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酵母呈现SARS冠状病毒S蛋白受体结合区及其鉴定
目的获得能在酵母表面正确折叠的SARS病毒S蛋白的受体结合区.方法通过PCR技术从pVAX1/S质粒扩增出编码S蛋白318至520氨基酸残基的cDNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体pYD1,构建pYD1-RBD重组质粒,转化酵母细胞,流式细胞仪检测所呈现的RBD片段.结果通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有RBD片段的表达,并且此表面呈现的RBD片段与针对RBD不同表位的2株单抗均能结合,SARS病毒免疫的小鼠血清抗体也能与该片段结合.结论酵母表面呈现的RBD保持了天然RBD分子的构象,为基于RBD的药物筛选和疫苗设计提供物质基础.
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SARS-CoV感染者血清IFN-γ和TNF-α的动态变化及其意义
目的探讨SARS患者血清IFN-γ和TNF-α在SARS冠状病毒感染免疫中的作用.方法应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定广州地区28例SARS冠状病毒感染患者双份血清IFN-γ和TNF-α的水平.实验数据采用两样本均数t检验法.结果 28例SARS冠状病毒感染者急性期血清IFN-γ和TNF-α水平比正常健康对照组明显增高(P＜0.05);恢复期血清IFN-γ水平比正常健康对照组明显增高(P＜0.05).感染病程第1周,患者血清IFN-γ水平达高峰,然后逐渐下降.SARS患者血清TNF-α水平在病程第2周达高峰,然后逐渐下降.结论 IFN-γ和TNF-α在SARS冠状病毒的致病与免疫过程中可能起重要作用.
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SARS冠状病毒刺突蛋白的研究进展
SARS冠状病毒S蛋白是病毒颗粒大的结构蛋白和重要的表面抗原.该蛋白在介导病毒颗粒与宿主细胞受体结合、融合的过程中起着关键作用.它是病毒中和性抗体的靶点,在疫苗研究和抗病毒治疗研究中均占有重要地位.本文就SARS流行以来有关S蛋白的研究作一综述.
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SARS冠状病毒S蛋白在HeLa细胞中的表达
目的探索非病毒载体转染的SARS冠状病毒S蛋白真核细胞内的定位和能否组装到细胞膜,及其在感染中可能发挥的作用.方法构建能够表达融合绿色荧光蛋白的SARS-COV S蛋白的质粒,通过非病毒载体转染HeLa细胞,激光共聚焦荧光扫描显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位;利用SARS患者康复血清进行蛋白印迹杂交,确定SARS-COV S蛋白在真核细胞中的存在形式.结果在镜下发现通过非病毒载体转染的S融合蛋白荧光弥散于被转染的整个细胞内,尤以细胞核区更为密集,而没有集中定位于细胞膜上.这种定位分布不随蛋白表达时间延长而发生显著变化;蛋白印迹杂交显示在80～90KD的区域有特异性条带.结论非病毒载体转染的SARS冠状病毒S蛋白分布于真核细胞核及胞浆内,而不能组装到细胞膜上;其在HeLa细胞中不是以完整形式存在,有被蛋白酶切割的可能性.
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SARS冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的原核表达与抗原活性检测
目的 从SARS冠状病毒M蛋白的线性重叠肽链文库中筛选出5个B细胞抗原表位,通过构建原核表达载体,表达抗原表位融合蛋白,并检测其抗原活性.方法 应用大肠杆菌高频密码子设计引物,通过PCR方法合成编码SARS冠状病毒M蛋白5个抗原表位(MKY1、MKY2、MKY3、MKY4和MKY5)的DNA片段,经克隆和测序分析,亚克隆至表达载体pET-CKS,转化大肠杆菌BL21;阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析;大量诱导表达抗原表位融合蛋白,亲和层析予以纯化;Western检测SARS病人阳性血清对融合蛋白的识别.结果 成功构建SARS冠状病毒M蛋白抗原表位的表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,融合蛋白表达量达到细菌总蛋白30%,经亲和层析纯化,融合蛋白可被SARS病人抗血清识别.结论 原核表达的抗原表位融合蛋白具有良好的抗原活性,为下一步进行SARS冠状病毒诊断试剂盒的开发研究奠定基础.
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SARS-CoV S蛋白表位的表达及鉴定
目的:制备SARS冠状病毒S蛋白串联表位重组蛋白,为SARS的防治提供新型抗原蛋白.方法:应用抗原表位分析软件分析S蛋白的表位.选取其中16个表位,设计并合成表位串联重组蛋白编码基因Z,构建其原核细胞表达重组体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达该重组表位蛋白Z,应用Ni离子亲合层析法纯化重组蛋白Z做抗原,采用皮下注射法免疫新西兰白兔.斑点杂交法测定抗Z-血清中S蛋白的抗体,ELISA法检测Z蛋白的抗原性.结果:构建了S蛋白重组表位蛋白Z的原核表达体,在BL21菌中表达了Z蛋白,Z蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗Z血清.斑点杂交分析显示,抗Z血清识别哺乳动物细胞中表达的S蛋白.ELISA检测结果显示,抗Z血清识别SARS冠状病毒抗原.结论:建立了制备SARS冠状病毒S蛋白重组表位蛋白的方法,为防治SARS提供了新型抗原蛋白Z.
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抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定
目的: 制备抗SARS冠状病毒(SARS-CoV) M 蛋白N端1～43氨基酸(aa)单克隆抗体(mAb), 并对其特性进行初步鉴定.方法: 用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb.用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株. Western blot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性, 并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAb Ig亚类.为分析mAb识别位点, 进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达, 以Western blot初步定位mAb识别位点.结果: 获得1株可分泌特异性抗SARS-CoV M蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株(3H9), Ig亚类鉴定为IgG2a, 轻链为κ型.Western blot显示其mAb可特异识别SARS-CoV M蛋白N端1～43aa, 间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应, 其识别位点位于M蛋白N端16～28aa.结论: 成功获得1株抗SARS-CoV M蛋白N端1～43aa mAb杂交瘤细胞, 并初步定位其识别位点.
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SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备
目的: 表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白), 并以表达产物为免疫原制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 采用RT-PCR方法, 从灭活的病毒抗原标本中扩增编码N蛋白的基因.测序确认后, 再亚克隆至原核表达载体中.从SDS-PAGE凝胶中回收原核表达产物后免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 从标本中扩增出1 269 bp的DNA, 测序结果证实为N蛋白基因. 将该基因克隆至原核表达载体中后, 在大肠杆菌中获得了较好的表达.表达产物经SDS-PAGE后, 在Mr约为43 000处可见1条明显的诱导表达带.Western blot的结果表明, 该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异的免疫反应.从SDS-PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠, 制备出3株抗N蛋白的mAb.这些mAb与SDS-PAGE凝胶上Mr约为43 000的蛋白带也呈现很强的免疫反应.结论: 所获的重组N蛋白及特异性mAb, 将为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的方法奠定了基础.
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SARS冠状病毒编码蛋白质及其基因分析的研究进展
2003年初, 一种严重的急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)从我国广东省迅速向周边地区蔓延.直到6月4日, 世界卫生组织(WHO)共接到来自全球29个国家和地区累计8 402起病例报告, 其中国内就有5 329人感染.在WHO的协调下, 全球10个国家的11个实验室, 于3月12日组成了合作研究网络.4月, 香港的研究人员宣布, 一种未知的新型冠状病毒(SARS-CoV)可能是SARS的病因[1]. 随后, 加拿大[2]、美国[3]和中国[4]的科研人员相继公布了SARS-CoV的全基因组序列.5月13日, 德国科学家在比较其他已知冠状病毒的基础上, 发表了SARS-CoV的一种主要蛋白酶的三级结构[5].研究SARS-CoV的结构特性、分布变异、传染途径、病理过程与临床表现, 对防治进而攻克传染性非典型肺炎具有十分重要的意义.本文将对SARS-CoV的编码蛋白、基因组序列分析以及系统发生等进行综述.
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逆转录套式PCR检测粪便样本中的SARS冠状病毒
为了观察SARS冠状病毒在SARS患者粪便中的存在规律,建立了检测SARS冠状病毒RNA的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并应用该方法检测了241份SARS患者粪便样本.部分PCR产物应用测序技术进行验证.RT-PCR 的灵敏度为10-10稀释度的病毒原液(原液为108TCID50/ml).241份粪便样本的总体检出率为24.1%(58/241),其中发病后的前10d和20d的检出率均为50.0%.随着发病时间的延长,阳性检出率呈下降趋势.应用RT-PCR从粪便中检测SARS冠状病毒是可行的,在发病50d以后仍有17.0%左右的阳性检出率,提示SARS恢复期患者具有排毒的可能性,给后续的卫生防疫措施提供了一定的参考数据.
关键词： 逆转录-聚合酶链反应 SARS冠状病毒 检测 粪便 -
SARS冠状病毒Mc区原核表达及包涵体复性的研究
构建SARS冠状病毒M蛋白膜内区(Mc蛋白)基因(Mc区)融合表达载体,表达并复性该蛋白.克隆Mc区,构建融合表达载体pET-32a(+)/Mc,融合表达Mc蛋白.纯化表达蛋白,采用逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂复性融合蛋白.用复性蛋白免疫兔产生抗血清,复性蛋白与SARS患者血清和健康人血清反应鉴定复性结果.结果显示,复性蛋白免疫家兔后产生抗血清,该复性蛋白与SARS患者血清特异结合,表明已成功复性该表达蛋白.为SARS疫苗和诊断试剂的研制奠定基础.
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SARS病毒BJ01株核壳蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定
通过RT-PCR从SARS病毒BJ01株的RNA中扩增全长N基因,经凝胶回收后插入pBAD/TOPO ThioFusion表达载体.然后在Top10中利用阿拉伯糖进行诱导表达,在优化的条件下,表达产物以可溶性为主,表达量约占细菌可溶性总蛋白的47%.表达产物采用ProBond蛋白纯化系统纯化后,目的蛋白约占67%.经免疫印迹法检测,表达产物与SARS病人恢复期血清和兔的抗血清均可进行特异反应.BJ01株核壳蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达为后续的ELISA试剂盒的研制奠定了基础.
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SARS的病理特点
SARS的病理很有特点:第①周机体动员了非特异性免疫机制,第②周病毒溶解细胞反应破坏了大量免疫细胞,迟发型变态反应引起重症患者的非心源性肺水肿,第③周病情好转后部分患者可引起肺硬变和肺心症.
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基因芯片技术快速检测SARS病毒
本研究以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准,研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片,芯片探针长度为70nt,相邻探针序列重复25nt,共660条病毒探针,覆盖了SARS冠状病毒的全部序列,另外设计了内对照探针和阴性对照探针.应用该基因芯片对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测,结果表明基因芯片技术检测SARS冠状病毒灵敏度高、特异性强、准确性好,稳定快速,在检验检疫中应用是可行的.
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基因芯片技术快速检测SARS病毒
以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准,研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片,芯片探针长度为70nt,相邻探针序列重复25nt,共660条病毒探针,覆盖了SARS冠状病毒的全部序列,另外设计了内对照探针和阴性对照探针.应用该基因芯片对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测,结果表明基因芯片技术检测SARS冠状病毒灵敏度高、特异性强、准确性好,稳定快速,在检验检疫中应用是可行的.
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逆向进化:SARS CoV非自然起源之关键
我们已从临床、流行病学和分子进化之反常等几个方面阐明了SARS CoV的非自然起源.本文将全面深入描述SARS CoV系统发育中发生的逆向进化这一关键过程.逆向进化定义为“再获得祖先状态”,常发生在生存景观或环境的变化使生物不适应甚至无法生存时.SARS CoV的逆向进化主要表现:①2003～ 2004年广州爆发SARS CoV与2002～ 2003年流行早期病毒之亲缘较晚期更近以及流行中SARS CoV阳性选择压逐渐下降;②在不同宿主不同流行阶段,均可发现SARS CoV受体结合位点重要氨基酸(尤其487、479二位)和SARS CoV ORF8特征性29-nt的逆向进化;③2003 ～ 2004年广州爆发病例的SARS CoV中ORF 1a基因nt.6295突变,导致SUD出现一个终止密码子,使其基因发生回复变化,不能适应人类宿主.由于SARS CoV:①离祖先病毒株仅约4年多时间,故无法在人类亲缘关系很近的动物体内做适应试验;②迅即进入人类全新之环境,易保持祖先的永久遗传变异;③流行中阳性选择压不断降低,为逆向进化创造条件.故进入人群一年后毒力和传播力明显下降,不久即在人类和自然界消失,这是其佳归宿.所以,其起源、进化和消失过程假设如下:蝠株(亲代3)→基因改造株1(亲代2)→基因改造株2(亲代1)→2002～2003年狸株→2002～ 2003年人株→2003～2004年狸株→2003～ 2004年人株→？→？→消失.因事关人类健康,再次吁请卫生部正式向WHO申请组织专家委员会,实证自然界和人群中已无SARSCoV,并予宣布.
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SARS CoV非自然起源
我们在国际上首次判明自然界根本不存在SARS CoV贮存宿主,其由Bt-SLCoV经“非自然(基因改造)”产生.此意味着人类已进入经“新型人工病毒”致全球性流行的时代.我们按透过现象看本质之思维,从SARS流行病学和临床特征明显反常这一事实,进一步阐明其非自然之起源:①流行早、中期广东省病例均在广州的西面和南面,而东面和北面无1例；②2003-12 ～ 2004-01,广州爆发4例,症状轻,无续发,均因SARS CoV在人群中逆向进化所致,随后在2004-03 ～ 04实验室爆发9例,亡1例,且极具超级传播性,与2002～2003年流行一致,未经逆向进化；③作为特定传染源——受染果子狸仅在深圳和广州2个动物市场,可为非自然引入所乘.故人类正面临空前威胁,应群起应对.
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现在自然界和人群中已不存在非典病毒
非典(SARS)流行至今已近10年,虽被进行了全面广泛深入的研究,但其起源和贮存宿主仍不明确.我们发现SARS的流行自然史和迄今世界上的传染病均不相符,其原因是非典病毒(SARS CoV)经“非寻常进化”方式,很可能是“非自然”方式进入人群.对几乎所有的SARS CoV基因变异、进化、跨种传播等既往研究,我们进行重新审视并综合分析,发现以往研究多从微观和一个侧面思考问题,而本文则从全新之视角,结合流行病学和生物进化理论,首次阐明:SARS CoV经历了逆向进化；自然界根本不存在SARS CoV的直接祖先和贮存宿主,故其流行后即从人群和动物界消失.因此建议卫生部正式向WHO等有关国际机构申请组织专家委员会,实证自然界和人群中已无SARS CoV,并予宣布.
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不同发病时期SARS病例的临床分析
目的研究不同时期发病的SARS病例的临床特点.方法将同一所医院内不同时期发病的SARS病例,按照发病时间的先后分为A、B、C三组,对比其发热持续时间、胸片、重症患者比率、住院时间.结果 A组和B组的各项观察指标差异均无显著性,而C组的发热持续时间、胸片病变范围、住院时间、重症患者比率均少于A、B两组,反映A、B两组的病情比C组更为严重,而A、B两组病例的病情程度较为接近.结论早期的SARS患者病情更为严重,而后期感染的患者病情较轻.病毒变异和不同剂量的免疫球蛋白治疗可能与不同发病时期患者病情的差异有关.
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SARS冠状病毒模型猴的抗体消长
目的观察SARS冠状病毒感染中国恒河猴后,冠状病毒抗体在动物体内的动态变化过程,为评价疫苗效果提供检测指标.方法用从我国SARS病人分离经Vero-E6细胞培养扩增的SARS冠状病毒,经过鼻腔接种10只恒河猴和10只食蟹猴.定期采血,分离血清,检测其血清IgG和IgM抗体滴度.结果接种病毒后的前8天,SARS冠状病毒血浆抗体呈阴性,与人类SARS病人检测结果相似[1,2].12/20的动物在接种病毒8～14天后抗体呈阳性,16/18在15～21天阳性,14/16在22～35天呈阳性,36天后,10/10动物呈阳性,SARS动物模型猴抗体总阳性率为80%.结论用恒河猴制作的SARS冠状病毒的动物模型进行疫苗和药效评价,其抗体消长情况可作为药物筛选、疫苗评价的重要指标.
