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DNA甲基化及其芯片技术研究进展
DNA甲基化是早发现的、基本的表观遗传学机制.大量研究表明DNA甲基化与人类疾病有密切关系.DNA甲基化改变包括全基因组水平DNA低甲基化和CpG岛局部高甲基化.DNA甲基化分析方法发展迅速,尤其是近年来,DNA甲基化芯片技术已成为高通量分析DNA甲基化的快速、有效的方法.DNA甲基化芯片主要包括CpG岛微阵列和甲基化寡核苷探针微阵列.本文围绕DNA甲基化相关概念、发生机制、与疾病的关系及主要研究方法等方面进行综述.
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Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b和HMT在不同结肠癌细胞系的表达及意义
目的:探讨不同结肠癌细胞系中表观遗传学酶谱的表达水平.方法:RT-PCR分别检测结肠癌细胞系HT-29、Lovo和Caco-2中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和HMT mRNA表达水平.结果:Dnmt3b mRNA在结肠癌细胞系HT-29、Lovo中高度表达,Dnmt1与HMT次之,Dnmt3a表达水平低;Dnmt3b、Dnmt3a在不同结肠癌细胞系之间的表达水平存在显著的差异.结论:不同分化程度的结肠癌细胞系可能存在不同的表现遗传学发生机制;Dnmt3b在建立和维持结肠癌细胞系DNA甲基化模式中可能起更为重要的角色.
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表观遗传学修饰与肿瘤耐药关系的研究进展
本文就DNA甲基化和组蛋白乙酰化与恶性肿瘤耐药的关系及其在逆转耐药中的作用方面的研究进展述之如下.1 DNA甲基化和组蛋白乙酰化1.1 DNA甲基化DNA甲基化是指在DNA复制以后,在DNA甲基化酶的作用下,将S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基转移到DNA分子中胞胞嘧啶残基的第5位碳原子上,随着甲基向DNA分子的引入,改变了DNA分子的构象,直接或通过序列特异性甲基化蛋白、甲基化结合蛋白间接影响转录因子与基因调控区的结合.
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6Co γ射线诱发小鼠DNA甲基化改变
目的 探讨基因组启动子甲基化谱及DNA甲基化酶1(DNMT1)表达量在60Co-γ射线照射小鼠各组织的变化及其意义.方法SPF级C57BL/6J雄性小鼠12只随机分为对照组和照射组,照射组小鼠接受4Gy60 Co-y射线单次全身照射后,均眼球摘除取血后处死,收集各脏器组织,进行外周血白细胞计数和骨髓嗜多染红细胞微核计数,应用甲基化DNA免疫沉淀-芯片(MeDIP-chip)杂交技术对y射线照射小鼠肝组织基因组启动子(promoter) CpG岛甲基化改变进行分析,并采用免疫组化(SP)法和蛋白质印记( western blot)法检测小鼠各组织DNMT1的表达情况.结果与对照组比较,照射组小鼠基因组启动子甲基化谱发生了明显改变,照射组1 300个基因的启动子CpG岛发生了新的甲基化,660个基因发生去甲基化；提高筛选标准,后可得到发生明显甲基化的基因有Trim71、Sema3f、Pcdh8、Sox4、1110034A24Rik、Limk1、Nef1、Xpr1,明显去甲基化的基因有Sfrs18、Dr1、Ankrd42、Nae1、Sii1、Accn1、Srd5a1、Nsun2、Eif1a、Dusp5;照射组小鼠除肺组织外肝脏、肾、睾丸及脑组织的DNMT1表达量均高于对照组(P＜0.05).结论在电离辐射损伤中基因组启动子甲基化模式发生了改变,DNMT1表达增加可能是导致启动子发生甲基化的原因.
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DNA和组蛋白表观遗传修饰与糖尿病和肥胖的关系以及小分子抑制剂的研究进展
肥胖和糖尿病是常见的代谢性疾病,严重危害人类健康.尽管经过几十年的持续研究,但人们对于肥胖与糖尿病发病的遗传基础和分子机制仍然知之甚少.近来研究发现,表观遗传学可以通过多种机制将环境影响与许多疾病的发生发展过程联系起来.某些特定基因的表观遗传修饰的改变可能是导致糖尿病和肥胖的始动因素.在本文中,作者首先阐述肥胖和糖尿病的主要致病机制,并对相关靶标蛋白及其小分子抑制剂进行介绍,从而对揭示表观遗传修饰的改变诱发肥胖和糖尿病的分子机制做一个总结,为相关疾病的防治提供线索.
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靶向性甲基化酶真核表达载体pcDNA3.1-myc-3a的构建
目的:在pcDNA3.1真核表达栽体中构建表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶pcDNA3.1-myc-3a并进行鉴定.方法:以含有myc全长基因的pcDNA3.1-myc-Luc质粒为模板,通过PCR方法扩增获得myc(DBD),再以含有靶向性甲基化酶的pcDNA4.0-GBD-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段3a,然后将两者克隆入表达栽体pcDNA3.1;以双酶切和PCR方法对构建的载体进行鉴定.结果:通过PCR方法获得了靶向性甲基化载体pcDNA3.1-myc-3a,并通过免疫印记方法验证了抗myc标签抗体可以特异性识别目的蛋白.结论:正确构建了靶向性甲基化酶pcDNA3.1-myc-3a的真核表达载体.
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靶向性DNA甲基化酶在pET32a原核表达载体中的表达和鉴定
目的:在pET32a原核表达栽体中表达融合myc-6his标签的靶向性甲基化酶B1-3a并进行鉴定.方法:以含有B1-3a基因的pcDNA4.0-B1-3a-myc-6his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc-6his标签序列的目的区段B1-3a,然后克隆入表达载体pET32a;以SDS-PAGE和Western blot方法对表达产物进行鉴定.结果:表达产物中在分子量43kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被6his标签单克隆抗体特异识别.结论:正确构建了靶向性甲基化酶B1-3a的原核表达载体,靶向性甲基化酶能够在pET32a中成功表达.
关键词： DNA甲基化酶 基因 靶向性 原核表达栽体pET32a -
人胃癌组织DNA甲基化酶、去甲基化酶与肿瘤相关基因的表达
目的探讨胃癌组织中甲基化酶、去甲基化酶基因与肿瘤相关癌基因和抑癌基因的关系.方法取28例胃癌手术标本的癌区、癌旁、正常组织,分别以RT-PCR法和定量RT-PCR法检测DNA甲基化酶1(DNMTl)、去甲基化酶mbd2、甲基化结合蛋白MeCP2和p16INK4A、c-myc等基因的转录水平,以相关分析等统计学处理研究各基因表达之间及分别与病理组织学之间的关系.结果癌组织平均DNMTl和mbd2 mRNA分别明显高于和低于正常组织.胃癌组织中c-myc的表达增强,而MeCP2和p16INK4A无明显变化.在正常组织中,MeCP2与mbd2,p16INK4A与MeCP2、mbd2,c-myc与MeCP2的转录水平表现出一定的相关性,而当肿瘤发生后仅发现c-myc与mbd2的表达呈负相关.以上各基因与肿瘤生物学行为均无相关性.结论肿瘤相关基因mRNA的表达与甲基化酶DNMTl无关,而与甲基结合蛋白有关.
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重组DNA甲基化酶1表达质粒对结肠癌细胞相关基因表达的影响
目的分析DNA甲基化酶1(DNMT1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞肿瘤相关基因的表达影响.方法分别构建并转染含有人正义和反义DNMT1的真核表达质粒入结肠癌SW1116细胞,PCR和限制性内切酶证实转染结果,以Western印迹法分析各组细胞DNMT1蛋白的表达情况.定量PCR检测hMLH1、hMSH2及c-myc、p16INK4A基因的表达.结果经G418筛选得到稳定转染DNMT1基因的结肠癌细胞系,且分别在该转染有正义和反义质粒的细胞系中,DNMT1蛋白表达上调和下调.同时发现转染正义DNMT1的细胞中hMLH1、hMSH2及c-myc的表达降低,而转染反义DNMT1的细胞中hMSH2的表达明显增强.各组细胞p16INK4A基因的表达差异不明显.结论DNMT1基因调控人结肠癌细胞中肿瘤相关基因的表达.
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丁酸钠对小鼠大肠癌的防治作用及其对甲基化酶的影响
目的 通过观察丁酸钠(NaBu)对二甲肼(DMH)诱发小鼠大肠癌的防治作用及其对抑癌基因p21WAF1和甲基化酶的影响,探讨乙酰化酶抑制剂防治肿瘤的分子机制.方法 80只S-ICR小鼠随机均分4组:空白对照组、DMH造模组、NaBu对照组、DMH+NaBu组.记录小鼠一般情况,分别于造模后18周、20周、22周每组处死小鼠2只,24周时全部处死.大体及镜下观察肠道肿瘤发生情况和组织学变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测p21WAF1mRNA表达,定量PCR检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b基因的表达.结果 NaBu对小鼠无毒副作用;DMH+NaBu组小鼠大肠癌发生率(25%)较DMH造模组(95%)明显降低(P＜0.05),肿瘤大小和数目亦显著低于造模组,且大肠癌的病理进展慢.DMH造模组肿瘤组织中较正常对照组甲基化酶水平升高3～4倍,抑癌基因p21WAF1低表达;与造模组比较NaB组p21WAF1表达增加,并伴有甲基化酶Dnmt1和Dnmt 3b mRNA降低(P＜0.05).结论 NaBu对DMH诱发的小鼠大肠癌具有一定防治作用,这与激活抑癌基因p21WAF1表达、降低甲基化酶Dnmt1和Dnmt3b表达有关.
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人胃癌组织中Runx3、Dnmt1表达及其临床意义
目的 研究Runx3和DNA甲基化酶1(Dnmt1)在胃癌组织中的表达以及与胃癌临床病理特征之间的关系,并探讨其临床意义.方法 以70例胃癌患者为研究对象,采用RT-PCR法分别检测胃癌组织及相应正常胃黏膜组织中Runx3 mRNA 、Dnmt1 mRNA表达.结果 胃癌组织中Runx3表达明显降低,Dnmt1表达显著增高; Runx3表达下调与胃癌局部浸润深度、组织分化程度及TNM分期密切相关(P＜0.05);Dnmt1的表达与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、组织学类型、组织分化程度、TNM分期均无明显相关性(P＞0.05).Runx3与Dnmt1表达呈明显负相关(r=-0.261, P＜0.05).结论 人胃癌组织中Runx3基因表达下调,提示其在胃癌的发生、发展中起重要作用;高表达的Dnmt1在一定程度上参与调控Runx3基因的表达下调.
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Aβ25－35对SH－SY5Y细胞Bcl－2、Bax基因启动子区DNA甲基化的影响
目的：探讨Aβ25－35介导SH－SY5Y细胞Bcl－2、Bax基因表达改变是否通过基因启动子区甲基化的机制。方法不同浓度Aβ25－35（0、25、50μmol? L－1）分别作用于体外培养的SH－SY5Y细胞48、72 h，MTT法确定Aβ25－35诱导SH－SY5Y细胞凋亡的佳浓度和时间。 Western blot 检测不同药物处理组细胞凋亡相关蛋白Bcl－2、Bax表达变化，Real time PCR检测DNA甲基化酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeCP2的mR－NA水平。 Methylation specific PCR （ MSP）法分析Aβ25－35介导的Bcl－2、Bax基因启动子区甲基化水平的变化。结果25μmol? L－1 Aβ25－35暴露SH－SY5Y细胞72 h后，MTT检测细胞存活率达（68．49±9．83）％，与对照组比较明显降低（ P＜0．05），表明成功建立了AD细胞凋亡模型。 Western blot 结果显示，Aβ25－35药物处理组与空白组比较，Bcl－2表达明显减少，Bax表达明显增加。 Real－time PCR结果显示，不同浓度的Aβ25－35药物组与空白组比较，DNA甲基化酶DNMT1、DN－MT3a、DNMT3b、MeCP2表达无变化（ P＜0．05）；MSP结果显示空白对照组Bcl－2和Bax甲基化扩增阴性，非甲基化扩增阳性；Aβ25－35处理组Bcl－2和Bax甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性。结论 MSP结果显示Aβ25－35介导SH－SY5Y细胞凋亡未引起Bcl－2、Bax启动子区甲基化的改变。
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去甲基化机制在腺苷及同型半胱氨酸诱导肝癌HepG2细胞凋亡中的作用
目的：探索去甲基化机制在腺苷（ADO）及同型半胱氨酸（HCY）诱导肝癌 HepG2细胞凋亡中的作用。方法CCK8法检测不同浓度腺苷（1.0、2.0、4.0 mol·L－1）单独或者联合同型半胱氨酸作用肝癌HepG2细胞不同时间（6、12、24 h）后细胞存活率；亦使用DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR观察其对细胞生长的影响。AnnexinV-FITC／PI 双染法检测细胞凋亡率，流式细胞术检测细胞内线粒体膜电位：实时荧光定量PCR及Western免疫印迹法分别检测caspase-3、caspase-8、caspase-9、MDM-2、p53、Cytochrome C、DNMT1、DN-MT3a、DNMT3b等因子的表达量。结果 ADO联合HCY明显抑制 HepG2细胞增殖，呈剂量和时间依赖性；不同浓度ADO联合HCY（1.0、2.0、4.0 mol·L－1）作用HepG2细胞24 h，细胞凋亡率分别为（18.63±1.25）％，（29.42±2.37）％，（42.47±3.09）％，均明显高于阴性对照组（1.30±0.82）％， P＜0.01；联合用药组线粒体膜电位明显下降，分别从空白对照组（674.15±82.8）％下降为（428.38±54.5）％、（297.78±30.5）％、（74.45±5.73）％，P＜0.01；ADO联合HCY导致caspase-3、caspase-8、caspase-9、p53、Cytochrome C 表达上调，MDM-2表达下调。ADO 联合 HCY 或5-Aza-CdR 处理HepG2细胞均可抑制DNA（甲基化酶DNMT1、DNMT3a、DN-MT3b）mRNA表达量。结论 ADO与HCY联合作用引起了细胞内甲基化改变，低甲基化作用激活了p53及线粒体等凋亡通路，终导致肝癌HepG2细胞凋亡。
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力尔凡对艾氏腹水癌细胞内DNA甲基化酶活力的影响
目的以BAIB/C艾氏腹水癌荷瘤小鼠为模型,用3H-甲基掺入测定了各增殖时相的艾氏腹水癌细胞内DNA甲基化酶活力水平,观察力尔凡、大蒜油、多糖对艾氏腹水癌内DNA甲基化酶活力的影响.方法20只BAIB/C纯系雄性小鼠,分别腹腔注射接种艾氏腹水癌细胞1×108/只,于接种后第3天随机分为4组分别注射生理盐水、力尔凡、大蒜油、多糖,在给药3天后第3、9、24、48小时分别取艾氏腹水癌细胞提取DNA甲基化酶,测酶活力.结果力尔凡能非常明显地提高给药组小鼠艾氏腹水癌组织内DNA甲基化酶活力,各组间DNA甲基化酶比活依次为:力尔凡组＞多糖组(A)＞大蒜油组(G)＞荷瘤对照组.结论DNA甲基化酶活力的提高与细胞分裂的被抑制有一致的相关性,力尔凡药表现明显的抗肿瘤活性.
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肺癌患者血清中DNA甲基化酶的表达
目的：观察DNA甲基化酶（ DNMT1、DNMT3a和DNMT3b）与肺癌危险性的关系。方法：采用酶联免疫吸附法检测136例肺癌患者（肺癌组）、141例肺良性疾病患者（对照组）血清DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的水平。分析性别、年龄、吸烟史、肺癌组织学类型和临床分期对血清DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的影响，以及血清DN-MT1、DNMT3a和DNMT3b表达水平与肺癌危险性的关系。结果：肺癌组DNMT1、DNMT3a表达水平（μg/L）[12．64（9．67～17．07），0．74（0．61～1．05）]高于对照组[11．07（7．85～17．59），0．66（0．49～1．00）（Z ＝1．884， P＝0．002；Z＝1．788，P＝0．003）]，DNMT3b差异无统计学意义。按3种DNMTs水平的百分位数25％、50％、75％为分界点分别将肺癌组和对照组分为4层，结果显示随着DNMT1、DNMT3a表达水平增加，患肺癌的危险性增加（χ2趋势＝4．062和7．853，P＜0．05）。结论：肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a表达水平显著升高，检测血清DNMTs的变化可预测患肺癌的风险。
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真核表达载体pcDNA3.1-3a的构建及其在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的表达
目的 在pcDNA3.1真核表达载体中构建表达融合myc/his标签的甲基化酶表达载体pcDNA3.1-3a,并在神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中进行验证,以期获得可表达甲基化酶催化结构域的融合基因.方法 以甲基化酶的pcDNA4.0-GBD-3a-myc/his质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得融合有myc/his标签序列的目的 区段-甲基化酶催化结构域3a,将其克隆入真核表达载体peDNA3.1;以EcoR I、EcoR V双酶切和PCR方法对构建的表达载体进行鉴定,并通过测序证明载体构建正确,同时检测甲基化酶3a在SK-N-SH细胞中的表达.结果 通过PCR方法获得了含有甲基化酶催化结构域的真核表达载体pcDNA3.1-3a,并通过免疫印记方法验证了在神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞样品中用抗his标签抗体可以特异性识别目的 蛋白.结论 正确构建了甲基化酶表达载体pcDNA3.1-3a,其可在神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞中表达.
