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cDNA微阵列技术比较胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞的基因差异表达
目的从分子水平探讨脑和脊髓来源的神经干细胞(NSCs)的生物学特性,并鉴定这两种来源的NSCs的分子表达差异.方法应用cDNA微阵列技术对脑和脊髓来源的NSCs的基因表达情况进行检测和比较,在成功分离、培养和鉴定脑和脊髓两种来源的NSCs的基础上,抽提细胞总RNA并纯化、定量,以32P逆转录标记合成cDNA探针.AltasTM cDNA Expression Array(Clontech Co)与探针杂交、洗膜后在磷屏上曝光并扫描成像,以Arrayvision5.1软件分析杂交结果.结果cDNA阵列膜上覆盖的1 176个基因中,绝大部分基因表达无明显差异,但也有14个基因在两种来源的NSCs中的表达有显著差异,其中8个在脑来源的NSCs中表达较高,6个在脊髓来源的NSCs中表达较显著.在两种来源的NSCs都明显表达的基因中,许多分子如P-选择素(P-selectin)、钙黏素(cadherin)、乙酰胆碱受体α、cyclins、某些转录因子和原癌基因等可能在NSCs的自我更新(增殖)、神经球形成和保持不分化状态中起重要作用.结论两种来源的NSCs的生物学特性基本相同,但也存在一定的差异.
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Erk信号途径在B104 CM诱导神经干细胞向少突胶质细胞前体分化中的作用
目的 讨细胞外信号调节激酶(Erk)信号途径及下游转录因子c-fos、c-jun等在神经母细胞瘤B104细胞系来源的条件培养基(B104 CM)诱导神经干细胞(NSCs)向少突胶质细胞前体(OPCs)分化中的作用.方法从形态学上观察Erk1/2特异性抑制剂U0126阻断对B104 CM诱导NSCs向OPC8分化的影响;分别以Western blotting和RT-PCR法检测对照组、B104 cM诱导组和U0126预孵组NSCs中Erk的磷酸化和转录因子c-fos、c-jun、c-myc的表达情况.结果 U0126预孵可阻断B104 CM诱导的NSCs向OPCs分化;B104 CM可引起NSCs中Erk1/2迅速磷酸化和c-fos、c-jun mRNA表达上调,该作用可被U0126阻断.结论 B104 CM通过活化Erk信号途径及其随后上调转录因子c-fos、c-jun的表达诱导NSCs向OPCs分化.
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中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外生长特性的比较
目的比较相同发育阶段中枢神经系统不同部位来源的神经干细胞在体外的生长特性. 方法胚胎小鼠(E14)于无菌条件下分别分离并收集皮层、纹状体、间脑、中-后脑和脊髓,各部分制备成单细胞悬液,接种在添加有纤维细胞生长因子(FGF)的无血清培养液内,神经干细胞克隆生成后,经免疫细胞化学方法鉴定细胞特性,并在相同条件下进行传代,相差显微镜下观察克隆生成和细胞的迁移特性. 结果在添加有纤维细胞生长因子的无血清培养液中,少量接种的单个细胞会增殖并形成悬浮于细胞培养液中的细胞克隆.这些克隆具有生成新克隆并分化成神经元和胶质细胞的能力.在相同发育阶段,皮层、纹状体、间脑均可生成悬浮的克隆,其中皮层生成的速度快,纹状体、间脑较慢,中-后脑、脊髓生成克隆的速度慢;生成克隆后,皮层克隆的贴壁能力差,贴壁的克隆少有细胞从其底部迁出,纹状体、间脑克隆较易贴壁,贴壁克隆底部有明显的细胞迁出,中-后脑、脊髓生成的克隆不易悬浮,很快贴壁,在贴壁克隆的底部有大量的细胞迁出. 结论在无血清培养液中,神经干细胞可在体外增殖、传代并分化生成神经元和胶质细胞,不同部位来源的神经干细胞在体外生成克隆的速度和细胞迁移性不同,这可能同体内特定部位细胞的发育特性有关.
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DNA结合抑制因子2在大鼠脑室管膜前下区神经干细胞发育中的表达
目的 讨DNA结合抑制因子2(Id2)在大鼠脑室管膜前下区(SVZa)神经干细胞(NSCs)发育分化中的作用.方法 运用RT-PCR、Western blotting、免疫组织化学技术,观察Id2在不同发育阶段SVZa-喙侧迁移流(RMS)-嗅脑(OB)流通道中的时空表达模式. 结果从空间上看,Id2在RMS表达始终高,SVZa次之,在OB表达弱;从发育的时间来看,Id2在各区域胚胎时期表达均比刚出生时强;在OB和RMS区,成年比刚出生时表达强,老年仍有较强表达;在成年SVZa表达比刚出生时弱. 结论 Id2在SVZa神经干细胞的发育学表达模式提示,Id2可能有促进SVZa神经干细胞增殖和抑制其在RMS迁移区分化的作用.
关键词： DNA结合抑制因子2 室管膜前下区 神经干细胞 发育 逆转录-聚合酶链式反应 免疫印迹法 免疫组织化学 大鼠 -
人胚胎纹状体区神经干细胞体外生物学特性
目的探讨人胚胎纹状体区神经干细胞在体外的生物学特性.方法从16～20周人胚胎纹状体区分离培养神经干细胞,在体外进行传代、分化,应用免疫组织化学荧光染色等方法,对此区神经干细胞在体外增殖和分化等情况进行研究.结果纹状体区神经干细胞在体外原代培养扩增1月内分裂增殖速度快,在含有EGF和bFGF的培养基中生长为良好,平均倍增时间为3～4 d.分化培养后可以形成各种神经细胞,在原代培养后2周分化情况好,分化为神经元比例高,约占50%左右,在原代培养8周以后分化为神经元的比例下降,约占20%左右.结论人胚胎纹状体区的神经干细胞在体外有较强的自我更新和增殖能力,并表达了干细胞的原始特征,在体外传代过程中,增殖速度随着时间不断下降,其分化为各种神经细胞的能力也不同.培养基中的有丝分裂原对于神经干细胞的增殖和分裂的影响不同.神经球并非均质的,内部仅有部分细胞在分裂增殖.
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神经干细胞与脑源性神经营养因子联合治疗对老年性痴呆鼠基底前脑一氧化氮合酶阳性神经元的影响
目的探讨神经干细胞(NSCs)与脑源性神经营养因子(BDNF)联合应用对老年性痴呆鼠基底前脑一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元的影响.方法切断成年SD大鼠左侧穹窿海马伞(FF),基底前脑行神经干细胞移植,同时持续侧脑室注射BDNF,4周后行组织化学染色结合图像分析技术观察各组大鼠基底前脑NOS阳性神经元数量和形态学参数的变化.结果损伤后1个月,损伤侧基底前脑内侧隔核(MS)和斜角带垂直支(VDB)内可观察到NOS阳性神经元明显减少,分别为正常组的35.5%和55.8%,(与正常组相比P＜0.01);移植组NOS阳性神经元数恢复到正常组的74.7%和95.7%,(与损伤组相比P＜0.01);联合组NOS阳性神经元数达到正常组的115.2%和151.3%,(与移植组相比P＜0.05及P＜0.01).细胞形态学参数提示,移植组NOS阳性神经元中含部分中等大小的未成熟细胞;联合组中该中等大小的细胞更多.结论神经干细胞移植与BDNF联合治疗,对AD模型鼠基底前脑MS、VDB的NOS阳性神经元有明显的补充和保护作用,并且联合治疗效果比单纯神经干细胞移植效果更佳.
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NGF和GDNF基因重组逆转录病毒体外感染神经干细胞及其鉴定
目的探讨神经干细胞(NSC)直接作为基因靶细胞能否被重组逆转录病毒感染以及感染后目的基因的表达. 方法分别用NGF和GDNF基因重组逆转录病毒上清液感染NSC 2d;G418筛选后加入bFGF扩增培养;取感染后的NSC培养液(NGF/GDNF条件培养液)培养PC12细胞和中脑腹侧神经元;用免疫组织化学染色方法检测中脑腹侧多巴胺神经元的形态改变以及感染后NS C对目的基因的表达. 结果经G418筛选后,约50%感染NGF和GDNF基因重组逆转录病毒的NSC呈 G418抗性;这些感染后的NSC开始分化,分裂球向四周长出放射状突起,部分细胞沿突起向外迁移生长;感染NGF基因的NSC呈星形,胞体较大,突起较粗.感染GDNF基因的NSC呈梭形 ,胞体较小,突起较长.经NGF条件培养液培养的PC12细胞,数量增多,突起明显变长.经G DNF条件培养液培养的中脑多巴胺神经元(TH阳性细胞)其胞体亦增大,突起伸长.大部分G41 8抗性的NSC出现NGF和GDNF免疫染色. 结论神经干细胞可直接作为基因靶细胞,能被NGF和GDNF基因重组逆转录病毒有效感染而表达和分泌有生物学活性的NGF和GDNF.
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维甲酸诱导大鼠胚胎脑神经干细胞P450RAI基因的表达
目的探索全反式维甲酸(RA)对神经干细胞和分化细胞P450RAI表达的影响. 方法从大鼠胚胎脑中分离神经干细胞,用EGF促进其增殖,再用不同浓度的RA单独处理,在不同时间用RT-PCR测定神经干细胞及分化细胞的P450RAI表达水平. 结果 1 μmol/L RA处理神经干细胞,P450RAI mRNA水平高.1 μmol/L时2 h就可检测到神经干细胞P450RAI mRNA的生成,4～12 h达到高峰,随后迅速下降,24 h几乎检测不到P450RAI mRNA.间断给予RA,P450RAI的表达随之下降.在EGF诱导生成的分化细胞中无P450RAI表达,而在RA处理的分化细胞中有少量表达. 结论神经干细胞表达P450RAI对RA有浓度依赖性并需要RA的持续存在,随着神经干细胞分化为神经细胞,其表达量下降.
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穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用
目的探讨穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的影响. 方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14d后取两侧海马制成提取液;将神经干细胞接种于3块24孔培养板中,每板分成切割组、正常组和对照组各8孔,前2组分别加入切割侧和正常侧海马提取液.第1、2块分别于第7d和14d时行MAP-2免疫荧光检测;第3块于10d时行AChE组织化学染色.计数MAP-2和AChE阳性神经元数,观察胞体大小和突起长度. 结果切割组第7d时MAP-2阳性神经元较多,胞体大、突起长,14d时细胞进一步迁移、成熟;正常组第7d时仅见少量突起短的MAP-2阳性神经元,14d时细胞稍增多,突起稍增长:对照组第7d时未见MAP-2阳性神经元,14d时仅有少量胞体小、突起短的MAP-2阳性神经元.第10d切割组AChE阳性神经元较多,突起多而长,正常组仅见少量无突起的AChE阳性神经元,对照组未见AChE阳性神经元. 结论穹窿海马伞切割侧海马提取液可明显促进神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元.
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NGF/GDNF基因修饰神经干细胞植入AD模型鼠脑内的存活、分化及表达
目的观察NGF/GDNF基因修饰神经干细胞(NGF-NSC和GDNF-NSC)在AD模型鼠脑内的存活、分化及基因产物的表达. 方法将BrdU标记的NGF-NSC和GDNF-NSC单独和联合移植入穹窿海马伞切断的大鼠侧脑室内.移植后3周,用免疫组织化学方法对脑切片进行BrdU\,Nestin\,GFAP\,NF\,NGF及GDNF单标或双标染色. 结果脑室内见到大量BrdU阳性细胞.部分移植细胞向脑实质迁移,在切口周围、穹窿海马伞、海马、胼胝体、隔区、室管膜下区及血管壁旁均可见到BrdU阳性细胞.在皮质和切口周围可见较多的BrdU+GFAP双标细胞;在海马内可见较多的BrdU+NF双标细胞;在脑室内,两者均可见到.在脑室、皮质和海马等处均检测出BrdU+NGF和BrdU+GDNF免疫双标阳性细胞. 结论 NGF/GDNF基因修饰NSC能在宿主脑内较好地存活,并能分化成神经元和星形胶质细胞,而且能分别表达外源基因产物NGF和GDNF.
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Sertoli细胞诱导大鼠胚胎中脑神经干细胞定向分化的研究
目的研究Sertoli细胞对胚胎中脑神经干细胞的营养及向多巴胺能神经元分化的诱导作用.方法将大鼠Sertoli细胞与胚胎13 d大鼠中脑神经前体细胞体外共培养5、7、10、14 d后,免疫荧光检测神经干细胞标记物Nestin、神经元前体细胞标记物β-Ⅲ tubulin、多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况.结果随着共培养时间的延长,神经干细胞中nestin阳性细胞数量逐渐减少,β-Ⅲtubulin阳性细胞数在共培养7 d时较多,TH阳性的神经元在共培养10 d时数量多.而且在各时间段TH阳性细胞数均多于单独培养的神经前体细胞.结论Sertoli细胞能够诱导与其共培养的胚胎中脑神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元.
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人神经营养素-3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测
目的构建具有生物活性的人神经营养素-3(NT-3)基因重组腺病毒表达载体.方法从人脑组织mRNA中扩增NT-3基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的质粒.再与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-NT-3).用pAd-NT-3转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-NT-3). 结果NT-3基因RT-PCR扩增产物约801 bp.Adeno-NT-3 PCR鉴定为正确重组子.RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA及Western blot检测显示,Adeno-NT-3能在其转染的293细胞表达和分泌NT-3.这种NT-3能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞. 结论应用体外连接法成功构建了人NT-3基因重组腺病毒表达载体,其表达产物具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞的活性作用.
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移植神经干细胞促进脊髓全横断大鼠结构与功能修复的研究
目的探讨移植神经干细胞对脊髓全横断性大鼠部分结构与功能修复的影响.方法在脊髓全横断处移植神经干细胞60d后,在横断处下方3mm注射荧光金逆行标记轴突再生的上运动神经元,用免疫组织化学检测神经干细胞在宿主内的分化,同时用体视学方法观测脑干红核和大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层的神经元密度变化.用BBB评分法和爬网格法观测大鼠后肢运动功能的恢复等.结果移植的神经干细胞能在宿主内存活并向前后方向迁移到脊髓内,部分神经干细胞分化为GFAP、NF-200和GAP-43阳性细胞.移植神经干细胞后在红核和感觉运动区内锥体细胞层可见有被荧光金标记的神经元胞体,脊髓横断处附近脊髓组织的溃变程度减轻,红核及躯体感觉运动区内神经元密度高于未移植组,大鼠后肢的自主运动功能明显好于未移植组.结论 神经干细胞移植入损伤脊髓后能分化为神经元及神经胶质细胞,能减轻脊髓的继发性损伤,保护受损伤的神经元,促进运动功能的恢复.
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磷酸化细胞外信号调节激酶在海马提取液诱导神经干细胞向神经元分化过程中的表达
目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路在海马提取液诱导神经干细胞向神经元分化过程中的作用. 方法 切割12只SD大鼠右侧穹隆海马伞,14d后分别取切割侧和正常侧海马制成匀浆,离心收集上清液,蛋白定量后备用.将获取的鼠胚海马源性神经干细胞培养在24孔板中,分成3组,每组8孔,于无血清条件下,切割组加切割侧海马提取液;正常组加正常侧海马提取液;对照组不加上述海马提取液.培养14d后进行微管相关蛋白2(MAP-2)与p-ERK的免疫荧光双标检测. 结果 MAP-2阳性神经元数量、胞体面积和细胞周长在切割组、正常组和对照组中依次减少,3组之间均有显著性差异.MAP-2、p-ERK免疫荧光双标细胞数量在切割组、正常组、对照组中也依次下降,但双标记细胞数占MAP-2阳性神经元数的百分比却反而依次增加,两者3组之间均有显著性差异,双标细胞大多为欠成熟细胞. 结论 切割穹隆海马伞侧海马提取液较正常海马提取液有明显促使神经干细胞向成熟神经元分化的作用;形态学初步证实ERK信号转导通路可能与神经干细胞向神经元分化有关.
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人脐血来源神经元样细胞的分离与鉴定
目的探讨人脐血单个核细胞(MNCs)体外培养后的神经元特有分子表达和形态特征. 方法密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,部分接种于培养瓶内,部分细胞接种在6孔培养板内.倒置显微镜下观察培养细胞形态变化.RT-PCR方法检测MNCs培养前后神经细胞标志物nestin、NF-M及MAP2 mRNA的表达,培养14d后行免疫细胞化学鉴定. 结果培养前脐血MNCs胞体小呈圆形,神经干/前体细胞特异性抗体nestin阳性细胞、神经元特异性抗体MAP2和NF-M阳性细胞散在分布,阳性率分别为1.5%、3.4%和2.5%.培养14d后,倒置显微镜下可见一些有多个粗长突起的细胞群,相邻细胞突起连成网状;免疫细胞化学检测MAP2、NF-M染色阳性细胞成片状分布,阳性率分别为27.6%和21.7%.RT-PCR检测脐血单个核细胞nestin、NF-M及MAP2基因表达呈阳性,培养14d后上述基因表达上调. 结论脐血细胞中可能沉寂有神经(干)前体细胞,经体外培养后能分化为具有一定形态的类神经细胞.
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施万细胞对植入大鼠脊髓损伤区内的神经干细胞存活和分化的影响
目的探讨施万细胞对植入损伤脊髓内的神经干细胞的存活及其分化的影响. 方法分离和克隆新生大鼠海马组织的神经干细胞;同时获取坐骨神经和臂丛神经,从中分离和纯化施万细胞.在移植前先用核荧光(Hoechst33342)标记神经干细胞.实验组为神经干细胞和施万细胞联合移植入大鼠脊髓半横断处,对照组为单独神经干细胞移植.应用免疫组织化学和酶组织化学技术,在移植后7d、14d、21d和30d分别观察神经干细胞的存活和分化情况. 结果实验组的神经干细胞比对照组迁移的更远,分化为神经丝蛋白染色阳性神经元样细胞的数量比对照组的多,并且有较长的突起长出.在30d实验组中,移植的神经干细胞有部分呈乙酰胆碱酯酶(AchE)染色阳性.而在对照组中,移植区内仅有少数呈AchE染色弱阳性的神经干细胞. 结论在脊髓损伤处,施万细胞可促进移植的神经干细胞存活、迁移和向神经元样细胞分化;有些神经元样细胞能长出较长的突起,有些呈现乙酰胆碱酯酶活性.
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体外诱导的皮肤源性神经干细胞在大鼠受损伤脊髓内的存活、分化和迁移
目的探讨经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能否在大鼠脊髓半横断损伤处存活、迁移和分化.方法应用转染绿色荧光蛋白基因新生大鼠的皮肤在体外经分离细胞、培养、诱导增殖以及用免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞等过程,将诱导产生的皮肤源性神经干细胞移植入大鼠脊髓半横断损伤处,30 d和60 d后用免疫细胞化学染色法观察移植细胞的存活、迁移和分化.结果皮肤分离细胞在培养10 d时,呈悬浮生长的细胞已增殖成若干细胞球,并呈nestin免疫细胞化学阳性染色,表明是神经干细胞球.在体内可观察到脊髓损伤处有许多带有绿色荧光的移植皮肤源性神经干细胞,有些还迁移到较远的宿主脊髓组织内.存活的移植细胞有些呈现nestin阳性、MAP2阳性及GFAP阳性.结论经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能够在受损伤的大鼠脊髓内存活、迁移并分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞.
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骨髓基质细胞分泌蛋白的蛋白质质谱分析
目的 通过Shotgun蛋白质组学分析,初步检测骨髓基质细胞(BMSCs)条件液中可能含有的蛋白质.方法 将BMSCs条件液混匀后经超滤浓缩分为大于5kD和小于5kD两部分,并培养神经干细胞(NSCs),观察其后代中神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例,鉴定出能调节NSCs分化的部分,并进行Shotgun蛋白质组学分析.结果 BMSCs条件液分子量大于5kD的部分可以调节NSCs向神经元和少突胶质细胞方向分化,这部分条件液先经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)发现大部分蛋白集中在14kD以上,将蛋白条带酶解以后,经Shotgun分析共鉴定到456种蛋白质,其中154个相似蛋白质,17个假想蛋白质,56个未知蛋白质,剩余的229个蛋白质中大多为细胞骨架蛋白、分泌蛋白、信号转导蛋白、酶类和转运蛋白等.结论 BMSCs分泌的多种蛋白质对NSCs的分化起调节作用,明确了BMSCs条件液中可能含有的成分.
关键词： 骨髓基质细胞 神经干细胞 Shotgun蛋白质组学分析 -
Pax-6在大鼠发育脑喙侧神经干细胞迁移流中的表达
目的了解大鼠脑发育过程中,喙侧神经干细胞迁移流中不同时期Pax-6表达水平的时空差异.方法用BrdU对胚胎14 d、出生后0、1和7 d的Wistar大鼠行活体标记,取各时相点鼠脑,冰冻切片,行BrdU、Nestin、Pax-6和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色,观察Pax-6在脑内增殖细胞中的表达情况,比较在上述4个时相点,Pax-6于室管膜前下区、迁移流主干部分和嗅球3个部分的表达差异.结果 1.在发育中大鼠脑内,Pax-6主要表达于神经干细胞内,在海马增殖细胞亦有较高表达.2.在喙侧神经干细胞迁移流内,Pax-6在迁移流主干部分的表达高于室管膜前下区和嗅球;在胚胎14 d的表达与出生后0 d和1 d相似,表达水平较高,出生后7 d迅速下降到很低水平. 结论在大鼠脑发育过程中,Pax-6主要表达于神经干细胞及海马增殖性细胞内,在大鼠出生后,随着大鼠脑的发育,Pax-6于喙侧神经干细胞迁移流的表达迅速减弱,但迁移流主干部分的表达始终高于室管膜前下区和嗅球.
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人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体的表达和生物学活性检测
目的 探讨人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体(Adeno-TrkC)在神经干细胞内的表达及其对神经干细胞的生物活性作用.方法 用RT-PCR检测Adeno-TrkC感染的293细胞的TrkC mRNA含量.用免疫细胞化学和Western blotting检测Adeno-TrkC感染的神经干细胞表达TrkC受体蛋白.在体外培养条件下,观察人神经营养素-3(NT-3)对感染了Adeno-TrkC的神经干细胞分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞的影响.结果 在Adeno-TrkC感染的293细胞和神经干细胞中检测到TrkC mRNA和TrkC受体蛋白,且表达产物和其配体NT-3结合后能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞,分化率达到55.2%,均高于其他对照组.结论 Adeno-TrkC能在神经干细胞内表达TrkC受体蛋白,这种TrkC受体蛋白具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性的作用,这为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础.
