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补体C3d作为分子佐剂的研究进展
补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成,是天然免疫系统的一部分.补体C3分子的裂解片段C3b、iC3b和C3d是连接天然免疫和获得性免疫的重要蛋白质分子[1].
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血清B细胞刺激因子及C3d结合型供者特异性抗体在肾移植术后慢性抗体介导排斥反应中的诊断价值
目的 观察血清B细胞刺激因子(BAFF)与C3d结合型供者特异性抗体(DSA)在肾移植术后慢性抗体介导排斥反应(AMR)中的诊断价值.方法 回顾性分析2010年5月至2012年5月于首都医科大学附属北京朝阳医院行同种异体肾移植术的109例受者资料,观察术后3年慢性AMR发生情况.病理诊断为慢性AMR的患者,留取诊断时刻静脉血5 mL;同时留取与慢性AMR患者同期行肾移植术、未发生慢性AMR的受者血样.检测血清BAFF值、群体反应性抗体(PRA)和DSA,PRA强阳性和DSA阳性者检测血清C3d结合型DSA.绘制BAFF和C3d结合型DSA受试者工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、约登指数及曲线下面积.P<0.05为差异有统计学意义.结果 109例肾移植受者中,共19例病理诊断为慢性AMR,血样平均留取时间为术后(28±7)个月,同期手术且未出现慢性AMR的32例受者血样留取时间为术后(27±5)个月.慢性AMR患者和同期手术的非慢性AMR患者DSA阳性比例、C3d结合型DSA阳性比例和BAFF值分别为52.6%(10/19)和15.6%(5/32)、26.3%(5/19)和3.1%(1/32)、(2070±825)pg/mL和(790±293)pg/mL,差异均有统计学意义(χ2=43.59、6.18,t=23.745,P均<0.05),PRA阳性比例两组差异无统计学意义.血清BAFF和C3d结合型DSA诊断慢性AMR的灵敏度、特异度、约登指数和ROC曲线下面积分别为83%和77%、79%和83%、0.62和06.0、0.78和0.79,ROC曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05).结论 血清BAFF和C3d结合型DSA对诊断肾移植术后慢性AMR有一定价值,可作为高危患者诊断慢性AMR的辅助手段.
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肾炎患者血中C3d水平及CD16+单核巨噬细胞膜补体调节蛋白的表达
目的:探讨肾炎患者补体激活时活化单核巨噬细胞(CD16+Mo/MΦ)膜辅因子蛋白(MCP)、促衰变因子(DAF)及同种限制因子20(HRF-20)表达水平.方法:采用流式细胞术测定136例肾小球肾炎患者血中CD16+Mo/MΦMC P、DAF和HRF-20表达水平,采用ELISA法测定血清C3d及荷C3d-免疫复合物的(C3d-IC)水平 .结果:MC病人血清C3d、C3d-IC水平及血中CD16+Mo/MΦ MCP、D AF、HFR-20表达水平与正常组无显著差异(P＞0.05),GS、MN及PGN病人血清C3d水平、血中CD16+Mo/MΦ MCP、DAF、HRF-20表达水平及MN、PGN病人C3d-IC水平均显著高于正常组(P＜0.01),且MCP、DAF、HRF-20表达水平与血清C3d水平呈显著正相关(P＜ 0.01).结论:肾小球肾炎补体激活时血中CD16+Mo/MΦ MCP、DAF、 HRF-20表达水平显著上调,以保护CD16+Mo/MΦ不被激活的补体损伤.从而,CD16+Mo/ MΦ浸润肾组织并产生促炎作用,参于肾小球肾炎的发病及发展.
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HBV-preS2/S-C3d联合基因疫苗诱导的特异性免疫应答及其意义
目的:研究HBV-preS2/S-C3d联合基因疫苗诱导的特异性体液和细胞免疫应答及其意义.方法:CR2结合实验检测C3d融合蛋白的结合特性;分别用TR421、TR421-preS2/S和TR421-preS2/S-C3d3重组质粒免疫小鼠,ELISA法检测特异性抗HBs-IgG的亲合力,3H-TdR掺入法检测其特异性淋巴细胞增殖活性(SI),半定量RT-PCR法检测IL-4、IFN-γ、T-bet和GATA-3基因表达的水平.结果:C3d融合蛋白可有效地结合CR2;TR421-preS2/S-C3d3质粒基因免疫诱导的抗HBs-IgG水平、亲合力以及SI均明显高于TR421-preS2/S组,并且前者诱导的IL-4、IFN-γ、T-bet和GATA-3基因表达水平也均高于后者.结论:C3d通过结合CR2、上调IL-4和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV特异性免疫应答.
关键词： 基因免疫 免疫调节 C3d 乙型肝炎病毒表面抗原 -
C3d分子多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用
目的 研究C3d分子对多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用.方法 通过PCR方法合成多表位HME基因,分别插入真核表达载体pcDNA3.1和pcDNA3.1-3C3d,构建多表位DNA疫苗pcDNA3.1-HME和pcDNA3.1-HME-3C3d,经肌肉注射免疫小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体水平.结果 经免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体,且pcDNA3.1-HME-3C3d免疫组小鼠的抗体水平明显高于pcDNA3.1-HME免疫组.结论 C3d可增强多表位DNA疫苗的体液免疫应答水平.
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神经细胞黏附分子样蛋白对小鼠NK细胞活性的影响
目的研究神经细胞黏附分子样蛋白对小鼠NK细胞活性的影响.方法将神经细胞粘附分子样蛋白的编码基因连接在补体C3d基因的下游,构建融合基因,再将此融合基因克隆入真核细胞表达质粒.用此重组质粒免疫小鼠,检测小鼠体内的抗体和NK细胞的活性.结果小鼠体内产生了神经细胞粘附分子样蛋白的特异性抗体,而且小鼠脾细胞的NK活性增强.结论神经细胞粘附分子样蛋白可能具有抑制NK细胞的活性,在被特异性抗体识别和结合后,这种抑制作用减弱或消失.
关键词： 神经细胞粘附分子样蛋白 C3d 核酸免疫 NK细胞 -
C3d对基因免疫诱导的HBV特异性体液免疫应答的调节作用
观察补体C3d对HBV基因免疫诱导的特异性体液免疫应答的调节作用,为增强HBV基因疫苗免疫效果寻求新途径.将HBV-preS2/S编码基因分别插入真核表达载体TR421和含有3拷贝C3d编码基因的TR421-C3d3质粒,构建重组质粒TR421-preS2/S和TR421-preS2/S-C3d3.采用肌肉注射法对BALB/c小鼠实施基因免疫(100μg/100μl/只小鼠),以空质粒为对照,定期采集血清.ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗-HBs-IgG及其亚型,并采用NaSCN竞争ELISA法检测其亲合力.结果表明,TR421-preS2/S-C3d3重组质粒免疫组诱导的特异性抗-HBs-IgG水平明显高于TR421-preS2/S重组质粒免疫组(P＜0.05);而且TR421-preS2/S-C3d3重组质粒免疫组诱导的抗-HBs-IgG抗体的亲合力(ED50:1.375)显著高于TR421-preS2/S重组质粒组(ED50:0.875),但C3d并不改变基因免疫诱导的特异性抗HBs-IgG各亚型水平的格局,仍以IgG2b和IgG2a为主.提示C3d可增强基因免疫诱导的HBV特异性体液免疫应答,并促进特异性抗体亲和力的成熟,这为提高HBV基因疫苗的免疫效果提供了新的途径.
关键词： 基因免疫 C3d 乙型肝炎病毒表面抗原 -
抗C3d单抗制备及免疫金层析法的建立
目的研制抗C3d单抗,建立免疫金层析法检测血浆补体片段C3d,判断补体活化情况.方法用菊糖-C3b作抗原,免疫Balb/c小鼠,并制备杂交瘤,以羊抗C3包被酶标反应板并结合C3d为检测板,筛选分泌抗C3d单抗的杂交瘤.利用protein G柱亲和层析提取抗C3d单抗IgG和C3d结合物,进行SDS-PAGE电泳,鉴定单抗的特异性.将抗C3d单抗标以胶体金,制备免疫金层析测试条.通过在免疫金中加未标金的抗C3d单抗(游离单抗)来调整试纸条的灵敏度,并测定C3d.结果 SDS-PAGE电泳图上,出现IgG的重链、轻链、及C3d 3个条带;金标记抗C3d单抗的试条(Ⅰ)测C3d的灵敏度在6～10 ng/ml,当加入0.1 μg/ml游离抗C3d单抗(Ⅱ)后,灵敏度为10～15 ng/ml.利用两种试条灵敏度的不同,对轻、中重型肝炎检测,结果轻型肝炎患者在纸条Ⅰ上阳性率为83.3%(25/30),纸条Ⅱ全为阴性,中重型肝炎者在纸条Ⅰ、Ⅱ的阳性率为100%(30/30).结论用本试验建立的免疫金层析法测定肝炎患者血浆C3d水平,可判断补体活化程度,辅助乙型肝炎轻、重分型.
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细胞结合补体活化产物在系统性红斑狼疮诊断中的价值
目的 检测外周血T、B淋巴细胞和红细胞结合补体活化片段C3d、C4d水平,评价细胞结合补体活化产物在系统性红斑狼疮(SLE)诊断中的价值.方法 随机收集68例SLE患者、70例非SLE的自身免疫性疾病患者和68例体检健康者外周血样本,采用流式细胞术检测细胞结合补体活化产物T-C4d、B-C4d、E-C4d、T-C3d、B-C3d、E-C3d的表达水平,同时检测抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)、外周血细胞计数等相关指标,应用受试者工作曲线、非参数检验、敏感性、特异性等统计学方法 分析3组间细胞结合补体活化产物的分布差异.结果 T-C4d、B-C4d、E-C4d、T-C3d、B-C3d、E-C3d在SLE患者中的特异性中位荧光强度(SMFI)均高于非SLE的自免性疾病患者和正常对照,差异有统计学意义(P均＜0.05),T-C4d、B-C4d和E-C4d在SLE患者中的表达水平高,分别为3.8(1.2,13.1)、22.1(6.2,67.9)和19.6(1.8,52.4);T-C4d、B-C4d和E-C4d在红细胞和/或淋巴细胞减少患者中的水平也显著高于无红细胞和/或淋巴细胞减少患者(P均＜0.05);T-C4d、B-C4d、E-C4d、T-C3d、B-C3d、E-C3d ROC曲线下面积分别为0.711、0.763、0.663、0.631、0.611、0.615(P均＜0.05).T-C4d、B-C4d联合诊断SLE的敏感性为73.5％,优于anti-dsDNA的36.8％.结论 外周血细胞结合补体活化产物在SLE患者中特异性高表达,联合检测不同系细胞补体活化产物有助于SLE诊断.
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吉兰-巴雷综合征患者血清C3d水平检测
目的：了解吉兰-巴雷综合征(GBS)患者血清中 C3d 水平,以及 C3d 与 GBS 的相关性。方法应用 ELISA 方法检测 GBS 患者及对照组血清 C3d 水平,分析 C3d 水平与病程、四肢肌力 MRC 评分的相关性。结果GBS 患者急性期 C3d 水平显著高于对照组,C3d 水平与病程无线性相关,C3d 水平与 GBS 患者 MRC 评分无线性相关。结论C3d 参与 GBS 发病过程。
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高致敏二次肾移植患者术前应用硼替佐米行脱敏治疗1例报告及文献复习
目的 总结硼替佐米术前脱敏治疗用于1例高致敏二次肾移植患者的临床经验.方法 1例移植前供体特异性抗体(DSA)阳性的二次肾移植患者,术前应用硼替佐米(1.3 mg/m2,分别于移植术前13、10、6 d,皮下注射)加低剂量免疫球蛋白.术后采用他克莫司(FK506)+麦考酚钠+甲泼尼龙三联免疫抑制方案,观察患者血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)水平、FK506血药浓度、DSA滴度、C3d结合性DSA(C3d-DSA)滴度及移植肾病理活组织检查(活检)等变化,以及不良反应.结果 硼替佐米应用后随访12个月,Scr下降并稳定在130μmol/L,BUN维持在3.9 mmol/L,DSA水平明显下降,C3d-DSA阴性.术后4个月和9个月移植肾病理穿刺检测均为C4d阳性,提示慢性活动性抗体介导的排斥反应(AMR).患者出现3级周围神经病变.结论 术前使用硼替佐米脱敏方案可有效降低肾移植受者体内DSA水平,避免高致敏二次肾移植患者发生急性排斥反应.高致敏移植患者术前脱敏治疗可选择硼替佐米在内的综合治疗.
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Flk-1265-2493与C3d3基因融合质粒诱导小鼠免疫应答的初步研究
目的 对pSG.SS.Flk-1265-2493·C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1265-2493·YL真核表达质粒的免疫效应进行初步研究.方法 构建pSG.SS.Flk-1265-2493·C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1265-2493·YL真核表达质粒后,48只BALB/c小鼠随机均分为疫苗组、疫苗对照组、质粒对照组、空白对照组(12只/组),分别肌肉注射接种此2种质粒、pSG.SS.YL质粒和PBS.免疫后动物:①每组6只取脾脏分离细胞,MTT法测定经Flk-1蛋白刺激后的增殖效应,乳酸脱氢酶释放法测定对培养小鼠肺微血管内皮细胞的杀伤作用;②其余6只动物于不同时间点断尾取血分离血清,ELISA法测定抗Flk-1抗体水平的动态变化.结果 经Flk-1蛋白刺激,疫苗组小鼠脾淋巴细胞的增殖效应明显较强,刺激指数显著高于其他3组(P均＜0.01),对靶细胞(MVECs)的杀伤活性在不同效/靶比时均显著高于其他3组(P均＜0.01).疫苗组动物血清抗Flk-1抗体比对照疫苗组抗体阳性反应出现早2周,二者峰值效价均出现在5周(血清稀释度:1:3840 vs 1:60),前者12周时仍保持较高水平(1:960),后者10周时抗体阳性反应已消失.结论 C3d3的连接有效增强了Flk-1265-2493的免疫原性.
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肺炎结合疫苗PPS14-OVA、PPS14-C3d在小鼠脾脏的定位及补体对定位的影响
目的 检测血清型14型肺炎球菌荚膜多糖(PPS14)结合疫苗PPS14-OVA(卵清蛋白)、PPS14-C3d(补体)免疫小鼠后在脾脏细胞中的定位,以及补体对其定位的影响.方法 PPS14-OVA、PPS14-C3d经皮下或静脉注射,免疫正常小鼠和眼镜蛇毒因子(CVF)预处理的小鼠,应用免疫荧光技术检测脾脏冰冻切片中的PPS14及各种免疫细胞.结果 正常小鼠免疫PPS14-OVA后,PPS14-OVA定位于脾脏;1 h后与脾脏边缘区B细胞有结合;2 h后出现在淋巴滤泡中;6 h后全部转移至淋巴滤泡,并与滤泡B细胞和树突状细胞结合,与巨噬细胞和T细胞没有结合.而CVF预处理的小鼠,PPS14-OVA不定位于脾脏.PPS14-C3d在脾脏中的定位不受CVF处理的影响.结论 PPS14-OVA在脾脏中的定位需要补体的介导,而PPS14-C3d不需要.
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小鼠补体C3d分子cDNA的克隆及鉴定
目的获得小鼠C3d分子的cDNA.方法从小鼠肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d分子的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建C3d-pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定.结果通过琼脂糖凝胶电泳证明有1.0kb左右的PCR扩增片段,序列测定表明为C3d分子的cDNA.结论通过RT-PCR法从小鼠肝细胞RNA中成功地扩增到小鼠C3d分子的cDNA,为进一步构建基于C3d分子内佐剂的疫苗奠定了基础.
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抗-Jkb引起的溶血反应1例
1 临床资料患者,女,56岁,汉族.2006年11月8日因"右乳房浸润性导管癌术后多发转移"入院,之前曾多次入院,有输血史.
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hCGβ-(CTP)4和hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4在大肠杆菌中的表达及纯化
目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中表达hCGβ-(CTP)4、hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4融合蛋白,并对蛋白进行分离纯化.方法:将Pbsmr-(CTP)4中的(CTP)4基因片断克隆入表达载体Pet-28a(+),得到表达质粒Pet-28a(+)-(CTP)4.将PCR获得的补体C3d-P28 DNA序列以头尾串连的方式构建四聚体.将(C3d-P28)4基因片断克隆入Pbsmr-(CTP)4,得到Pbsmr-(CTP)4-(C3d-P28)4,进一步得到表达质粒Pet-28a(+)-(CTP)4-(C3d-P28)4.将表达质粒Pet-28a(+)-(CTP)4和pET-28a(+)-(CTP)4-(C3d-P28)4分别转化入大肠杆菌BL21(DE3),表达融合蛋白hCCβ-(CTP)4和hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4.采用Ni-NTA-resin和凝胶过滤方法纯化蛋白.结果:菌株经IPTG诱导后检测到目的基因的表达产物,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白的分子量分别为27 kD和40 kD左右.结论:在BL21(DE3)中成功表达了hCGβ-(CTP)4和hCGβ-(CTP)4-(C3d-P28)4融合蛋白,并确立了纯化方法,为进一步研究其免疫原性和应用于抗肿瘤疫苗奠定了基础.
关键词： hCGβ-CTP多聚体 C3d 分子佐剂 表达 纯化 -
hCGβ-CTP多聚体-3C3d融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达
目的:在巴氏毕赤酵母细胞中表达hCGβ-(CTP)n(n=3,4)-3C3d融合蛋白.方法:将(CTP)n(n=3,4)基因与分子佐剂C3d基因的三聚体连接后,克隆入载体pPIC9K得到表达质粒pPIC9Khis6(CTP)n(n=3,4)3C3d,经限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序确认后电转入酵母细胞中进行表达.结果:在酵母细胞内检测到目的基因的表达产物,Westernblot结果显示它们的分子量分别为125 kD和138 kD左右.结论:运用巴氏毕赤酵母表达系统成功表达了hCGβ-(CTP)n(n=3,4)-3C3d融合蛋白,为进一步研究其免疫原性和用作抗肿瘤疫苗奠定了基础.
关键词： hCGβ-CTP多聚体 C3d 毕赤酵母
