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基因芯片技术在乙型肝炎病毒基因分型检测中的应用探讨
目的:探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.方法:查阅国际上主要的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型诊断标准和现行技术,通过将基因芯片技术与目前用于HBV基因分型的技术方法进行对比,探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.结果:HBV的基因分型,既可通过全基因序列比对,也可通过片段基因序列比对,片段基因序列比对是实际工作中HBV基因分型的主要方法,现有报道的技术主要为型特异引物(SSP)PCR扩增法和PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.基因芯片技术具有高敏感、高通量和能够平行检测DNA类型等特点,技术类型属于PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.尚未见有应用基因芯片技术进行HBV基因分型检测的报道.结论:借鉴现有的PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法,如微板核酸杂交-ELISA显色技术,理论上利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的,并且具有高效、快速和廉价等特点.
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乌鲁木齐地区不同人群血清中TTV的流行病学调查
1.调查对象与方法:按照随机采样的原则,从乌鲁木齐市中心血站及我院诊治的肝炎患者中收集病例,按照流行病学登记表造册登记,共调查338例,其中汉族204例,维吾尔族134例,男性244例,女性97例,年龄0～72岁.其中排除甲～庚肝单纯转氨酶增高者40例、HIV阳性患者72例、普通肝炎患者66例、献血员97人、血透中心患者25例、对照组为新入伍的健康士兵血清38份.调查对象静脉无菌采血2 ml,分离血清置-20℃冰箱保存、备用.仪器与试剂采用TTV-DNA微板核酸杂交-PCR-ELISA检测试剂,ALT/AST检查用美国BecKman公司全自动生化仪及配套试剂;HIV血清检测由本院检验科完成;PCR仪为美国Techene公司产品;酶联检测仪为芬兰Deorley Dragen Wellcom MK2酶联仪.对检测获得的数据进行统计学分析.
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徐州地区乙型肝炎病毒基因型分布及其意义
选择我院门诊和住院病例HBV DNA阳性者共150例,其中无症状携带者、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化和肝癌各30例.其诊断均符合2000年第十次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学分会联合修订的病毒型肝炎防治方案.150例采取静脉血,分离血清,-20℃保存.HBV DNA定量检查用Roche Lightcycler荧光定量扩增仪,试剂由深圳匹基公司提供,以104copy/ml为阳性;HBV-M用上海荣盛公司ELISA试剂;ALT的检验用英国朗道试剂.HBV基因分型方法采用微板核酸杂交-ELISA技术,由广州蓝星公司提供,其所用引物为:prime 1:3′-CCC TTC TTC GTC TGG GGT TCC-5′和prime 2:3′-ACC AAT TTA TGC CTA CAG CCTC-5′.结果判断:P/N≥3.0为阳性,P/N＜3.0为阴性(阴性对照A值小于0.05,按0.05计算).P/N值=标本A值/阴性对照A值.质量控制:选择对乙肝病毒DNA的S区序列分析所确定的B、C、D和B+C、C+D基因型病人血清作为阳性对照物,并做重复试验以证实该方法的可靠性和准确性.150例各类HBV DNA阳性乙型肝炎病人基因分型结果见表1.
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乙型肝炎病毒DNA YMDD变异的检测技术
拉米夫定治疗乙型肝炎耐药性的产生主要与HBV P基因突变有关,耐药株中多见P基因变异且相对集中于YMDD基序.YMDD变异的检测技术包括核苷酸序列测定法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析、基因芯片技术、聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法等.本文就乙型肝炎病毒DNA YMDD变异的检测技术作一综述.
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应用微板核酸杂交一ELISA技术对苏南地区病毒性肝炎患者及献血员TTV感染情况及基因分型的研究
应用微板核酸杂交一ELISA技术，按照Okamoto等发表的基因序列，选取TTV ORF1的保守序列作为内引物；包被探针选择一段I型、Ⅲ型同源的序列nt2350－nt2495，而显色探针I和显色探针Ⅱ则选择异源性大于50％的序列，并在显色探针的5＇端标上生物素。首先对患者及献血员标本进行套式PCR法扩增，然后将扩增产物与两条特异性探针夹心杂交，后加底物酶联显色，用该法对苏南地区328例病毒性肝炎患者和229名献血员进行TTV检测及分型分析。 结果发现328例病毒性肝炎患者，TTV感染率为10.4％(34/328)，其中急性甲型肝炎阳性率为5.7％(2/35)，急性乙型肝炎阳性率为8.7％(8/92)，慢性乙型肝炎阳性率为11.1％(15/135)，慢性丙型肝炎阳性率为3.2％(1/31，慢性非甲－戊型肝炎阳性率为22.9％(8/35)。研究发现，TTV阳性的上述患者输过血或血液制品者占67.6％(23/34)，表明TTV感染与输血和使用血液制品有一定关系。229名献血员TTV感染率为5.7％(13／229)。 对47例TTV阳性标本进行基因分型研究，把TTV分为两个型：I型和Ⅱ型，还有部分混合感染型，其比例为34:3:10；慢性肝炎与急性肝炎TTV感染者比例为32:15。表明苏南地区TTV感染者中，慢性肝炎感染TTV的机会多于急性肝炎，I型明显多于Ⅱ型。在献血员中，ALT升高与ALT正常人群TTV感染率分别为9.3％及4.8％，提示TTV存在无症状携带状态，有必要将TTV的检测列为献血员的筛查项目。
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乙型肝炎病毒C基因启动子双突变的检测意义
目的分析乙型肝炎病毒(HBV)C基因启动子(BCP)双突变与乙型肝炎临床表现及HBeAg表型的关系.方法针对BCP双突变的特点,设计一条通用捕捉探针、一条野生型和一条双突变显色探针.待测标本DNA经聚合酶链反应(PCR)扩增后分别与野生型和双突变显色探针杂交,然后用酶联免疫吸附试验(ELISA)显示杂交结果,判定BCP突变与否.结果 147例经证实为HBV DNA阳性的急慢性肝炎患者中共有51例双突变,其中42例为单纯双突变,9例为混合突变(双突变和野生型皆为阳性).117例慢性中、重型肝炎中共有36例BCP双突变,8例混合突变.78例HBeAg阳性患者中,有25例BCP双突变,其中7例为混合突变.65例HBeAg阴性患者中,有26例BCP双突变.结论慢性肝炎BCP双突变高于急性肝炎;BCP双突变对HBeAg的表达有一定影响;PCR微板核酸杂交ELISA技术是一种简便、特异的基因突变检测的新方法.
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广东地区TTV感染情况及基因分型
目的 调查广东地区TT病毒(TTV)感染流行情况和基因分型.方法 选取TTVORF1的保守序列作内外引物,Ⅰ型、Ⅱ型同源性极高的序列nt2464～nt2520作包被探针,异源性大于50%的序列nt2125～nt2159作显色探针Ⅰ和显色探针Ⅱ,采用微板核酸杂交-ELISA技术对280例肝功能损害的肝炎患者血清进行TTV检测及TTV基因分型研究.结果 检测出44例TTV阳性患者,检出率为15.71%.对44例TTV阳性患者的标本进行分型,Ⅰ型、Ⅱ型和混合型比例为30:4:10.慢性肝炎中TTV感染者与急性肝炎中TTV感染者比例为28:16.结论 在广东地区的肝炎疾病中,TTV有较高的发病率,且慢性肝炎感染TTV的机会多于急性肝炎,TTV可分为两个型:Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅰ型占68.18%,Ⅱ型占9.09%,Ⅰ型明显多于Ⅱ型.微板核酸杂交-ELISA技术特异性强,灵敏度高,分型准确快速,在临床上具有实用价值.
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泉州地区乙型肝炎病毒基因型分布特点及临床意义
乙型肝炎病毒(HBV)在逆转录过程中由于缺乏校对酶的作用,常常发生核苷酸的配对错误,因此其突变率较高,现已将HBV分为A～H 8个基因型[1].HBV感染呈一定的地域性分布,在我国主要以B、C、D基因型为主.但是有关基因型与HBV感染的致病性及临床意义尚不太清楚.我们应用聚合酶链反应(PCR)微板核酸杂交-酶联免疫吸附试验(ELISA)对HBV进行了基因分型,旨在探讨HBV基因型分布特点和临床的关系.
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PCR微板核酸杂交ELISA乙型肝炎病毒基因分型及意义
为了解本地区基因分型、流行分布情况以及与各种肝病之间的关系,我们对120例乙肝患者进行了HBV-DNA基因分型,现将结果报告如下.
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乙型肝炎患者血清中前S1蛋白、HBcAg及HBV DNA相关性临床研究
目的探讨乙型肝炎患者血清前Si(Pre-S1)蛋白、HBcAg、HBV DNA及HBV其他标志物的关系及临床意义,为评判HBV复制和病情发展提供新的思路与证据.方法对136例乙型肝炎患者血清中HBVDNA应用微板核酸杂交法;HBcAg采用ELISA间接法,两种抗体包被,反应孔内裂解Dane颗粒的酶标技术直接检测Pre-S1及HBV其他标志物同时进行ELISA检测. 结果血清中Pre-S1、HBcAg、HBV DNA检出率在HBsAg、HBeAAg抗-HBc组合中高,分别为33.3%、74.6%、85.7%,与HBV-M其它组合比较P＜0.01;HBeAg和HBcAg阳性组的HBVDNA、Pre-S1检出率高(91.7%、39.6%),其次为HBeAb和HBcAg阳性组;HBV DNA阳性组的Pre-S1、HBcAg检出率(27.5%、62.6%)明显高于阴性组(2.2%、8.9%),P＜0.001;Pre-S1阳性血清中HBcAg与HBV DNA检出率为96.4%、89.3%,与阴性组比较P＜0.001及P＜0.05;Pre-S1、HBcAg与HBV DNA检出率在各临床类型患者中,除慢性肝炎HBV DNA检出率高,且统计学意义(P＜.001)外,其它无特异性. 结论血清Pre-S1、HBcAg、HBV DNA和HBeAg均是反映乙肝病毒复制的敏感指标,具有较好的相关性.抗HBe的出现并不表示病毒复制停止,应参考其他病毒复制指标情况.乙型肝炎各临床类型HBV复制指标检出率仅HBVDNA具有特异性.
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微板核酸杂交技术定量检测乙肝病毒的临床应用
目的用微板核酸杂交技术准确定量检测患者血清乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)的含量,探讨其临床应用价值.方法用聚合酶链反应(PCR)法将患者血标本扩增后的产物,通过微孔板杂交显色对540例不同临床表现的乙型肝炎患者血清中HBV-DNA进行定量检测. 结果急性乙肝患者血清中HBV-DNA含量为(174.96±50.20)μg/L,乙肝病毒长期携带者血清中HBV-DNA含量为(94.32±41.31)μg/L,乙肝恢复期患者血清中HBV-DNA含量为(39.62±24.51)μg/L,乙肝疫苗免疫组的HBV-DNA含量＜1μg/L,各组之间比较差异有显著性(P＜0.01).结论微板核酸杂交技术-酶联免疫吸附试验检测方法能准确、快速进行HBV-DNA定量,与临床诊断相符,对于乙型肝炎的临床诊断、治疗方案的选择和疗效观察有指导意义.
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微板核酸杂交-ELISA方法对肝炎病人血清中HBV DNA的定量检测与分析
目的采用微板核酸杂交-ELISA技术测定肝炎病人血清中HBV DNA含量.方法 用PCR法将病人血清标本扩增后,与两条特异性探针夹心杂交,然后通过酶联显色对69例不同临床表现的肝炎患者血清中HBV DNA进行定量检测.结果 20例急性重型肝炎血清中的DNA含量超过2μg/L,88.24%的急性轻型肝炎患者和54.55%轻度慢性肝炎患者血清中的HBV DNA含量少于2μg/L,66.67%中度慢性肝炎患者血清HBV DNA含量在2～1000 μg/L的范围,75%重度慢性肝炎和45%急性重型肝炎血清中的HBV DNA含量超过1000μg/L.结论 微板核酸杂交-ELISA检测方法能准确、快速进行核酸定量测定,特异性强,灵敏度高,稳定可靠,易自动化,对于研究病毒感染量与临床病程的关系具有较大的现实意义.
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不同肝病患者血清HBV-DNA定量检测及其临床意义
目的探讨不同肝病患者血清中HBV-DNA的含量及其临床意义.方法采用微板核酸杂交-ELISA法,即采用PCR将患者血清标本扩增后,与两条特异性探针夹心杂交,然后通过酶联显色对37例急性肝炎、58例慢性肝炎、22例肝硬化、15例原发性肝癌患者血清中HBV DNA进行定量检测.结果13例HBV-DNA阳性急性肝炎患者血清中HBV-DNA浓度为105.0±60.3pg/ml,40例HBV-DNA阳性慢性肝炎为1 88.8±1 02.6pg/ml,1 4例HBV-DNA阳性肝硬化为98.4±57.2pg/ml,10例HBV-DNA阳性原发性肝癌为96.8±59.3pg/ml.血清中HBV-DNA的检出率以急性肝炎低,浓度以慢性肝炎高.结论不同肝病患者HBV的复制状态不同,HBV的持续复制是导致慢性肝炎反复发作和肝硬化、原发性肝癌的主要原因.
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乙型肝炎患者HBV DNA定量测定与临床疗效的关系
我们应用微板核酸杂交-核酸定量技术对86例乙型肝炎患者血清HBVDNA的定量测定以及其中11例应用IFNα 2b治疗3个月前后血清HBV DNA的变化情况.
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TTV基因分型的研究
目的调查华南地区TTV感染流行情况和基因分型。方法选取TTV开放读码枢1的保守序列作内外引物，G1、G2、G3、G4、G5、G6同源性极高的系列2160～2196nt作包被探针，异源性大于20%的序列作显色探针G1、G2、G3、G4、G5、G6，采用PCR微板核酸杂交ELISA技术对380例肝功能损害的肝炎患者血清进行TTV检测及TTV基因分型研究。结果检测出61例TTV阳性患者，检出率为16.0%。对61例TTV进行基因分型，G1型44例，G2型5例，G1、G2混合型感染10例，G3、G4各1例，尚未发现G5、G6型。慢性肝炎中TTV感染者与急性肝炎中TTV感染者比例两者相近。结论在华南地区的肝炎疾病中，TTV有较高的感染率；TTV存在四个基因型，主要为G1型，其次为G2型，尚未发现G5、G6型。
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乙型肝炎病毒对拉米夫定耐药的临床研究
目的:探讨拉米夫定对乙型肝炎病人抗病毒效果及YMDD变异株的发生情况.方法:观察拉米夫定治疗前及治疗后3个月、6个月、9个月肝功能(ALT)及免疫学指标的变化,并采用PCR微板核酸杂交ELISA技术检测HBV DNA含量及YMDD变异株(包括YIDD及YVDD突变株).结果:47例HBV DNA阳性的乙肝病人口服拉米夫定治疗9个月后74%的病人血清HBVDNA水平转阴(＜1pg/ml血清),伴有ALT水平正常.有17%的病人出现HBeAg血清转移(e抗原转阴、e抗体转阳).另有15%病人单纯HBeAg阳转阴.共有19%的病人出现YMDD变异株,分别于服药前3个月后1例,服药6个月后3例,服药9个月后又5例.其中有3例病人在服药期间出现YMDD耐药株,经加大拉米夫定用药3个月后,YMDD耐药株消失.仅1例病人加大用药剂量后耐药株不消失.结论:口服拉米夫定9个月,大多数病人血清HBV DNA转阴(＜1pg/ml),17%部分病人出现e抗原血清转移;19%的病人出现YMDD耐药.而e抗原血清转移绝大多数发生于HBV DNA低于100pg/ml血清的病人.
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肝炎患者TT病毒的感染调查及其基因分型
目的:调查东莞地区TTV感染流行情况和基因分型.方法:选以G1、G2、G3、G4、G5、G6同源性极高的系列nt2160-nt2196作包被探针,异源性大于20%的序列作显色探针G1、G2、G3、G4、G5、G6,采用PCR微板核酸杂交ELISA技术对410例肝功能损害的肝炎患者血清进行TTV检测及TTV基因分型研究.结果:检出66例TTV阳性患者,检出率为16.0%.对66例TTV进行基因分型,G1型47例,G2型6例,G1、G2混合型感染11例,Gs、G4各1例,尚未发现G5、G6型.结论:在东莞地区的肝炎病人中,TTV的感染率为16.0%;TTV基因型主要为G1型,其次为G2型,未发现G5、G6型.
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微板核酸杂交-酶联显色检测性病沙眼衣原体DNA
目的建立微板核酸杂交-ELISA方法,检测性病沙眼衣原体.方法采用PCR、核酸杂交和ELISA三大生物技术相结合,建立微板核酸杂交ELISA法,并用此法分别同McCoy细胞培养和免疫学方法检测307份性传播疾病标本进行比较.结果微板核酸杂交-ELISA法检测的阳性率为40.39%(122/307),高于细胞培养的9.77%(30/307)和免疫诊断的12.05%(37/307).结论微板核酸杂交-ELISA技术检测性病沙眼衣原体灵敏度高、特异性好、简便快速.因此,该方法具有很强的实用价值和发展前景.
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持续感染乙肝病毒e抗原血清转换与基因变异的关系
目的:了解乙肝病毒慢性持续感染e抗原血清转换中前C基因及C基因启动子变异的关系.方法:HBV-DNA阳性且e抗原/或e抗体阳性的慢性乙型肝炎患者各30例,以PCR结合微板核酸杂交-ELISA方法检测乙肝病毒前C基因(nt1896、nt1899)及其基本核心启动子(BCP,nt1762、nt1764)变异.结果:不论前C基因还是BCP变异,均与e抗原血清转换相关(P<0.05);不论e抗体阳性组还是e抗原阳性组,BCP变异均高于前C基因变异(P<0.05),但二者均不相关(P>0.05).结论:乙肝病毒C基因启动子与前C基因的变异是随机的,都可下调HBeAg的表达,前者更易于发生变异.
