酶联免疫吸附试验测定抗虫卵抗原IgA区别急慢性日本血吸虫病的研究

急性血吸虫病的诊断在未询问血吸虫疫水接触史时易与其他发热性疾病相混淆而造成误诊,如疟疾、伤寒、肝脓肿、败血症、结核病及钩端螺旋体病等[3].因此,仅凭临床表现诊断急性血吸虫病依据不足.本研究试图寻找区别急性和慢性感染的血清学新方法.

抗日本血吸虫SEA纳米抗体制备与分析

利用制备的日本血吸虫虫卵抗原(SEA),免疫健康双峰驼Bactrian camel,分离其外周血淋巴细胞提取总RNA,利用RT-PCR扩增骆驼重链抗体IgG可变区(VHH)基因片段,将VHH片段与载体pMECS连接后电转入大肠杆菌TG1构建纳米抗体文库.经亲和筛选、phage-ELISA以及测序分析后,挑取阳性克隆,抽提质粒,电转入大肠杆菌WK6诱导表达纳米抗体.通过间接ELISA分析纳米抗体VHH-1的敏感性和特异性.结果显示,纳米抗体文库容量为2.3 ×108,测序分析显示,所获得的纳米抗体文库具有良好的多态性.经NI-NTA和AKTA纯化后获得高纯度纳米抗体.ELISA分析表明所获得的纳米抗体VHH-1具有较好的敏感性和特异性.为进一步开展纳米抗体在日本血吸虫诊治研究中的应用奠定一定基础.

日本血吸虫可溶性虫卵和童虫抗原刺激RAW264.7巨噬细胞的初步分析

本文采用不同浓度的日本血吸虫虫卵抗原(SEA)、童虫抗原(SSA)刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,结果显示SEA抗原能明显刺激巨噬细胞增殖分化(SI＞2),且多数巨噬细胞形态发生了改变并出现细胞死亡.实时定量荧光PCR结果显示,在SEA、SSA抗原刺激下,巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-10和CCL2的mRNA表达量都明显高于对照组.结果提示血吸虫抗原对巨噬细胞的刺激作用可能在宿主抗血吸虫感染的先天免疫应答和虫卵肉芽肿形成免疫调节中发挥了一定的作用.

基于日本血吸虫SEA纳米抗体的胶体金免疫层析技术的初步研究

为建立基于纳米抗体的检测日本血吸虫感染的胶体金免疫层析技术,将已经通过噬菌体文库筛选得到的两株纳米抗体的质粒,在枯草芽孢杆菌中表达,得到具有活性的抗体蛋白 (VHH-48、VHH-52) 并以NI-NTA亲合层析纯化.以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,标记VHH-48和VHH-52抗体蛋白并制备金标垫,分别用日本血吸虫可溶性虫卵抗原 (SEA) 和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线,确定抗体蛋白的佳标记pH和适蛋白浓度.采用抗体双夹心的方法对两株抗体蛋白进行组合,建立胶体金免疫层析方法.以优化的双夹心抗体组合,组装试纸条,进行了灵敏度的测定和血吸虫病人粪检阳性血清的敏感性评估,以并殖吸虫等其他寄生虫感染的血清测定了试纸条的特异性.结果显示,成功表达并获得了纯度较高的纳米抗体.胶体金标记VHH-48和VHH-52抗体的适蛋白量为14和10 μg/mL,适pH分别需要加入16和12 μL体积的0.2 mol/L K2CO3,并确定以VHH-52标金和VHH52划线为佳的抗体双夹心组合.对可溶性虫卵抗原的低检测量为3.4 ng/mL,检测血吸虫病人阳性血清的检出率为2.27%,检测其他寄生虫感染血清结果显示出良好的特异性.本文构建了基于日本血吸虫SEA纳米抗体的胶体金免疫层析试纸条方法,为纳米抗体在血吸虫病快速诊断的应用奠定了一定基础.

门静脉周纤维化人群呈现高水平抗曼氏血吸虫虫卵抗原的IgG4抗体

重组血吸虫诊断抗原研究进展

免疫学方法为诊断血吸虫病的重要手段,目前,用于血吸虫病免疫诊断的常用的抗原是成虫抗原和虫卵抗原.成虫抗原和虫卵抗原成分复杂,针对两种抗原的血清抗体在宿主体内长期存在,不能区别早期感染和既往感染,不能考核疗效,并且这两种抗原不易大量获得.现代生物技术的发展为解决上述问题提供了机遇.基因克隆技术能够帮助寻找刺激宿主产生短程抗体的某些抗原表位,通过检测短程抗体来评价治疗效果.同时依靠基因重组技术可以生产出相应的重组抗原分子,为现场推广应用所需大量的抗原材料提供了保证.本文主要就国内外研制基因重组抗原及其在血吸虫病诊断中的应用加以综述.

日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原诱导小鼠抗雌虫生殖免疫的研究

目的 探讨日本血吸虫云南株未成熟卵可溶性抗原(SIEA)免疫小鼠产生的抗雌虫生殖效果及作用机制.方法 3 000条日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤感染家兔,第34天收集兔肝中的未成熟卵制备SIEA.20只ICR小鼠随机分为两组,免疫组(11只)每鼠背部皮下多点注射SIEA(100μg/只),对照组(9只)给予等生理盐水,每2周免疫1次,共5次.末次免疫后1周,用(30±2)条血吸虫尾蚴攻击感染每只鼠.第45天收集小鼠粪便,第46天剖杀小鼠,心脏灌注法收集成虫.比较成虫数及粪便、肝组织、雌虫子宫内虫卵数和肝表面虫卵结节密度;透射电镜观察雌虫卵黄腺及雄虫睾丸组织.结果 免疫组与对照组检获成虫数差异无统计学意义(P>0.05).免疫组小鼠每克粪便每条雌虫虫卵数、每克肝组织每条雌虫虫卵数、每条雌虫子宫内虫卵数及肝表面虫卵结节密度分别为(56.68±24.78)个、(5 826±437)个、(49.94±12.53)个和(10.04±1.13)个/0.25 cm2;对照组分别为(89.93±32.18)个、(10016±3 541)个、(76.54±19.77)个和(19.22±2.45)个/0.25 cm2,差异均具有统计学意义(P<0.05).透射电镜观察显示,与对照组相比,免疫组小鼠体内雌虫卵黄腺内成熟卵黄细胞和脂滴减少,雄虫睾丸组织内支持细胞多见而精细胞较少,且卵黄细胞和支持细胞胞质内出现窄泡.结论 SIEA可能通过抑制口本血吸虫生殖细胞的成熟而产生抗雌虫生殖免疫效应.

磁珠-ELISA检测日本血吸虫循环虫卵抗原的研究

循环抗原(circulating antigen,CAg)是宿主体内活虫(包括虫卵)所产生的具抗原性的代谢物质.

日本血吸虫虫卵抗原诱导CD4+CD25+T细胞及其细胞因子表达

目的 探讨日本血吸虫虫卵抗原诱导宿主免疫应答下调的机制.方法 6～8周龄雌性队LB/c小鼠分为2组,实验组小鼠口服血吸虫虫卵10 000个以及尾静脉注射可溶性虫卵抗原(SEA)200μg,每周免疫1次,共4次;对照组注射PBS.流式细胞仪检测SEA免疫小鼠CD4+CD25+T细胞数量;与CD4+CD25-T细胞共同培养,检测CD4+CD25+T细胞抑制功能;流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞表达IL-4、IL-10与IFN-γ水平;酶联免疫吸附试验检测静脉血IL-10和转化生长因子-β表达水平.结果 实验组小鼠CD4+CD25+T细胞数量为14.7%,对照组为7.4%;实验组IL-10为29.2 pg/ml,对照组为11.0 pg/ml.与CD4+CD25-T细胞相比,CD4+CD25+T细胞主要合成IL-10及少量IFN-γ.CD4+CD25+T细胞显著抑制CD4+T细胞增殖. 结论 日本血吸虫虫卵抗原可能通过诱导CD4+CD25+T细胞和IL-10下调机体免疫应答.

日本血吸虫病流行区人群吡喹酮治疗前后细胞因子水平的研究

目的观察日本血吸虫病流行区人群的细胞免疫应答状态及吡喹酮治疗对其影响.方法采集日本血吸虫病流行区129人(粪检阳性者64例,粪检阴性者65例),吡喹酮治疗前及治疗后45 d的静脉血,以血吸虫成虫和虫卵抗原分别刺激诱生细胞因子,检测培养上清中的细胞因子IL-5、IL-10和IFN-γ水平.结果 129例中,对血吸虫抗原刺激诱生的细胞因子水平粪检阴性组明显高于粪检阳性组;治疗后,细胞因子诱生水平较治疗前显著升高,特别是IL-5和IFN-γ.结论流行区人群的细胞免疫应答显示总体下调趋势;吡喹酮治疗后出现细胞因子水平的明显升高.

重组抗原用于日本血吸虫病免疫诊断研究进展

目前,用于血吸虫病免疫诊断的常用的抗原是成虫抗原和虫卵抗原,由于这两种粗抗原的成分复杂,且与其他寄生虫感染血清存在着较严重的交叉反应,血吸虫病诊断的特异性不高,生产的试剂不宜标准化.

日本血吸虫T2核酸酶的原核表达及活性分析

目的 构建日本血吸虫T2核酸酶表达载体,并进行体外表达和酶活性分析.方法 从日本血吸虫基因组数据库中找到与曼氏血吸虫虫卵抗原Omega-1同源性高的蛋白AY814845,设计引物并通过PCR技术扩增得到该基因,将其成熟编码区连入pET32a表达载体,转化大肠杆菌并用IPTG诱导其表达,后对表达产物的核酸酶活性进行分析.结果 成功的构建了日本血吸虫T2核酸酶的表达载体,其编码区能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有一定的核酸酶活性.结论 从体外扩增了日本血吸虫T2核酸酶AY814845,明确其表达产物具有核酸酶活性,为今后深入研究该蛋白的功能打下了基础.

日本血吸虫可溶性成虫抗原和可溶性虫卵抗原对小鼠1型糖尿病的拮抗作用研究

目的：探讨日本血吸虫可溶性成虫抗原（SWA）和可溶性虫卵抗原（SEA）对小鼠1型糖尿病的拮抗作用。方法把24只成功建模的1型糖尿病小鼠随机分3组（A、B、C 组），每组8只小鼠。同时制备日本血吸虫 SWA 和 SEA。A 组模型鼠经腹部皮下多点注射日本血吸虫 SWA 进行免疫；B 组模型鼠经腹部皮下多点注射日本血吸虫 SEA 进行免疫；C 组模型鼠用 PBS 代替抗原腹部皮下免疫，1周免疫1次，共4次，4周后，颈椎脱臼处死各组小鼠，留取血清，采用 ELISA 双抗夹心法测定各组小鼠血清中 IL-4和 IFN-γ的水平，并取胰腺观察病理改变。结果免疫4周后，B 组小鼠血清 IL-4水平[（23．87±4．85）pg/mL]高于 C 组[（4．39±0．56）pg/mL]，差异有统计学意义（P ＜0．01），而 IFN-γ水平[（271．85±26．04）pg/mL]低于 C 组[（362．79±32．50）pg/mL]，差异也具有统计学意义（P ＜0．01）。但是 A 组小鼠 IL-4水平[（5．09±0．37）pg/mL]和 IFN-γ水平[（379．56±34．47）pg/mL]，与 C 组比较，差异无统计学意义（P ＞0．05）。B 组小鼠的胰岛结构虽没有保持完整，但淋巴细胞浸润较 C 组少，胰岛内部也未见大量淋巴细胞浸润。与 C 组小鼠胰腺相比，A 组小鼠胰腺未见明显变化，胰岛仍可见大量淋巴细胞浸润，残余胰岛细胞数量减少，并可见少数胰岛结构被破坏。结论日本血吸虫 SEA 对糖尿病1型小鼠具有一定拮抗作用，其作用机制可能是通过使 IL-4升高和 IFN-γ下降，调节 Th1/Th2免疫偏移，导致 Th1反应下调，Th2反应增强。