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人乳头状瘤假病毒中和抗体滴度和ELISA法测定的小鼠血清抗体滴度的相关性研究
目的 探讨两种不同的报告基因纽扣珊瑚绿色荧光蛋白(Zoanthus sp.green fluorescent protein,ZsGreen)和分泌性碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)测量的人乳头状瘤假病毒中和滴度之间的相关性,以及中和滴度和抗体滴度的相关性.方法 将密码子优化的人乳头状瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1、L2基因表达质粒和报告基因质粒共转染293FT细胞,48 h后收集细胞裂解上清,柱层析纯化假病毒,对假病毒滴度进行测定.采集免疫过候选HPV疫苗和Gardasil疫苗的小鼠血清,测量血清的中和滴度和抗体滴度.结果 经统计分析,这两种报告基因系统的假病毒检测的中和滴度结果高度相关(Spearman相关系数r=0.760),而且中和滴度和抗体滴度的相关度很高(Spearman相关系数r=0.577和0.741).结论 两种不同的报告基因ZsGreen和SEAP测量的HPV假病毒中和滴度之间,以及中和滴度和ELISA测定的抗体滴度之间高度相关,揭示了部分HPV疫苗预防病毒入侵的机制,为快速准确鉴定HPV-16和HPV-18候选疫苗的免疫保护效果奠定了基础.
关键词： 假病毒 纽扣珊瑚绿色荧光蛋白 分泌性碱性磷酸酶 中和抗体滴度 -
人乳头瘤病毒(HPV)L2肽免疫小鼠诱导的抗体水平与保护作用的关系研究
目的 检测HPV-58 L2 11～200 AA肽在动物体内对HPV的保护效果,并分析疫苗诱导的抗体滴度或中和抗体滴度与疫苗保护作用之间的对应关系.方法 利用大肠杆菌表达HPV-58L2 11～200 AA肽,纯化目的 蛋白并与铝佐剂吸附后免疫小鼠,利用小鼠HPV-58假病毒感染模型检测不同剂量的免疫原对小鼠的保护作用.通过ELISA和假病毒中和抗体检测方法 检测免疫血清中的总抗体水平和中和抗体水平,分析具有保护作用的抗体或中和抗体滴度.结果 当蛋白免疫剂量为8μg时,能够完全保护小鼠不受HPV假病毒的感染.小鼠免疫血清中的中和抗体水平较低,利用已建立的假病毒中和试验方法 检测不到血清中的中和抗体.而利用ELISA检测血清中的总抗体水平结果 显示,免疫血清中的总抗体水平与疫苗的保护效果之间存在对应关系,当抗体滴度大于等于1:25 000时,小鼠体内检测不到荧光信号,能够保护机体不受假病毒的感染.结论 HPV-58 L2 11～200 AA肽能够保护小鼠不受假病毒的感染,L2 11～200 AA肽具有较好的疫苗发展前景,其引发的总抗体水平可以作为评价保护效果的间接指标.
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H5N1禽流感假病毒体外中和试验技术平台的建立与应用
目的 建立H5N1禽流感假病毒的体外中和试验技术平台,并系统评价2份H5N1人禽流感患者恢复期血清的中和效价.方法 通过磷酸钙沉淀法将转移载体pHR-Luc、包装载体pCMV△8.2和包膜载体CMV/R-SZ(或CMV/R-TH)共转染人胚肾细胞(293T),72 h后收集假病毒上清液,免疫印迹(Western blot)鉴定假病毒颗粒HA、P24蛋白的表达,并取200μL假病毒上清液测定感染活性.收集制备假病毒过程中整合HA蛋白的293T细胞,通过流式细胞术测定2份恢复期血清中的HA抗体.利用2份恢复期血清分别与深圳株和泰国株假病毒进行中和试验,通过计算IC5o判断不同血清对2株假病毒中和效价的差异.结果 构建的2株假病毒颗粒不仅含有HIV基质蛋白P24,还可以整合HA蛋白,并且能够由前体蛋白HA0裂解为具有生物活性的HA1和HA2.200μL假病毒上清液感染靶细胞后RLA值约为2×104,具有较高的感染效价.FACS检测结果显示2份血清中均含有HA抗体,而且对不同分枝的假病毒具有交叉反应性.中和试验表明2份血清对深圳株和泰国株假病毒均具有中和能力,而且对不同分枝的假病毒具有交叉中和活性,但对深圳株的中和效价均高于泰国株.结论 本研究成功构建具有感染活性的深圳株和泰国株H5N1禽流感假病毒,并可以快速、安全、高效的评价血清的中和效价,具有广阔的应用前景.
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诱导表达人IFITM3的293细胞株的建立及其对H1N1型流感病毒侵染作用
目的 建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型.方法 构建IFITM3/pcDNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立H1N1型流感病毒假病毒评价系统,利用蛋白印迹(Western blot)和荧光素酶报告基因对筛选的诱导表达细胞株功能进行检测.结果 建立的293诱导表达细胞株能够很好表达目的蛋白,且诱导表达出来的IFITM3蛋白使H1N1型流感假病毒感染率下降97%(t=38.08、P<0.001),使水泡性口炎假病毒(VSVpp)感染率下降68%(t=54.56、P<0.001),而阴性对照组小鼠白血病假病毒(MLVpp)感染率(t=1.282、P=0.2208)和拉沙假病毒(LASVpp)感染率(t=0.4814、P=0.6377)无显著影响.结论 IFITM3蛋白诱导表达细胞株可以显著抑制H1N1型流感病毒感染,为进一步深入研究IFITM3抑制流感病毒感染的作用机制和分子机理提供了细胞模型和实验基础.
关键词： 干扰素诱导跨膜蛋白3 H1N1型流感病毒 假病毒 诱导表达 防御分子 -
HIV-1假病毒包装方法的探讨
目的：通过不同方案包装HIV-1假病毒，确定获得高重复性、高稳定性和高滴度假病毒的方法。方法从转染效率影响因素出发，通过不同的转染方案，利用pNL4-3 LucR-E-质粒与VSV-G质粒共转染293细胞包装病毒，分别于48 h和72 h收取假病毒并重新感染293细胞，48 h后测荧光素酶报告基因。结果成功包装出HIV-1假病毒，不同包装方案的病毒滴度不同，测得报告基因高接近107 RLUs。结论应用PEI转染试剂、大提质粒pNL4-3︰VSV-G为4︰1时，转染效率高，包装的假病毒滴度高。
关键词： 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 假病毒 包装方法 -
一例HIV-1急性感染者奠基病毒的gp160基因序列特征及其假病毒构建
目的 观察急性感染期艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1) gp160的全长基因序列及感染特征.方法 从一例处于Feibig Ⅰ期HIV-1感染者血浆中提取RNA,扩增gp160全长基因并测序,分析其生物学信息;将gp160全长基因与pcDNA3.1His/V5真核表达载体连接,构建Env-pcDNA3.1真核表达质粒,与骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293细胞,包装出假病毒.用包装的假病毒感染ghost细胞,测定感染细胞的荧光素酶活性(RLU),鉴定假病毒的感染活性.结果 成功扩增出gp160全长基因,嗜性预测为CCR5,N-糖基化位点数与标准株HXB2相同,但gp120糖基化程度更高,氨基酸变异主要集中在V1～V5区.假病毒感染试验显示,RLU值达到7log.结论 获得了处于急性感染期的HIV-1 gp160基因序列和高感染活性的假病毒.
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携带圣路易斯脑炎病毒特异基因片段的重组假病毒颗粒的构建与鉴定
目的 制备含有圣路易斯脑炎病毒(SLEV)prM基因片段的假病毒颗粒,旨在提供安全、可靠、稳定的核酸阳性质控品.方法 根据armored RNA技术原理,构建携带含有SLEV prM基因片段的重组质粒pSE380-MS2-SLEV,转化大肠杆菌后利用IPTG进行诱导表达,三氯甲烷法纯化后利用透射电镜观察重组假病毒颗粒形态.通过DNaseⅠ和RNase A双酶消化实验评价重组假病毒颗粒的核酸酶耐受性,并结合温度敏感性实验分析假病毒颗粒中核酸片段的稳定性.利用荧光定量 RT-PCR法对该假病毒颗粒进行验证.结果 PCR扩增和测序分析显示,prM基因片段正确克隆至载体pSE380-MS2.经大肠杆菌表达可形成直径约为25 nm的均一、球形重组假病毒颗粒.核酸酶消化和温度敏感性实验表明假病毒样颗粒包装的病毒核酸能耐受核酶的降解,37℃条件下存放20 d仍保持稳定.荧光定量RT-PCR检测该假病毒颗粒检测限可达1.8×103 拷贝/ml,且与同属的其他病毒无交叉反应.结论 成功构建了含有SLEV prM基因片段的假病毒颗粒,具有良好的核酸酶耐受性和稳定性,可作为核酸阳性质控品对核酸提取与检测过程进行全程监控.
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假病毒在丙型肝炎病毒研究中的应用
进行丙型肝炎病毒(HCV)研究的困难之一是缺乏方便实用的细胞培养体系,难以分离到大量的HCV.HCV假病毒是目前研究HCV感染早期阶段即病毒吸附、受体结合及与细胞膜融合等较理想的HCV替代模型.本文综述了HCV假病毒的构建方法及重要应用价值.
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含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备
目的：利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒（Marburg virus）、扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire Ebola virus）、苏丹型埃博拉病毒（Sudan Ebola virus）、拉沙热病毒（Lassa fever virus）和黄热病毒（Yellow fever virus）5种烈性病毒核酸片段的假病毒，为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法体外合成该5种病毒的目的基因片段，通过融合 PCR 技术将5个片段连接成一条基因，然后克隆到慢病毒表达载体上，并与其辅助载体共转染293T细胞；转染后分别于48、72 h 收集培养上清，用 DNase 和 RNase 进行消化处理及纯化浓缩，后提取核酸，利用普通PCR 和实时荧光定量 PCR 鉴定假病毒是否包装成功。结果测序结果表明，体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中；载体转染293T 细胞后收集上清中的假病毒，提取核酸经上述两种 PCR 鉴定均可特异性检测到靶基因，表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。
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基于假病毒筛选抗病毒药物的研究进展
假病毒是一种整合其他病毒囊膜糖蛋白所形成的具有外源性病毒囊膜、而自身基因组仍保持着源病毒基因组特性的一类病毒。假病毒因丧失了病毒的自我复制能力，具有安全性高等优点，已被广泛用于包括HIV、H5N1、HCV等病毒的研究。本文介绍了基于假病毒技术进行研究的优势及局限性，还通过总结大量研究成果阐明了利用假病毒技术进行药物筛选的可行性与有效性。假病毒药物筛选平台作为一种新型、安全、可靠的实验手段，将为抗病毒药物的研究做出更多的贡献。
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应用假病毒技术研究HIV-1复制抑制剂
建立以HIV-1复制为靶点的细胞水平假病毒药理筛选模型,并运用该模型筛选化合物库中随机选取的化合物.细胞水平的HIV-1假病毒药理筛选模型是应用水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSV-G)包装HIV-1核心建立的,简称VSVG/HIV模型.细胞被VSVG/HIV感染后,病毒携带的报告基因的表达水平(荧光素酶活性或GFP阳性细胞比例)反映了HIV-1的复制水平.对HIV-1复制有抑制作用的化合物应用VSVG/MLV模型对其特异性地进一步检测.被感染细胞中报告基因的表达水平与病毒稀释度呈显著的剂量依赖效应.阳性药物齐多夫定(zidovudine,AZT)、拉米夫定(lamivudine,3TC)、去羟基苷(didanosine,DDI)可剂量依赖性地抑制HIV-1的复制,其IC50分别为48.5 nmol·L-1、 0.13 μmol·L-1和1.73 μmol·L-1,与文献报道一致.在随机筛选的500个化合物中有3个化合物可以抑制HIV-1的复制,IC50分别为1.92、 5.38和3.39 μmol·L-1,而对MLV的复制无影响.VSVG/HIV假病毒系统是一种安全、有效的针对HIV-1复制的药理筛选模型.当将此模型与VSVG/MLV模型联合使用时,可判断化合物作用的特异性.实验表明:3个化合物,2-甲硫基-5-(4-甲基苯并)酰胺基-1,3,4-噻二唑(化合物A)、N-(3-羟基苯基)-2-(4-异丁基苯基)丙酰胺(化合物B)和N-(4-甲基吡啶基)-4-甲基苯磺酰胺(化合物C)可以特异性抑制HIV-1的复制.
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沙粒病毒进入抑制剂体外药效学评价模型的建立
沙粒病毒是一类有囊膜的RNA病毒.以哺乳动物为宿主的沙粒病毒(mammarenavirus)中,有9种可致人疾病,其中8种可致人出血热.拉沙病毒(Lassa virus,LASV)感染人所致拉沙出血热(Lassa hemorrhagic fever)流行范围广,有引发疾病大流行的可能,因此拉沙病毒被列为第一类病原微生物.目前针对沙粒病毒的疫苗和药物极为有限.本研究应用重组病毒技术,以HIV-1为核心,共构建了以9种沙粒病毒外壳蛋白包裹的重组病毒(arenavirus-GP/HIV-luc),在考察了它们对17株人、猴、鼠及蝙蝠的不同组织来源细胞进入水平的基础上,建立了沙粒病毒进入抑制剂药理活性评价模型,并用工具药验证.本研究建立的重组沙粒病毒进入抑制剂体外药效学评价模型特异性好,安全性高,可在生物安全二级(BSL-2)实验室进行实验,可为抗沙粒病毒药物和疫苗的活性评价提供技术平台,促进针对沙粒病毒出血热的药物及疫苗的研发.
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性激素类药物阻断丝状病毒进入宿主细胞的活性研究
本研究应用丝状假病毒模型筛选了1 600个己上市药物,旨在发现具有阻断丝状病毒感染活性的药物.首先应用扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白(Zaire Ebola virus glycoprotein,ZEBOV-GP)包装HIV-1核心的假病毒(ZEBOV-GP/HIV)感染细胞,并在感染前加入受试药物,通过检测被感染细胞中报告基因表达水平评价病毒的感染程度.研究发现,12个性激素类药物可抑制ZEBOV-GP/HIV感染,其中IC50＜1μmol·L-1的药物有3个,分别是枸橼酸托瑞米芬(IC50∶ 0.19±0.02 μmol·L-1)、枸橼酸他莫昔芬(IC50∶ 0.32±0.01μmol·L-1)和枸橼酸克罗米芬(IC50∶ 0.53±0.02 μmol·L-1).IC50介于1～10 μmol·L-1的药物有7个,分别是雌二醇苯甲酸酯(IC50∶1.83±5.69 μmol·L-1)、盐酸雷洛昔芬(IC50∶ 3.48±0.07 μmol·L-1)、马烯雌酮(IC50∶ 4.00±9.94 μmol·L-1)、雌二醇(IC50∶ 5.26±9.92 μmol·L-1)、炔雌醚(IC50∶ 6.36±5.37 μmol·L-1)、雌激素酮(IC50∶ 6.87±0.03 μmol·L-1)及非那雄胺(IC50∶ 9.94±0.45 μmol·L-1).此外,己烷雌酚(IC50∶ 14.20±0.55 μmol·L-1)和醋酸氯地孕酮(IC50∶ 24.60±0.36μmol·L-1)也有弱活性.其中枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸克罗米芬、盐酸雷洛昔芬及炔雌醚对丝状假病毒苏丹型埃博拉病毒(SEBOV-GP/HIV)和马尔堡病毒(MARV-GP/HIV)也有抑制作用.
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肠道病毒71型假病毒荧光定量检测方法在疫苗中和抗体检测中的应用
目的 假病毒荧光定量方法(PVLA)应用于EV71疫苗动物样本和人体样本检测的适用性研究.方法 分别采用细胞病变法(CPE)和PVLA方法检测82份EV71试验小鼠血清以及27份疫苗临床试验人体血清样本,比较两者检测的一致性.结果 应用两种方法检测82份疫苗免疫小鼠血清,EV71中和抗体滴度的相关系数为0.842,Bland-Altman分析显示高度一致性；检测27份EV71临床试验人体血清样本的中和抗体,两种方法具有高度一致性.结论 PVLA与CPE方法具有高度一致性,适用于疫苗免疫动物样本和临床评价人体样本EV71中和抗体的检测.
关键词： 肠道病毒71型(EV71) 假病毒 荧光定量 中和抗体 -
基于慢病毒载体系统构建重组JSRV-NM假病毒
目的：采用慢病毒质粒结构重组JSRV-NM假病毒，克服JSRV-NM病毒只能通过绵羊支气管穿刺接种扩增，不能通过体外细胞培养扩增的问题。方法采用慢病毒高效包装系统pMD.G、pCMV-HIV△8.2和pHIV-eGFP，以JSRV-NM病毒的env包膜质粒pCMVJSRV-NM替代VSV-G病毒的包膜质粒pMD.G，转染293T细胞，复制、包装并产出重组的JSRV-NM假病毒。用real-time PCR检测WPRE表达来测定假病毒的滴度，用接种24孔板的293T细胞检测假病毒感染力。结果成功重组了基于慢病毒质粒结构的JSRV-NM假病毒，可超速离心浓缩成高滴度（1×108 TU/mL）的病毒，Lv-JSRV-NM包膜与Lv-VSV-G包膜按感染复数（MOI）=3的比例感染Hela细胞具有相同的感染能力。结论基于慢病毒质粒构建的JSRV-NM假病毒，能够在293T细胞中复制和扩增，产出的假病毒具有稳定性、感染力和安全性，符合二级生物实验室安全的要求。
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HIV-1假病毒的研究进展
假病毒是一种病毒的核酸由另一种病毒编码的包膜蛋白所包被,从而形成的具有外源性病毒囊膜,而基因组保持着逆转录病毒本身基因组特征的病毒.假病毒因其丧失了病毒的自我复制能力及其安全系数高等优点,已经被广泛应用于包括人类免疫缺陷病毒(HIV)在内的多项研究中.HIV假病毒通过识别膜蛋白基因的功能有助于研究病毒侵入过程、病毒调节基因功能以及评估中和抗体效价.
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含基孔肯雅病毒包膜蛋白VSV假病毒制备
目的 建立一种含有基孔肯雅病毒(CHIKV)包膜蛋白的便于流行病学调查的疱疹性口炎病毒(VSV)假病毒.方法 以缺失VSV G蛋白的VSV病毒做为载体,制备含有CHIKV膜蛋白的VSV-E2E1病毒.结果 该VSV假病毒带有CHIKV膜蛋白,同时带有绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶;功效性试验显示,VSV-E2E1病毒在CHIKV E2单克隆抗体1:2 000稀释度时,酶的活性为2.73％,1:4 000稀释度时酶活性为9.61％,1:8000稀释度时酶活性为19.76％,1:16 000稀释度时酶活性为29.23％,1:32 000稀释度时酶活性为41.68％,1:64 000稀释度时酶活性为74.84％;无病毒感染的阴性对照酶活性为2.46％,当抗体稀释度为1:2 000时,大限度地抑制了病毒的复制.结论 含有基孔肯雅病毒包膜蛋白VSV假病毒安全、可靠,可应用于流行病学调查分析.
关键词： 基孔肯雅病毒(CHIKV) 假病毒 包膜蛋白 中和试验 -
汉坦病毒76-118株假病毒的构建及其在中和试验中的应用
目的 构建含有汉坦病毒76-118株包膜蛋白的假病毒,并初步探讨双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever wiht renal syndrome,HFRS)灭活疫苗效价检测的新方法.方法 提取汉坦病毒76-118株病毒RNA,PCR扩增获得M基因,将其插入真核表达质粒,获得重组表达质粒PcDNA3.1-M.将质粒PcDNA3.1-M与HIV假病毒构建体系DMEM 1、Lenti-HG和HGtransgene reagent瞬时共转染Vero-E6细胞,48 h后,收集假病毒上清,对其滴度、单轮感染性、蛋白量及中和活性进行检测,并应用于双价HFRS灭活疫苗抗血清的检测.结果 质粒PcDNA3.1-M经酶切及测序鉴定证明构建正确.假病毒对Vero-E6细胞的感染性滴度为8×107 TU/mL,能被76-118株抗血清中和,从而失去感染性,其中和活性与野生型病毒一致.基于假病毒的效价检测方法对效价合格血清进行再检测时结果均达到了预期要求.结论 构建了含有汉坦病毒76-118株包膜蛋白的假病毒,构建的假病毒可以应用于中和试验,并与野生病毒的检测结果具有高度相关性,为下一步检测双价HFRS灭活疫苗的效价提供了可能.
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HIV-1中和抗体检测方法的建立
目的 以荧光素酶作为报告基因,表达假病毒,建立快速、有效的HIV-1中和抗体检测方法.方法 将HIV-1中国流行株B/C重组亚型和C亚型Envelope基因的真核表达质粒分别与带有荧光素酶报告基因的pNL4-3.Luc.R-E质粒共转染293T细胞,培养48 h后收获含有假病毒的上清液,感染表达CD4受体和一个辅助受体CCR5的HOS细胞,培养72 h后,裂解细胞,检测荧光素酶每含量.结果 HIV-1的B/C重组亚型和C亚型Envelope基因真核表达质粒分别与pNL4-3.Lac.R-E质粒共转染的293T细胞,均有HIV-1结构蛋白Gagpol和Env的表达,相对分子质量分别为55000和160000,用产生的假病毒感染HOS-CD4-CCR5/CXCR4细胞后,产生的荧光素酶含量明显高于对照组.结论 已建立了瞬时转染检测HIV-1中和抗体的方法,为今后抗体样本及病毒样本的检测提供了参考.
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假病毒在中和抗体检测中的应用研究进展
目前成功的病毒性疫苗大多通过诱导广谱有效的中和抗体来保护机体免受感染,因此检测血清中和抗体水平对疫苗的免疫效果评价具有重要意义.中和抗体检测的传统方法包括微量细胞病变效应抑制法、蚀斑减少试验等,均需进行活病毒操作.近年来,随着逆转录病毒载体和重组病毒表达技术的发展,假病毒得到越来越多的研究,并被广泛应用在新型疫苗研发、中和抗原表位鉴定、细胞嗜性研究、抗病毒药物筛选、中和抗体检测、基因治疗等方面.此文主要对假病毒在中和抗体检测中的应用进行综述,并总结相关领域的研究进展.
