染及反义基因治疗的研究进展
一、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染及治疗现状1.RSV基因结构与蛋白功能:RSV属于副黏病毒科,肺炎病毒属,为非节段性单股负链RNA病毒,含有大约15 000个核苷酸,其基因顺序依次为:3'NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-(M2-1/M2-2)-L-5',共编码11个病毒蛋白[1,2],分别为:核衣壳蛋白N、磷蛋白P、多聚酶亚单位L、转录延长因子M2-1、黏附蛋白G、融合蛋白F、小疏水蛋白SH、非结构蛋白NS1和NS2、基质蛋白M和M2-2.
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密码子优化和蛋白加强免疫对SARS-CoV N基因重组质粒免疫原性的影响
目的:观察密码子优化的SARS-CoV N基因的重组质粒,以及DNA初始免疫-蛋白加强免疫方式诱导小鼠的体液免疫应答水平,探讨提高SARS-CoV DNA免疫原性的途径.方法:SARS-CoV BJ01株N基因和密码子优化N基因分别通过从病毒RNA中RT-PCR扩增和人工合成获得,并克隆至pVAX1载体.将重组质粒DNA以100 μg/只的剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,于第20天同剂量再免疫1次后,于第40天再用50 μg/只剂量的N蛋白加强免疫.每次免疫后于第10天采集血清,用ELISA检测血清中抗SARS-CoV N蛋白特异性抗体效价.同时设单纯重组质粒DNA免疫组和重组N蛋白免疫组作为对照.结果:密码子优化的N基因的重组质粒DNA免疫可诱导小鼠产生高水平体液免疫应答;而采用DNA初始免疫-N蛋白加强免疫的方式则可使抗体效价提高至少10倍.结论:密码子优化和DNA初始免疫-蛋白加强免疫这两种途径均可提高SARS-CoV N基因重组质粒DNA在小鼠中的体液免疫应答水平.
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HIV-1核衣壳蛋白NCp7的功能及其抑制剂研究进展
NCp7在HIV-1生活周期中多个步骤发挥重要的核酸分子伴侣作用.抑制NCp7的功能可阻断HIV-1复制.NCp7含有两个高度保守的锌指结构,对NCp7的功能起决定性作用.锌指结构突变将导致HIV-1丧失感染能力.NCp7抑制剂可望成为下一代不容易产生耐药突变的抗HIV-1药物.本文就NCp7抑制剂目前的研究进展作简略综述.
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抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其活性鉴定
目的 制备抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为研发3型副流感病毒新型诊断试剂提供基础.方法 利用重组克隆表达技术,获得可溶性的重组核衣壳蛋白;采用纯化的重组核衣壳蛋白免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人3型副流感病毒核衣壳单克隆抗体;采用ELISA及间接免疫荧光法筛选并鉴定可识别天然3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体.结果 获得9株分泌抗重组核衣壳蛋白的特异性单克隆抗体的细胞株,其中2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别天然的3型副流感病毒核衣壳蛋白.结论 利用重组核衣壳蛋白作为免疫原制备出了识别天然核衣壳蛋白的单克隆抗体,并且具有较高的反应性.
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汉坦病毒与机体干扰素免疫应答
汉坦病毒属(hantavirus,HV)是布尼亚病毒科的单负链RNA病毒,其基因组分为L、M、S 3个片段,分别编码病毒的RNA聚合酶(L)、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣壳蛋白(NP),病毒主要分为引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)的旧大陆汉坦病毒和引起汉坦病毒心肺综合征( hantavirus cardiopulmonary syndrome,HCPS)的新大陆汉坦病毒.前者主要包括汉坦病毒原型株汉坦病毒( HTNV)、汉城病毒(SEOV)、多布拉伐病毒(DOBV)和普马拉病毒(PUUV)等,后者主要包括辛诺柏病毒( SNV)、纽约病毒(NY-1V)和安第斯山病毒(ANDV)等.除了这些病毒之外,还有被认为是不引起人类明显疾病的图拉病毒(TULV)和希望山病毒(PHV)等.
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汉坦病毒糖蛋白及其在细胞融合中作用的研究进展
汉坦病毒(Hantavirus,HV)属于布尼亚病毒科分节段负链RNA病毒,基因组根据大小将其分为L、M、S.分别编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶、两种包膜糖蛋白Gn、Gc和一个非结构蛋白以及病毒的核衣壳蛋白.目前国内外至少有30个血清型/基因型,代表型别有汉滩病毒(Hantann virus,HTNV)、汉城病毒(Seoul virus,SEOV)、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus,SNV)、普马拉病毒(Puumala virus,PUUV)、希望山病毒(Prospect Hill virus,PHV)、多布拉伐-贝尔格莱德病毒(Dobrava-Belgrade virus,DOBV)、泰山病毒(Thailand virus,THAIV)等[1,2].
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汉坦病毒感染的血清学分型研究进展
汉坦病毒(HV)属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus),为分节段的单股负链RNA病毒,病毒基因组有3个片段组成,大(L)片段(6.5kb)编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶,中(M)片段(3.6kb)编码病毒糖蛋白G1和G2的前体糖蛋白,小(S)(1.7～2.0kb)编码病毒的核衣壳蛋白(NP)[1].
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SARS-CoV、229E和OC43的抗原相关性研究
目的:分析SARS冠状病毒(SARS-CoV)和人冠状病毒(229E和OC43)的抗原相关性.方法:制备三株冠状病毒的免疫兔血清及其重组核衣壳(N)蛋白的免疫小鼠血清,分别采用ELISA法、Western blot和免疫荧光法对免疫血清进行检测以分析三株冠状病毒的抗原相关性.结果:Western blot结果显示重组N蛋白免疫小鼠血清仅与各自的冠状病毒或重组N蛋白有特异性反应,相互间无交叉反应,而ELISA结果显示OC43重组N蛋白免疫小鼠血清与SARS-CoV、229E N蛋白出现了构象抗体的交叉反应.同时,免疫荧光结果显示SARS-CoV和OC43免疫兔血清与229E感染细胞存在较明显的交叉反应,但在ELISA、Western blot结果中全病毒免疫兔血清均仅与各自N蛋白特异性反应,相互间无交叉反应.结论:SARS-CoV、229E和OC43 N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应,而SARS-CoV、OC43全病毒免疫血清均和229E出现明显的交叉反应.另外,基因重组的OC43 N蛋白与另外二种N蛋白出现重组构形表位的交叉反应,提示以基因重组的蛋白作为诊断试剂,可能会因为蛋白的空间构象发生改变而产生非特异性反应.
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SASR-CoV核衣壳蛋白在杆状病毒-昆虫系统的克隆表达及抗原性分析
目的：SARS冠状病毒（ SARS-CoV）核衣壳蛋白（ N蛋白）在杆状病毒-昆虫系统的表达，研究其抗原性。方法：利用PCR方法扩增SARS-NP全长基因，使用BamHⅠ和Sal Ⅰ限制性内切酶定向插入Bac-to-Bac系统的pFastBac HTC载体，构建重组质粒转化DH10 Bac细胞，获得重组杆粒DNA后转染Sf9细胞，在High Five细胞中表达SARS-NP；表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化及免疫印迹和ELISA方法验证抗原性。结果：成功构建pFastBac HTC-SARS-NP重组质粒，并在High Five细胞高效表达，获得相对分子量约48 kD的重组蛋白质。经验证，重组蛋白能被SARS-CoV NP的特异性单抗（8E1A17）和兔免疫血清识别，能与SARS患者血清反应，与健康人血清、人冠状病毒229 E型和OC43型的杂交瘤培养上清、相对应的兔免疫血清、患者血清均无交叉反应，具良好抗原反应性。结论：SARS-NP成功表达于杆状病毒-昆虫系统，具较强抗原反应性，初步认为其与229 E型和OC43型感染血清无交叉反应性。
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SARS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化
目的在大肠杆菌中高效表达SARS核衣壳蛋白.方法将已合成的SARS-CoV N蛋白基因片段,克隆至pUG18载体,与pET28质粒连接,转化大肠杆菌,进行SARS-CoV核衣壳融合蛋白表达.用SARS患者恢复期血清进行表达产物鉴定.用色谱方法进行表达产物的层析纯化.结果SARS病毒N基因在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的30%以上;经三步纯化后纯度达90%以上.结论已获得了SARS核衣壳蛋白样品.
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副流感病毒5型CC-14株辅助质粒的构建及鉴定
目的 构建副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)CC-14株核衣壳蛋白(nucleoprotein,NP)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和聚合酶蛋白(large protein,L)基因真核表达质粒,并在MDCK细胞中表达,为该病毒反向遗传系统的建立奠定基础.方法 根据PIV5 CC-14株全基因组中的NP、P和L基因分别设计特异性引物,经RT-PCR扩增得到NP、P和L基因,酶切后分别连接至pcDNA3.1+真核表达载体(或pMD18-T)上,构建辅助质粒pcDNA3.I-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.I-L,转染MDCK细胞,RT-PCR检测NP、P和DL基因的转录情况.结果 经双酶切及测序鉴定证明辅助质粒pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L构建正确,3个质粒转染MDCK细胞后,经RT-PCR分别可扩增得到NP、P和DL基因片段.结论 成功构建了PIV5 CC-14株pcDNA3.1-NP、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L辅助质粒,且均可在MDCK细胞中有效转录,为该病毒反向遗传系统的建立奠定了基础.
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汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴定
汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)的主要病毒,汉坦病毒的基因由 L、M、S 三个片段构成,分别编码病毒RNA聚合酶, 囊膜核蛋白G1和G2及核衣壳蛋白(简称核蛋白,Nucleocapsid Protein, NP).
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鼠冠状病毒核衣壳蛋白的抗体制备与抗原决定簇分析
核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白有稳定病毒基因组、调控病毒复制及细胞状态的特殊作用.鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus,MHV)为乙型冠状病毒属的原型病毒,是研究冠状病毒N蛋白功能的经典模型.本研究用去污剂处理鼠冠状病毒粒子暴露N蛋白,另用原核表达纯化的重组N蛋白分别免疫小鼠,制备多克隆及单克隆抗体.酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白免疫印迹分析结果显示两类抗体均具有高灵敏度和特异度,与甲型冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的N蛋白无交叉反应.原核表达缺失突变的N蛋白分析结果显示,多克隆抗体与单克隆抗体2E6识别的鼠冠状病毒N蛋白抗原决定簇完全一致,位于N端结构域(N-terminal domain,NTD)C端与SR之间的58个氨基酸残基内.此外,基于单克隆抗体2E6的ELISA及免疫荧光法能检测到感染细胞中和培养上清液中的N蛋白组分,且其含量与病毒复制的滴度一致.这些结果表明,鼠冠状病毒复制过程中粒子与细胞中的N蛋白可能维持相似的结构,使NTD与SR之间的部分氨基酸残基一直暴露在表面,从而形成了优势抗原决定簇.
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HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性CTL克隆的建立及其初步研究
为探讨汉滩病毒核衣壳蛋白(HTNV-NP)诱生的特异性细胞免疫的分子基础,为阐明HFRS的发病机制和疫苗的设计提供资料,本文分离HFRS患者的PBMC,建立HTNV-NP特异性的CTL克隆,同时将克隆有HTNV S基因不同片段的真核表达载体转染患者自身的B淋巴母细胞系(BLCL),建立CTL靶细胞系,并进行细胞杀伤试验.建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应,平均杀伤率分别为50.2%、39.0%和25.8%.表明HTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端.
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麻疹病毒受体信号淋巴细胞激活分子的研究近况
麻疹病毒(MV)为副黏液病毒科,出疹病毒属,直径100～150 nm,病毒核心为负链单股RNA和3种核衣壳蛋白(L、P、N蛋白)组成的核壳体,外层为一含脂质双层的包膜,表面有细小的糖蛋白突起.外膜中的蛋白成分主要有膜蛋白(M蛋白)、血凝素(H蛋白)和融合蛋白(F蛋白).
