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体内电穿孔技术在DNA疫苗及基因治疗领域的应用进展
自电穿孔技术诞生以来,其介导的“裸”DNA投递技术已经广泛应用于体外细胞的转染.继而许多研究表明,体内电穿孔技术可以显著提高DNA疫苗或治疗性DNA质粒在肌肉、皮肤、肝、肿瘤及其他不同靶组织的表达水平,显示了良好的临床应用前景.目前,体内电穿孔技术已成功应用于多种实验动物模型,甚至在临床试验中也展示了良好的效果.本文就体内电穿孑L技术在DNA疫苗及基因治疗领域的应用进展进行了简要综述.
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血吸虫DNA疫苗联合免疫研究进展
本文从多个单价DNA疫苗的联合、单价DNA疫苗与细胞因子的联合、多价DNA疫苗的联合以及DNA疫苗与蛋白疫苗的联合4个方面,对血吸虫病DNA疫苗联合免疫研究进行了综述.
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丙型肝炎病毒多细胞毒性T淋巴细胞表位DNA疫苗诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应
本研究通过构建含有两个丙型肝炎病毒(HCV)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(Core133-142和El315-322)的多HCV CTL表位DNA疫苗,用其免疫小鼠,研究其引起的特异性CTL应答,以明确由多个HCV CTL表位基因编码直接连接构成的多CTL表位DNA疫苗,其各个HCV CTL表位是否能独立表达,引起各自相应的特异性CTL应答,且多个CTL的联合作用能否能增强总体的CTL杀伤效应,为构建有效安全的多CTL表位DNA疫苗提供理论基础.
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乙型肝炎表面抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的研究
目的研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠及其病毒清除作用.方法将小鼠随机分为8组,分别注射以下质粒:A组pcDNA3.1-S 100μg;B组:pcDNA3.1-GM-CSF-S 100μg;C组:pcDNA3.1-S-GM-CSF 100μg;D组:pcDNA3.1-S 50μg+pcDNA3.1-GM-CSF 50μg;E组:pcDNA3.1-GM-CSF 100μg;F组:重组酵母乙型肝炎疫苗1μg; G组:pcDNA 3.1 100 μg;H组:磷酸盐缓冲液(PBS)100μl.于质粒注射前4 d肌肉注射0.25%bupivacaine溶液100 μ1,诱导骨骼肌细胞变性.以HBsAg和GM-CSF的融合乙型肝炎表达质粒免疫HBV转基因小鼠,检测HBV转基因小鼠血清HBsAg表达水平及肝细胞HBsAg的表达,检测脾细胞白细胞介素(IL)-2、IL-4及γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平及淋巴细胞增殖情况,并进行肝组织学检查.结果质粒加强免疫4周后血清HBsAg检测结果A组为2 8.28±15.32、B组为10.77±9.18、C组为44.16±8.30、D组为21.93±13.28、E组48.04±3.60、F组为38.3±11.66、G组为47.03±3.96、H组为51.46±4.70,F=11.262,P＜0.01,其中B组血清HBsAg滴度显著低于其余各组.IL-2分泌水平(pg/m1)A组为25.5±7.5、B组为48.5±11.3、C组为4.0±2.5、D组为38.0±8.5、E组为3.7±2.1、F组为6.5±23.7、G组为1.8±1.0、H组为0,F=8.147,P＜0.01.IFN-γ分泌水平A组为71.0±23.2、B组为218.0±20.3、C组为20.0±13.5、D组为106.0±39.8、E组为18.0±10.5、F组为36.0±15.4、G组为5.0±4.0、H组为0,F=62.275,P＜0.01.淋巴细胞增殖反应结果A组为3.404±0.312、B组为4.69± 0.286、C组为1.390±0.065、D组为3.790±0.276、E组为1.480±0.067、F组为1.510±0.084、G组为1.290±0.123、H组为1.130±0.086,F=116.28,P＜0.01.肝细胞HBsAg的表达(黄棕色区面积/统计区总面积)结果A组为0.127±0.08 5、B组为0.029±0.046、C组为0.349±0.025、D组为0.075±0.039、E组为0.336±0.025、F组为0.292±0.069、G组为0.362±0.029、H组为0.394±0.059,F=41.439,P＜0.01.以上研究结果显示pcDNA3.1-GM-CSF-S免疫组血清HBsAg滴度及肝细胞HBsAg的表达水平显著低于pcDNA3.1-S免疫组,而pcDNA3.1-GM-CSF-S免疫组IL-2、FN-γ分泌水平均及淋巴细胞增殖反应均显著高于pcDNA3.1-S免疫组.各实验组及对照组均未见炎症细胞浸润、无肝细胞肿胀、变性及坏死.结论GM-CSF基因与HBsAg基因融合可增强HBsAg DNA疫苗对病毒的清除作用.
关键词： 肝炎病毒 乙型 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 DNA疫苗 融合表达质粒 -
乙型肝炎表面抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合表达质粒诱导小鼠特异性免疫应答
目的观察乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合表达质粒诱导特异性免疫应答的效果. 方法以HBsAg与GM-CSF融合表达质粒DNA免疫BALB/C小鼠,用酶链免疫吸附方法检测质粒诱导BALB/C小鼠产生抗-HBs及脾细胞经HBsAg体外刺激后分泌白细胞介素(IL)-2、4及γ干扰素(IFNγ)的水平;并用51Cr释放法检测HBsAg特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应. 结果各组小鼠加强免疫后血清抗体水平(P/N值)A组(PcDNA3.1-S)16.1±20.3,B组(PcDNA3.1-GM-CSF-S)28.3±19.7,F组(重组酵母乙型肝炎疫苗)29.5±21.5,C组(PcDNA3.1-S-GM-CSF)0.3±0.0,D组(PcDNA3.1-S+PcDNA3.1-GM-CSF)4.5±5.9,E组(PcDNA3.1-GM-CSF)0.9±1.2,G组(PcDNA3.1)及H组(PBS)为阴性(F＝4.176,P<0.01);IL-2分泌水平A组(26.6±1.9)、B组(56.0±2.2)、C组(4.3±1.2)、D组(33.5±1.7)、E组(3.5±1.4)、F组(7.5±2.0)、G组(1.5±0.7),H组未检测到IL-2分泌(F＝31.188,P<0.01);IFN-γ分泌水平A组(64.0±7.5)、B组(139.0±17.0)、C组(11.0±5.0)、D组(53.0±9.5)、E组(9.0±3.0)、F组(13.0±2.0)、G组(8.0±2.0,P<0.05),H组未检测到IFN-γ分泌(F＝31.796,P<0.01);HBsAg特异性CTL活性,效靶比为30:1及10:1时各组音有差异有显著性(F值分别为26.891、127.412、P<0.01),其中,PcDNA3.1-GM-CSF-S与PcDNA3.1-S比较差异有显著性(P<0.05). 结论通过与GM-CSF基因融合,可增强HBsAg DNA疫苗诱导的特异性免疫应答.
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乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫反应的实验研究
目的探讨DNA疫苗pCI-S-IRES- ProTα接种小鼠后的免疫反应变化。方法用基因重组技术构建DNA疫苗，脂质体介导转染NIH-3T3细胞，并给小鼠进行DNA疫苗接种。ELISA检测HBsAg、抗-HBs，RT-PCR检测pCI-S-IRES- ProTα的表达。结果 pCI-S -IRES- ProTα、pCI-S在细胞中高效表达，pCI-S-IRES- ProTα接种小鼠产生的体液反应和特异T淋巴细胞增值反应强于pCI-S组。结论 ProTα可增强接种小鼠的免疫反应。
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重组酵母乙型肝炎疫苗和DNA疫苗交互免疫研究
目的为更有效地激发对乙型肝炎表面抗原体液免疫和细胞免疫反应,更有效地防治乙型肝炎.方法以重组酵母乙型肝炎疫苗和HBs-DNA疫苗作为初次免疫,再分别以DNA疫苗和重组酵母乙型肝炎疫苗交互加强免疫,于加强免疫后2周以ELISA检测抗-HB s,乳酸脱氢酶法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果先用重组酵母乙型肝炎疫苗免疫,再用HBs-DNA疫苗加强时抗体A值为0.38,效靶比为1 00:1时,CTL值为36%;先用HBs-DNA疫苗免疫,再用重组酵母乙肝疫苗免疫时抗体A值为0.32,CTL值为27%.两次重组酵母乙型肝炎疫苗免疫后的抗体A值为0.48,CTL反应值为1.5%;两次HBs-DNA疫苗免疫后A值为0.24,CTL反应值为68%.结论乙型肝炎表面抗原能增强DNA疫苗的抗体反应,DNA疫苗能增强重组酵母乙型肝炎疫苗的C T L反应,两者交互免疫可得到更好的免疫效果.
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空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达
目的:构建空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒,并证实其能在COS-7细胞中表达.方法:以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应,获得空肠弯曲菌Pen:2、Pen:8、Pen:19和Pen:21 cadF基因DNA片段.并选择与格林-巴利综合征为相关的空肠弯曲菌Pen:19 PCR产物为目的基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,以构建重组质粒pcDNA3.1(+)-cadF.重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞.运用R T-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达.结果:双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功.采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段.结论:空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-cadF构建成功,并能在COS-7细胞中表达.为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础.
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轮状病毒DNA疫苗经不同途径接种诱导体内免疫应答研究
目的:通过研究不同途径接种轮状病毒DNA疫苗所诱导的体内免疫应答,寻找其适合的免疫途径.方法:轮状病毒基因疫苗pcDNA1/VP7经肌肉注射及鼻粘膜两种途径免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法对其诱导产生的体液免疫应答进行测定.结果:经肌肉注射及鼻粘膜两种途径接种轮状病毒DNA疫苗后,均在BALB/c小鼠体内诱导产生了病毒特异性IgG增高(P＜0.05),而病毒特异性IgA与对照组相比无显著性差异.结论:肌肉注射及鼻粘膜两种途径均能作为轮状病毒DNA疫苗的候选接种途径.
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空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因序列分析及其真核表达重组质粒的构建
目的针对空肠弯曲菌基因组序列为一超变量序列,测序比较空肠弯曲菌Pen:2和Pen:19 peblA基因的同源性,以证实peblA基因的保守性.在此基础上,构建空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因真核表达重组质粒.方法以含有Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的同一对引物行PCR反应,获得空肠弯曲菌Pen:2、Pen:8、Pen:19和Pen:21peblA基因DNA片段,测序比较Pen:2和Pen:19 peblA基因的同源性.并选择与格林-巴利综合征为相关的空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因PCR产物为目的片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),以构建重组质粒.重组质粒经双酶切鉴定、PCR鉴定和测序确认后转染至COS-7细胞,RT-PCR方法检测其瞬时表达.对阳性克隆培养基上清中PEB1蛋白的表达用ELISA分析.结果测序证实空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因序列与Pen:2 peblA基因序列一致.采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段.ELISA分析表明PEB1蛋白在COS-7细胞上清中获得表达.结论空肠弯曲菌peblA基因具有良好保守性,以此成功构建的重组质粒能在COS-7细胞中表达,为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础.
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幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒的构建及鉴定
目的克隆幽门螺杆菌hpaA基因,并构建其真核表达质粒.方法以Hp NCTC11637基因组DNA为模板,PCR扩增hpaA基因,亚克隆至pMD18-T载体中,目的基因经酶切纯化后插入pTCAE,转化E.coli DH5α,酶切并测序鉴定正确的重组质粒命名为pT-hpaA.电穿孔法将pT-hpaA转染CHO细胞,Western blot检测HpaA蛋白的表达.结果克隆重组得到pT-hpaA,将pT-hpaA电穿孔法转染CHO后,培养上清经Western blot检测,在相对分子量为30 000条带处出现特异性抗原抗体反应.结论成功构建了幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒,体外CHO细胞转染和Western blot实验证实了HpaA蛋白的表达,为进一步的免疫实验奠定了基础.
关键词： Helicobacter Pylori HPAA DNA疫苗 -
非洲爪蟾TGF-β5和小鼠TRP-2联合免疫诱导产生抗肿瘤免疫应答
目的研究非洲爪蟾转化生长因子-β5(aTGF-β5)基因免疫对肿瘤治疗性质粒DNA疫苗诱导抗肿瘤免疫应答的效能的影响,探讨所诱导免疫应答的抗肿瘤机制.方法用aTGF-β5真核表达质粒和小鼠酪氨酸酶相关蛋白2(mTRP-2)真核表达质粒联合免疫野生型C57BL/6小鼠、CD4缺陷的C57BL/6小鼠和CD8缺陷的C57BL/6小鼠,于免疫前或免疫后接种黑色素瘤细胞B16F10,观测肿瘤生长和小鼠存活情况.结果两种质粒联合免疫能在野生型C57BL/6小鼠体内诱导产生保护性和治疗性抗肿瘤免疫,而mTRP-2真核表达质粒单独免疫野生型C57BL/6小鼠及两种质粒联合免疫CD4或CD8缺陷的C57BL/6小鼠均不能诱导产生抗肿瘤免疫应答.结论 aTGF-β5基因免疫能增强编码mTRP-2的肿瘤治疗性质粒DNA疫苗诱导抗肿瘤免疫应答的能力;T细胞免疫应答的诱导是抗小鼠黑色素瘤免疫应答所必需的.
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Flk-1265-2493与C3d3基因融合质粒诱导小鼠免疫应答的初步研究
目的 对pSG.SS.Flk-1265-2493·C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1265-2493·YL真核表达质粒的免疫效应进行初步研究.方法 构建pSG.SS.Flk-1265-2493·C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1265-2493·YL真核表达质粒后,48只BALB/c小鼠随机均分为疫苗组、疫苗对照组、质粒对照组、空白对照组(12只/组),分别肌肉注射接种此2种质粒、pSG.SS.YL质粒和PBS.免疫后动物:①每组6只取脾脏分离细胞,MTT法测定经Flk-1蛋白刺激后的增殖效应,乳酸脱氢酶释放法测定对培养小鼠肺微血管内皮细胞的杀伤作用;②其余6只动物于不同时间点断尾取血分离血清,ELISA法测定抗Flk-1抗体水平的动态变化.结果 经Flk-1蛋白刺激,疫苗组小鼠脾淋巴细胞的增殖效应明显较强,刺激指数显著高于其他3组(P均＜0.01),对靶细胞(MVECs)的杀伤活性在不同效/靶比时均显著高于其他3组(P均＜0.01).疫苗组动物血清抗Flk-1抗体比对照疫苗组抗体阳性反应出现早2周,二者峰值效价均出现在5周(血清稀释度:1:3840 vs 1:60),前者12周时仍保持较高水平(1:960),后者10周时抗体阳性反应已消失.结论 C3d3的连接有效增强了Flk-1265-2493的免疫原性.
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乙型肝炎疫苗研究现况
乙型肝炎是全世界常见的一种传染病.目前,全世界大约有4亿人是慢性乙型肝炎病毒携带者,而中国大约有1亿病毒携带者,高居世界第1位.我国同时也是乙肝病毒感染的高发国,人群中乙肝感染率高达57.6%,其中1/4的乙型肝炎病毒携带者有可能发展为肝细胞癌(hepatocellular caricinoma,HCC),80%肝细胞癌是由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起[1～3].
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多价CTL表位DNA疫苗研究进展
DNA疫苗把带有目的抗原基因的重组质粒转染到动物细胞中,使之在细胞内持续表达出天然的抗原物质,诱导强而持久的特异性细胞免疫及体液免疫应答,已经在感染性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤防治等多方面取得了令人鼓舞的成果,被誉为第3次疫苗革命.近年来,T细胞识别机制及抗原加工提呈研究取得突破性进展,随着分子生物学及免疫学技术的日益成熟,大量CTL表位得以鉴定,为特异性细胞免疫治疗奠定了基础,构建DNA疫苗的基因也由整个目的抗原的编码基因转变为编码基本的功能单位-表位的小基因[1].
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HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达
目的 构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定.方法 采用PCR 技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3 融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL.经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达.结果 经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功.结论 构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础.
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日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达
[目的]构建日本血吸虫ATP合酶脂结合蛋白样基因(ATP synthase lipid-binding protein-like protein gene of Schistosoma japonicum, SjAslp)核酸疫苗,并观察其在真核细胞中的表达情况.[方法]根据GenBank中SjAslp cDNA全长设计特异性引物,从实验室已构建好的重组质粒pBCSK+/SjAslp中扩增出SjAslp cDNA全长,将其克隆入pUCm-T.载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建成日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶全基因核酸疫苗(pcDNA3.1(+)/SjAslp);经PCR、酶切及测序鉴定后,利用电穿孔将其转染HeLa细胞.采用免疫细胞化学法检测SjAslp在HeLa细胞内的表达情况.[结果]成功构建SjAslp核酸疫苗,免疫细胞化学技术检测其能在HeLa细胞浆内表达.[结论]pcDNA3.1(+)/SjAslp核酸疫苗能在真核细胞内表达,为抗日本血吸虫核酸疫苗的研制打下了必要的基础.
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疟疾感染对HIV-1 DNA疫苗免疫效果的影响
目的 探讨小鼠感染疟疾后是否会对艾滋病疫苗的免疫产生影响.方法 用HIV-1 DNA疫苗pVAX-gag分别免疫感染过疟疾和未感染过疟疾的Balb/c小鼠,观察不同组小鼠接种pVAX-gag疫苗后,细胞免疫、体液免疫和免疫记忆的变化.结果 pVAX1-gag免疫感染过疟疾和未感染过疟疾的Balb/c小鼠,均可诱导出明显的体液免疫和细胞免疫反应;但pVAX 1-gag免疫未感染过疟疾的小鼠诱导出的体液免疫反应高于感染过疟疾的小鼠,所获得的抗体滴度是感染过疟疾的小鼠的3倍,未感染过疟疾的小鼠诱导出的细胞免疫反应高于感染过疟疾的小鼠.结论 感染疟疾后对艾滋病疫苗的免疫有一定的抑制作用,这为艾滋病疫苗的研发提供了实验依据.
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HSV-2gD、gBCTL表位及Hsp70融合DNA疫苗的免疫效果观察
目的 研究多表位重组DNA疫苗pc(pcDNA3.1-)-P6-gBCTL-Hsp70的免疫原性.方法 将构建的真核表达质粒pcP6-gBCTL-Hsp70转染CHO细胞表达,采用间接免疫荧光和Western blotting检测P6抗原的表达情况.将重组质粒肌肉注射免疫接种Balb/c小鼠3次,每次间隔2周.末次免疫后1周采集眼眶静脉血,末次免疫后1月无菌分离小鼠脾脏.采用ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率,LDH法检测CTL活性. 结果 重组质粒pc-P6-gBCTL-Hsp70具有一定的免疫原性,可刺激机体产生特异性抗体,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18,促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,CTL杀伤病毒感染细胞活性增强.结论 重组核酸疫苗pc-P6-gBCTL-Hsp70能诱导较强的细胞免疫和体液免疫.
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HMGB1不同结构域对CVB3心肌炎疫苗免疫增强作用的比较研究
目的 本研究在已构建好的柯萨奇病毒B3型(CVB3)疫苗pVP1的基础上,分别引入编码HMGB1不同结构域的质粒DNA,通过检测共免疫诱导的免疫应答强度,比较其各结构域介导的免疫增强作用.方法 首先构建了编码HMGB1的不同结构域的质粒pHMGB 1-A、B、C-box,分别与pVP1疫苗混合后肌注免疫小鼠,于末次免疫后10 d检测其诱导的特异性抗体和细胞免疫应答.结果 与pVP1单独免疫组相比,pHMGB1-B box共免疫组可显著提高特异性血清IgG水平,同时也显著增加了脾脏IFN-γ+T的细胞数量;C-box仅显示出促进T细胞免疫的效应且程度较B-box小,对抗体水平无明显增强作用;A-box对抗体水平和细胞免疫应答的促进作用都不明显.结论 HMGB1不同结构域对病毒性心肌炎DNA疫苗诱导的体液和细胞免疫应答具有不同程度的增强效应,其中B-box可综合增强CVB3特异性体液和细胞免疫应答,C-box仅有促进T细胞应答效应,而对抗体水平无促进作用,A-box对抗体水平增加和细胞免疫应答的促进作用不明显.该研究不仅有助于深入了解HMGB1不同结构域的免疫佐剂效果差异,更为科学合理应用HMGB1增强免疫应答提供了一定的基础数据.
