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VSV-G蛋白修饰的GFP逆转录病毒的构建及表达
目的 通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)共转染,使含绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒经超速离心得以浓缩,进一步提高GFP逆转录病毒的细胞感染效率.方法 应用GFP-RV质粒转染PT67细胞,并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因.收集该GP2-293细胞产生的重组假病毒液,并通过低温超速离心制备含GFP基因假病毒的浓缩液,测定浓缩前后含GFP基因假病毒液滴度,并分别感染NIH 3T3细胞、软骨细胞、成纤维细胞、骨髓基质干细胞等,荧光显微镜下观察GFP在上述细胞内的表达情况,流式细胞仪检测GFP基因的转染阳性表达率.结果 GFP-GP2-293细胞转染VSV-G基因后产生的重组假病毒液滴度为7.36×104 CFU/mL,浓缩40倍后其滴度可提高至1.82×106 CFU/mL.用浓缩前后含GFP基因假病毒液分别转染NIH 3T3细胞,GFP阳性表达率可由44.21%升高至79.80%;转染兔软骨细胞和成纤维细胞、猪骨髓基质干细胞和脂肪干细胞后,均可见GFP阳性表达明显增强.结论 逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以制备出高滴度的假病毒液.浓缩病毒液的高转染率为其在组织工程种子细胞标记方面的广泛应用奠定了基础.
关键词： 疱疹性口腔炎病毒糖蛋白 绿色荧光蛋白 转染 假病毒 种子细胞 -
含GFP基因的逆转录病毒与VSV-G蛋白重组形成高滴度假病毒
目的通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组,提高含绿色荧光蛋白(GFP)基因逆转录病毒的感染效率,并使其经受超速离心以达到进一步浓缩.方法应用GFP-RV质粒转染PT67细胞并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因.收集该GP2-293细胞产生的重组病毒作滴度测定,并通过低温超速离心制成含GFP病毒的浓缩液,再感染NIH3T3细胞,观察GFP在NIH3T3细胞内的表达情况.结果 GFP-RV质粒转染PT67细胞产生的GFP阳性克隆,随着细胞传代过程,GFP的表达逐渐减弱.GP2-293细胞转染VSV-G 基因后可产生(7.5±1.4)×l05cfu/mL的GFP重组假病毒,将其浓缩液转染NIH3T3细胞,可见GFP在细胞内有较强的表达.结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以形成高滴度的假病毒,由此得到含GFP基因的病毒上清液,其在组织工程中应用范围更广泛.
关键词： 疱疹性口腔炎病毒糖蛋白 绿色荧光蛋白 转染 假病毒 -
来源于马尾树树皮的化合物蜡果杨梅酸B抑制HIV进入的机制研究
目的 利用假病毒技术,研究来源于马尾树树皮的化合物蜡果杨梅酸B抑制HIV-1进入的活性及作用机制.方法 利用pHXB2和pVSV-G两个病毒包膜蛋白质粒,与pNL4-3.Luc.R-E-共转染,构建HIV-1 Env假病毒和VSV-G假病毒,检测化合物抑制假病毒感染的活性.采用针对包膜蛋白亚基gp41的ELISA方法,结合分子对接,研究活性化合物抗HIV-1的作用机制.结果 从马尾树树皮中来源的2个三萜类单体化合物蜡果杨梅酸B(myriceric acid B)和蜡果杨梅酸C(myriceric acid C)中,仅蜡果杨梅酸B能特异性地抑制HIV-1 Env假病毒感染,其半数抑制浓度(IC_(50))值为(8.3±0.2) mg·L~(-1).此外,蜡果杨梅酸B在C-28位羧基的酯化产物蜡果杨梅酸B甲酯(myriceric acid B methyl ester)没有抑制HIV-1进入的活性.蜡果杨梅酸B的进入抑制活性与其抑制gp41六螺旋束结构形成的机制有关.分子对接表明,蜡果杨梅酸B能靶向gp41上N-螺旋三聚体的靶穴位置.结论 蜡果杨梅酸B是作用于gp41的HIV-1进入抑制剂,其分子结构中C-28位的羧基及C-3位羟基与抑制活性密切相关.蜡果杨梅酸B可作为先导化合物来研发新的HIV进入抑制剂类抗艾滋病药物.
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HIV-1衣壳蛋白抑制剂体外筛选方法研究进展
HIV-1的感染高度依赖其圆锥形的"富勒烯"型衣壳.衣壳由大约1500个衣壳蛋白组装而成.近年来,衣壳蛋白已成为设计和筛选抗HIV-1药物的理想靶点.目前,文献已报道了多种基于不同原理的HIV-1衣壳蛋白抑制剂的筛选方法,该文将对这些体外筛选方法进行综述.
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哈尔滨市儿童肠道病毒71型中和抗体水平调查研究
目的 了解哈尔滨市0岁～ 14岁不同人群儿童肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中和抗体(neutralizing antibody,NA)水平,为防控EV71引起的手足口病流行提供科学依据,为手足口病疫苗效果评价提供基础数据.方法 选取哈尔滨市4家医院作为样品采集点,采集临床排除手足口病者的样本413份,应用假病毒系统检测样本EV71中和抗体滴度,样本率的比较用x2检验.结果 413份样本EV71中和抗体阳性率为37.05％;不同性别、时间EV71阳性率差异均无统计学意义(P＞o.05);不同年龄组儿童EV71阳性率不同,差异有统计学意义(x2=19.63,P＜0.05).其中≤6个月组EV71中和抗体阳性率高,为68.00％;7个月～12个月组EV71中和抗体阳性率低,为20.83％.结论 中和抗体较低的人群及时间点为手足口病防治的重点.
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多亚型手足口病假病毒中和抗体检测平台的应用研究
目的 应用多亚型手足口病假病毒中和抗体检测平台检测不同肠道病毒感染患者的血清中和抗体水平,为确定应用新的基于假病毒技术来诊断人体是否感染EV71或CVA16提供基础数据.方法 98份样本应用包装的EV71的B1、B2、C1、C2、C2-like、C4b和CVA16的B1a7种假病毒感染RD细胞,根据细胞中报告luciferase基因表达量确定血清中和抗体水平的强弱.结果 单EV71阳性样本倾向于与EV71的B1、C1、C2-like、C4b亚型假病毒进行中和,单CVA16阳性样本倾向于与CVA16-B1a假病毒进行中和,而对于EV71的B2、C2亚型假病毒也具有一定的中和活性;EV71与CVA16均为阳性样本,对于EV71和CVA16所有亚型的假病毒都表现出了很强的中和活性;单EV71和单CVA16阳性样本中和抗体随病程变化情况显示,在第7d～9d达到峰值.结论 通过EV71和CVA16假病毒建立了基于假病毒的中和抗体检测技术,该技术可应用于手足口病病毒的临床诊断,适用于高通量检测.
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整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒
本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定.将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定.将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性.本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法.
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逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验
利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明HCV ele2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,经FACS分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗HCVE1E2蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合.
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CCR5△32及CCR5siRNA修饰的人外周血来源的PBMC细胞对HIV-1假病毒的拮抗作用
目的 研究CCR5△32及CCR5 siRNA修饰的PBMC细胞对HIV-1假病毒的拮抗作用.方法 将CCR5△32和CCR5siRNA的基因连接到腺病毒载体上,用磷酸钙法将其转入人源性PBMC,Westernblot检测CCR5△32稳定表达情况以及CCR5siRNA对CCR5的抑制情况.构建HIV-1假病毒,检测荧光素酶报告基因的活性,判断病毒的感染情况.结果 CCR5△32在PBMC细胞上获得稳定表达,CCR5siRNA抑制PBMC细胞中CCR5的表达;修饰后的PBMC细胞并不能被HIV-1假病毒感染.结论 修饰后的PBMC细胞具有较好的拮抗HIV-1假病毒感染的作用.
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日本蛇菰中咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制HIV-1进入的机制
目的 研究从日本蛇菰中分离的咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制HTV-1进入的作用机制.方法 利用HTV-1假病毒体系,并结合针对gp41包膜蛋白的ELISA以及分子对接方法,对日本蛇菰分离的咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制HIV-1进入机制进行研究.结果 我们首先用HIV-1 Env假病毒来检测六个咖啡酰基葡萄糖类化合物(终浓度:25μg·ml-1)的抑制活性.发现1,2,6-三-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖(TCGP)和1,3-双-O-咖啡酰基-4-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖(DCGGP)具有较好的抑制病毒进入靶细胞的作用.进一步量效关系研究表明,两个化合物的病毒抑制活性呈剂量依赖性,它们的IC50值分别是(5.5±0.2)和(5.3±0.1)μg·ml-1.这两个化合物的抑制活性与其抑制gp41六螺旋束结构形成的机制有关.分子对接表明,它们均能靶向gp41上N-螺旋三聚体的靶穴位置.结论 1,2,6-三-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖(TCGP)和1,3-双-O-咖啡酰基-4-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖(DCGGP)可以较好的抑制HIV-1 Env假病毒感染靶细胞,可作为先导化合物来研发抗HIV-1新药.
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广西HIV-1 B亚型假病毒的构建
目的 针对广西HIV-1 B亚型毒株构建一种优化的假病毒耐药检测模型,为表型耐药检测提供成本较低、简便易行的研究工具.方法 从质粒pSV-EGFP中扩增出EGFP基因,采用双酶切法将EGFP基因克隆至骨架质粒pNL4-3.Luc.E-R-,以此构建假病毒重组骨架质粒;采用RT-PCR方法从HIV-1 B亚型慢性感染者RNA中获得包膜蛋白基因,采用双酶切法将env基因克隆至真核表达质粒pcDNATM3.1 (+),以此构建重组包膜质粒;单转染重组包膜质粒至293t细胞验证表达;共转染重组质粒至293t细胞获得假病毒;采用与TZM-b1细胞共培养法,通过荧光表达检测验证假病毒感染性.结果 两种质粒以质量比2:1(pcDNA3.1-env:pNL4-3.EGFP.E-R-)共转染至293t细胞,48 h后收集细胞上清获得假病毒.将假病毒加入到TZM-bl细胞共培养48 h后,可以观察到荧光表达.结论 带有EGFP基因重组假病毒的系统构建成功.
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具有广谱中和活性的HIV感染者血浆病毒膜蛋白基因及中和特征分析
目的 分析一例具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白(Env)基因序列特征及中和特征.方法 使用单拷贝基因组扩增(SGA)方法从患者两个随访时间点血浆样本扩增env基因,测序后进行序列比对和进化树构建,分析env基因特征;将env基因克隆至pcDNATM3.1载体上,env质粒和骨架质粒pSG3△env共转染293T细胞制备假病毒,使用假病毒分别和两个时间点的自体血浆及6种不同的广谱中和抗体进行中和试验,分析Env蛋白的中和特征.结果 从两个时间点血浆样本中共获得50个全长env基因,进化分析显示两个时间点序列各自聚集成簇,第1个时间点膜蛋白序列有较短的V1区和较少的V1区糖基化位点数目,第2个时间点膜蛋白序列有更高的基因多样性.自体血浆不能中和同时期的假病毒,但能中和前期的假病毒;两个时间点的假病毒对PGT121、PGT135、2G12和10E8抗体均高度敏感,但对V RC01及12A21抗体呈现中和抗性.结论 该具有广谱中和活性的慢性HIV感染者病毒膜蛋白基因持续进化;感染者体内存在CD4bs类中和抗体的免疫压力.
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HIV-1广谱中和活性感染者假病毒的中和表型分析
目的 分析HIV-1广谱中和活性感染者基于膜蛋白基因(env)的假病毒对自体血浆和代表性广谱单克隆中和抗体(bmNAbs)的中和表型.方法 单基因组扩增(SGA)广谱中和活性感染者第0月血浆的env基因并克隆至pcD-NATM3.1 Directional TOPO表达载体,将env表达质粒与HIV-1骨架质粒pSG3△env共转染293T/17细胞制备假病毒,用假病毒分别与自体连续时间点血浆和代表性bmNAbs进行中和实验分析中和表型.结果 共获得11株功能性假病毒,假病毒对8个连续时间点自体血浆的中和敏感性呈现先升高(第0～15月),后下降(第16～32月),之后再上升(第33～45月)的波动.所有假病毒对10E8、PGT121和VRC01中和敏感(IC50＜6 μg/mL);各有18.2％(2株)的假病毒对12A21和2G12高度敏感(IC50＜1μg/mL);所有病毒均对PGT135呈中和抗性.结论 假病毒对当前时间点血浆的中和敏感性低,对之后时间点血浆中和敏感性增强,提示感染者体内病毒与中和抗体的动态进化过程.同一时间点假病毒对特定bm-NAbs的敏感性差异明显,提示感染者准种毒株间中和表型的复杂性.
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HIV-1B'亚型及CRF07_BC重组毒株感染者中和反应特征分析
目的 探讨我国主要流行的HIV-1 B'和CRF07 BC重组毒株感染者中和反应特征.方法 采用基于Env假病毒的以表达CD4及CCR5/CXCR4的TZM-b1细胞系为靶细胞的中和抗体测定方法,测定40例感染时间在3年左右的HIV-1 CRF07_BC重组毒株感染者及31例感染时间在10年以上的HIV-1 B'亚型毒株感染者血浆对11株包括B(4株)、CRF07_BC(3株)、CRF01_AE(3株)及中和敏感毒株(1株)Env假病毒的中和反应,并分析感染者血浆的中和宽度和中和强度.结果 B'亚型毒株感染者在中和宽度及亚型交叉中和强度方面均高于感染时间相对较短的CRF07_BC重组毒株感染者,B'亚型感染者对CRF01_AE亚型病毒的中和活性显著高于CRF07_Bc重组型感染者;而CRF07_BC重组型感染者对同亚型病毒的中和强度则显著高于B'亚型感染者.结论 HIV-1感染者中和抗体宽度以及对异源病毒的中和活性与感染时间正相关.适度的病毒抗原刺激有助于广谱中和活性的产生.
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HIV-1功能性膜蛋白基因gp160的快速筛选和鉴定
目的 应用假病毒感染实验快速筛选可用于HIV-1中和抗体测定的功能性膜蛋白基因.方法 从HIV感染样品中扩增全长膜蛋白基因gp160,通过系统进化树分析确定其基因亚型,将HIV-1gp160阳性克隆与pSG3△Env质粒共转染293T细胞制备假病毒并对其感染能力进行分析,筛选功能性膜蛋白基因.结果 克隆和鉴定了我国HIV-1流行毒株的9个功能性膜蛋白基因,系统进化树分析表明其中包括4个CRF07_BC、2个CRF01_AE和3个B亚型毒株,这些gp160膜蛋白基因所制备的假病毒具有良好的感染性.结论 不同亚型HIV-1功能性膜蛋白gp160克隆为选择HIV-1中和抗体测定毒株提供了有价值的实验材料.
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HIV-1假病毒包装及感染条件优化
目的 对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)假病毒包装及感染条件进行优化,获得高重复性、高稳定性和高滴度的假病毒包装方法和较高的感染效率.方法 采用pSG3△env质粒与pcDNA3.1-SF162 rev/env质粒共转染 293T细胞包装病毒,对HIV假病毒骨架质粒与env真核表达质粒转染比例、转染试剂与质粒比例、假病毒收获时间对HIV假病毒包装滴度的影响进行实验,同时对感染过程中假病毒接种剂量与二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-Dextran) 使用浓度进行了优化.结果 在包装过程中当HIV假病毒骨架质粒与env真核表达质粒转染比例为4∶1、转染试剂与质粒比例为3∶1,转染后培养48 h HIV-1假病毒的滴度高;在假病毒感染过程中,15 μg/mL的DEAE-Dextran可有效增加假病毒的感染效率且不会对细胞造成较大毒性.结论 通过对包装和感染过程中关键条件的优化,可以有效提高HIV-1假病毒的包装和感染效率,增加实验技术稳定性,为新型抗艾滋病药物筛选和艾滋病疫苗评价等研究奠定了基础.
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人乳头瘤病毒假病毒体外感染模型的建立及人α防御素5抗病毒作用
目的 建立用人乳头瘤病毒16亚型假病毒(HPV-16 Psv)感染官颈癌细胞模型,并研究3种不同构型人α防御素5(HD-5)抗HPV的作用.方法 将表达HPV-16假病毒衣壳蛋白的重组质粒p16L1L2和含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒Pfwb共转染293FT细胞,分离、纯化病毒颗粒后感染官颈癌细胞株C-33a,同时分别给予20 μg/ml的HD-5/N(天然构型)、HD-5/Acm(半胱氨酸被Acm修饰)或HD-5/Abu(半胱氨酸被Abu替换)处理,培养48 h后荧光显微镜观察和流式细胞分析病毒感染率.结果 Pfwb与P16L1L2成功转染293FT细胞并获得滴度达2.5×108TU/ml的HPV-16假病毒液,镜检和流式细胞术检测显示官颈癌细胞C-33a能够被假病毒感染并表达GFP.HD-5/N、HD-5/Acm和HD-5/Abu对HPV-16感染C-33a细胞的抑制率分别为(96.48±5.67)％、(69.02±7.88)％和(2.71±1.53)％.与HD-5/N相比,HD-5/Acm和HD-5/Abu的抗病毒作用显著降低(P＜0.01).结论 建立了基于流式细胞分析的HPV-16假病毒感染模型并将其用于抗病毒药物活性检测.发现HD-5的空间结构和分子中半胱氨酸对其抗HPV感染的活性有重要作用.
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人16型乳头瘤病毒"假病毒"免疫保护作用的研究
目的 评价构建的人16型乳头瘤病毒"假病毒"的免疫保护作用.方法 利用杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中表达组装了人16型乳头瘤病毒病毒样颗粒,将病毒样颗粒解聚后与真核表达质粒混合,重聚集成"假病毒".用这种"假病毒"对小鼠进行免疫保护作用研究.结果 小鼠经"假病毒"免疫后,可以在血清中检测到特异性的IgG,在阴道分泌物中检测到特异性的IgA,脾淋巴细胞可以检测特异性的CTL活性.结论 "假病毒"免疫能激活机体的免疫反应
关键词： 人16型乳头瘤病毒 假病毒 IgG IgA 细胞毒T淋巴细胞反应 -
利用假病毒法检测重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗的免疫原性
目的 建立并验证重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗中和滴度的检测方法,并且利用此假病毒法进行免疫原性研究.方法 建立并优化以ZsGreen假病毒为基础的中和实验(ZsGreen法)测定血清中和滴度,比较荧光显微镜观察与微流式细胞分析法、流式细胞分析法的差异,并对专属性、精密度、耐用性、假病毒稳定性和不同细胞代次的影响进行了方法学验证.结果 ZsGreen法的HPV16/18假病毒佳接种量为1 600 TCID50,HPV16型与HPV18型无交叉,具有良好的专属性和精密度,采用不同细胞代次与不同批次假病毒进行检测,均能获得较好的重复性.结论 ZsGreen法假病毒中和滴度检测法准确可靠、重复性好,经方法学验证后此法适用于疫苗的免疫原性研究.
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抗HCV中和抗体的研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)为具包膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒家庭.HCV是已知惟一能造成慢性感染的RNA病毒(除逆转录病毒外),据估计,目前全球约1.7亿HCV感染者中,60%～80%为慢性携带者,而持续性感染终发展为肝硬化/肝癌的机率高达3.5%～20%.
