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DNA在生物传感器金电极上的固定化技术研究进展
核酸是重要的生命物质,其保存和传递生物遗传信息的独特方式,即特定的碱基序列和碱基配对的原则,是体外研究核酸功能和核酸检测方法的基础.用脱氧核糖核酸(DNA)作为识别元件构建的DNA生物传感器,在核酸检测中可以排除对标记的需要,同时具有快速、灵敏度高、实时测定的优势[1],适合发展成为一种定量测定的自动装置.
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暴发脑膜脑炎流行的新型毒株的全基因序列
吉林省延边地区1996年6月发生无菌性脑膜脑炎流行,从病人脑脊液和粪便标本中分离到多株病毒,血清学实验证明所分离的病毒为此次无菌性脑膜脑炎流行的病因.对其中的2株病毒(Yanbian96-83csf和Yanbian96-85csf)测定了全基因核酸序列并做了比较分析.结果所测2株病毒核酸长度均为7 456bp[包括3＇端poly(A)尾],两者间仅有13个位点不同,同源性达99.8%,在进化树上位于同一分支,因此两者是同一型病毒.通过在GeneBank上检索比较,Yanbian96-83csf和所查到的肠道病毒全基因的同源性小于77%,结构区VP1同源性大多数小于67%,仅3株在83%左右;进化树分析,与其它肠道病毒相差甚远,仅与2株Echo4和1株未定型肠道病毒相近;而血清学中和试验不能判定为Echo4型.据此推断,此病毒为新基因型肠道病毒.有关该病毒结构与功能的研究正在深入进行.
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一起引发手足口病流行的肠道病毒71型的分子特征
上海市某幼儿园2000年10～11月发生手足口病(HFMD)流行,从患儿粪便标本中分离到13株肠道病毒71型(EV71),血清学实验证明,所分离的病毒为此次HFMD流行的病因.对其中的4株病毒(SHANGHAI-EV71-H25、SHANGHAI-EV71-H26、SHANGHAI-EV71-F1和SHANGHAI-EV71-F2)进行了VP1区全基因核苷酸序列测定,并做了比较分析.4株EV71 VP1区全基因均为891个核苷酸,编码297个氨基酸,与检索到的广东省深圳市和台湾省HFMD病人EV71分离株同源性较高(>94%),与脑炎EV71分离株(BrCr株)同源性低(<83%).种系发生树分析亦表明,上海市的4株EV71与深圳株(AF302996-EV71-SHZH98)和台湾株(AF286531-FV71-TW98)亲缘关系较近,与BrCr株亲缘关系较远.因此上海市HFMD 4株EV71分离株为本地流行株.
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引发脑膜脑炎流行的柯萨奇B5病毒的序列分析
安徽省明光市2001年6～7月发生了一起无菌性脑膜脑炎流行,从病人脑脊液和粪便标本中分离到17株柯萨奇(Coxsackie,Cox.)B5病毒,血清学实验证明所分离的病毒为此次无菌性脑膜脑炎流行的病因.对其中的2株病毒(MG/18/2001和MG/39/2001)测定了VP1区全基因核酸序列并做了比较分析.结果显示:所测2株病毒VP1区核苷酸长度均为849bp,两毒株之间仅有1个核苷酸不同.这两株病毒与从(GenBank)检索到的Cox.B5病毒的核苷酸同源性约为82%,氨基酸序列亦有改变.从进化树上看,这两株病毒同在一个小分支上,与它们亲缘关系近的是从一疑似脊髓灰质炎的儿童分离到的AF114383-Cox.B5病毒,而与从手足口病患者分离到的X67706-Cox.B5病毒相对较远.表明此次脑膜脑炎的病因病毒与同是侵犯中枢神经系统的Cox.B5的原型株-AF114383-Cox.B5病毒亲缘关系近,但核苷酸已经发生了＞18%的变异,可以认为其是Cox.B5新亚型病毒.
关键词： 无菌性脑膜脑炎 柯萨奇B5病毒 逆转录-聚合酶链反应 碱基序列 -
基因功能的抑制
随着人类基因组测序工作的完成,人类基因组109碱基序列中具有功能的基因约3万个,其功能基因的序列已经明了,这些基因功能的研究正在轰轰烈烈的进行中.生物体内编码基因要执行其功能,需要经历DNA的复制、转录和翻译,即基因表达的过程.因而,要了解基因的功能,可以采用转基因、诱导突变观察基因缺失型的表现,进而推测它的功能;或是从基因的DNA、RNA或蛋白水平进行干预,抑制其表达,观察基因抑制后表型变化,研究其功能.转基因和诱导特异的基因突变效率低,相对而言,随着生物技术的发展,后一种方案就简单多了,因此生命科学研究中,出现了多种在DNA、RNA和蛋白水平上抑制某个或某些特定基因发挥功能的方法,而且这些方法也越来越多地应用于基因过度表达的疾病的治疗中.
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广州地区肝炎患者血清中庚型肝炎病毒核酸检测和病毒核苷酸测序
目的了解广州地区肝炎患者中庚型肝炎病毒(HGV)的感染情况及基因型特点。方法采用逆转录-套式聚合酶链反应(RT-nested PCR)方法检测肝炎患者血清中HGV RNA，引物位于HGV基因组的非编码区，并对扩增产物进行直接测序。结果 251例急慢性肝炎血清中共检出25例HGV RNA阳性，总阳性率为9.96％，其中56例非甲～戊型肝炎中检出4例阳性(7.14％)，77例乙型肝炎(HB)中检出8例阳性(10.39％)，118例丙型肝炎(HC)中检出13例阳性(11.17％)；2株HGV广州株核苷酸之间的同源性为98.0％，与非洲株的同源性分别为81.7％和84.2％，与美国株的同源性均为91.1％。结论广州地区肝炎患者中存在HGV感染，2株HGV广州株可能为同一基因型，且与HGV美国株具有较高的同源性。
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一起引发脑膜炎流行的ECHO病毒的序列分析
目的测定山东省招远县1987年2～8月发生的无菌性脑膜炎大流行的病因病毒之W株病毒(Zhaoyuan/W/87)的部分序列,分析其与其他肠道病毒的关系.方法病毒用酚-氯仿抽提RNA,经逆转录合成cDNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增,产物纯化,采用双脱氧链末端终止法在ABI377自动核酸测序仪上测定序列.结果 W株5′端非编码区、2C区和3D区的部分序列长度分别为244、275和353个核苷酸;VP1区全基因为876个核苷酸,编码292个氨基酸,与检索到的2株ECHO29核苷酸序列的同源性分别为82.1%和81.7%,氨基酸序列的同源性分别为95.1%和94.4%;与检索到的1株ECHO2核苷酸序列的同源性为62.3%.种系发生树分析,W株在单独的一个分支上,与2株ECHO29所在分支较近,与ECHO2所在分支较远.结论目前无法判定W株与ECHO2的关系,但可以说W株是ECHO29的变异味.
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山东省HCV分离株C区及NS5区核苷酸序列分析及其基因分型
目的研究山东省丙型肝炎病毒(HCV)流行株的基因型别.方法用反转录套式聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增山东省HCV流行株C区(432 bp)NS5区(319 bp)的两个基因片段,将其克隆入T载体上并自动测序,进行同源性分析及基因型别鉴定.结果 4株HCV C区基因片段有3株为1b基因亚型,1株为2a基因亚型,10株NS5区的基因片段分析均为1b基因亚型,并且与GenBank中多个1b亚型代表株核苷酸序列同源性达90%以上.结论山东省HCV流行株以1b亚型为主,兼有2a亚型.同一亚型中也有较大的变异,NS5区1b亚型中基因离散率可达5%以上.
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在中国发现普马拉型汉坦病毒
目的确定我国是否存在普马拉(Puumala)病毒.方法从我国东北地区棕背肺标本中用RT-PCR扩增汉坦病毒S片段基因序列,对所扩增序列进行核苷酸序列测定和分析.结果从我国东北地区棕背肺标本中扩增出长度为926碱基对的cDNA片段,核苷酸序列测定证实为普马拉病毒S片段序列.与不同型别汉坦病毒代表株进行比较表明,此次发现为新的普马拉病毒株,系统发生分析结果表明,此次发现的病毒与普马拉病毒P360、K27、CG-820、CG-17株种系相近, 同源性达到99%以上.结论我国存在普马拉病毒,我国新发现的普马拉病毒核苷酸序列和俄罗斯远东地区普马拉病毒接近.
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海南岛两株甲病毒基因组3＇末端核苷酸序列的克隆与分析
目的 从分子水平鉴定海南省分离的两株甲病毒(HBb17和M1病毒)。方法 采用RT-PCR方法 ，分别扩增两株病毒基因组的3＇末端核苷酸序列，扩增产物经亚克隆，筛选重组子并测定核苷酸序列对序列进行分析。结果 HBb17和M1病毒分别扩增出约1.6kb和1.3kb的特异片段。序列分析表明，在3＇末端非翻译区HBb17病毒与罗斯河病毒(国际标准株T48病毒)核苷酸同源性为99％，M1病毒与鹭山病毒(SAG)同源性为98％；两病毒结构基因的E1区序列，HBb17病毒与罗斯河病毒核苷酸(氨基酸)同源性为99％(99％)，M1病毒与鹭山病毒核苷酸(氨基酸)同源性为97％(99％)，M1病毒与盖塔病毒同源性为94％(98％)。结论 序列分析表明，海南岛分离的HBb17病毒属于罗斯河病毒，M1病毒可能是鹭山病毒或盖塔病毒的变异株。
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汉坦病毒山东分离株的分子生物学研究
目的应用聚合酶链反应(PCR)、核苷酸序列分析等方法,比较山东省家鼠型汉坦病毒的生物学特性.方法提取汉坦病毒感染细胞的全细胞RNA,逆转录后用聚合酶链反应扩增病毒cDNA.对PCR产物进行核苷酸序列测定. 结果汉坦病毒山东分离株SD25、SD70、SD27和SD10均为家鼠型汉坦病毒,核苷酸及氨基酸序列与已知SEO型病毒具有较高的同源性,这4株病毒间的同源性高达98%以上. 结论 4株病毒分离时间跨度虽有十几年,但相互间变异很小,证实了家鼠型汉坦病毒的稳定性.
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福建省新分离3株乙型脑炎病毒的分子特征鉴定
目的确定福建省新分离乙型脑炎病毒(JEV)的基因分型及其E区段氨基酸序列特征.方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增并克隆新分离JEV(02-41、02-43、02-102)的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对和比较分析,种系发生采用PHYLIP软件包分析.结果新分离的3株JEV属于基因Ⅲ型,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA 14-14-2株的同源性均在96%以上,在关键结构域有部分氨基酸差异.结论福建省新分离的3株病毒属于基因Ⅲ型JEV,E蛋白与疫苗株相比有部分氨基酸差异.
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细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌cppB基因稳定性的影响
细胞壁缺陷变异是细菌变异的一种特殊类型,细胞壁缺陷不但导致细菌的形态发生改变,也常常导致细菌代谢活性、致病性、遗传等多种特性发生改变.研究证实细胞壁缺陷可导致细菌丧失其R因子等质粒甚至造成细菌染色体基因碱基序列或活性发生改变,但关于细胞壁缺陷导致细菌隐蔽性质粒丢失或其碱基序列改变尚未见报道.为探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌隐蔽性质粒的影响,本文对青霉素诱导形成的淋病奈瑟菌细胞壁缺陷型的cppB基因进行了检测与分析.
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用随意扩增多态性DNA PCR方法检查实验小鼠的嗜肺性巴氏杆菌
嗜肺性巴氏杆菌是动物致病菌,人感染多通过猫、狗咬伤或抓伤而致.嗜肺性巴氏杆菌是实验啮齿动物(特别是小、大鼠和豚鼠)巴氏杆菌病的主要病原菌.为了鉴定从实验小鼠分离的15株嗜肺性巴氏杆菌的基因型,本文用3个随机引物(每个引物不得由0个碱基组成),用RAPD-PCR方法对分离的15株嗜肺性巴氏杆菌进行扩增试验,以鉴定这15株嗜肺性巴氏杆菌的基因分型.本试验所用的15份测试菌株标本采自小白鼠,编号1～15号.24?h培养物离心沉淀,收集嗜肺性巴氏杆菌,细菌用PBS洗2次,再用单蒸水洗1次,沉淀物加0.7ml无菌水悬起,样品于100℃温度下加热煮沸5?min,迅速放冰水中冷却,直接用于PCR扩增,毋须提取DNA.3个随机引物的名称及碱基序列如下:OPL-7 5′AGG CGG GAA C-3′;ORL-11 5′ ACG ATG AGC C-3′;OPL-12 5′GGG CGG TAC C-3′,每次反应只用1个引物(图1).
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我国彝族另一新的DR15(2)等位基因的核苷酸序列分析
目的 对在用PCR/SSO方法作我国彝族群体样本HLA D区寡核苷酸分型中发现的1例DRB1的杂合子进行等位基因序列分析.方法 用DRB基因类引物扩增该特殊的DRB1杂合子细胞基因组的DRB基因的第二外显子.扩增产物经纯化转染大肠杆菌JM101,克隆后再经酚/氯仿抽提后得到单链M13 DNA.利用ABI 377测序仪自动测序.结果 彝族这一特殊的DRB1杂合子细胞的DRB1基因阳性克隆,经序列分析证实了该DRB1杂合子中一个等位基因确为DRB1*1202,与PCR/SSO分型一致;另一个新等位基因DRB1*15Y2(暂定)等位基因在第二外显子的47位由编码苯丙氨酸的TTC(DRB1*1502)变为编码酪氨酸的TAC.结论 在云南彝族样本中发现的DRB1*15Y2,其47位由TAC(酪氨酸)置换了相应于DRB1*1502的TTC(苯丙氨酸).在我国这样一个多民族国家中,就HLA系统而言,可能还有更多新等位基因有待鉴定.这样有助于完善群体遗传资料.
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汉坦病毒浙江分离株的分子生物学研究
目的浙江新分离的汉坦病毒ZJ4、ZJ7毒株,与20年前浙江分离的汉坦病毒Z10疫苗株的M片段核苷酸序列进行比较,揭示它们之间的差异.方法提取汉坦病毒RNA,利用逆转录-聚合酶链反应扩增病毒部分M基因片段,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析.结果汉坦病毒浙江新分离株ZJ4、ZJ7均为 HTN型病毒,ZJ4、ZJ7株与Z10株部分M片段核苷酸的同源性分别为88.3%和92.3%.结论新分离株ZJ4、ZJ7株与疫苗株Z10株分离时间跨度有20多年,其相互间变异不大,证实了HTN型汉坦病毒基因的稳定性.
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杂合性歧义引物分离法在解决人类白细胞抗原基因歧义分型结果中的应用
目的 评估杂合性歧义引物分离法(HARPs)在解决中国汉族人群人类白细胞抗原(HLA)基因歧义分型结果中的应用价值,并筛选合适的HARPs引物.方法 416名南方汉族个体的HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1基因通过PCR-测序分型(PCR-SBT)方法进行基因分型,并采用美国Atria公司的HARPs引物对其中的歧义分型标本进行附加测序分型.结果 86.3%(132/153)的HLA-A、73.9%(130/176)的HLA-B和38-1%(85/223)的HLA-DRB1歧义分型标本可以通过HARPs方法有效解决;其中48.5%(64/132)的HLA-A、80.0%(104/130)的HLA-B和100.0%(85/85)的HLA-DRB1歧义分型标本只需要1种HAPRs引物,47.7%(63/132)的HLA-A、20.0%(26/130)的HLA-B需要同时使用2种HAPRs引物;3～6种HARPs引物可以解决90%以上的歧义分型标本.结论 HARPs可作为解决中国汉族人群HIM-A、HLA-B、HLA-DRB1基因SBT歧义分型结果的常规方法.
关键词： HLA抗原 基因型 碱基序列 杂合性歧义引物分离法 -
反义寡核苷酸抗肝炎病毒研究进展
反义核酸是指能够与基因组DNA有意义链(sense sequence),或有意义链的转录体互补结合的核苷酸序列,包括反义RNA、反义NDA、反义寡核苷酸具有核酸特异切割活性的核酶等.反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)是指合成的20个碱基左右的一小段核苷酸,按照Watson-Crick碱基配对原则与特定的靶序列杂交,从而抑制基因表达.其作用方式有2种:①与mRNA杂交,单纯阻断核糖体对mRNA的翻译;②激活一种降解mRNA的选择性内切酶RNaseH.ASODN治疗具有高特异性,是一种改变肿瘤、AIDS等病毒感染性疾病中操纵基因表达的治疗方法.本文就ASODN的化学修饰、药理学研究,以及其抗肝炎病毒作用作一综述.
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幽门螺杆菌HSPB基因的克隆与序列分析
幽门螺杆菌(Hp)的研究已普遍受到关注[1-10].毒力因子中,目前研究的一个热点是热休克蛋白(heat shock protein,HSP).已知所有的Hp菌株都产生HSP,它作为分子伴侣对于Hp的生存及其致病具有重要作用[11-13].HSP位于细菌表面,具有较强的免疫原性,抗HSP免疫反应可使机体产生保护性免疫[14],因而存在着发展为疫苗成分的可能性.目前在我国对于Hp的HSP研究较少.因此,克隆中国菌株的HSPB基因,阐明其基因结构特征,对于研究它的生物学功能及探索其基因产物作为疫苗成分的价值有重要意义.
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阴离子型胰蛋白酶原基因G191R突变与胰腺炎发病的关系
目的 分析阴离子型胰蛋白酶原(PRSS2)基因G191R突变在急性胰腺炎(AP)和慢性胰腺炎(CP)患者中的发生率,探讨PRSS2基因突变对胰腺炎易感性的影响.方法 采集82例AP、73例CP及138例健康体检者的血液标本,提取基因组DNA.应用巢式PCR对PRSS2基因进行扩增.PCR产物用Hpy188Ⅲ酶切,行限制性片段长度多态性分析(RFLP),部分产物测序验证.结果 PRSS2基因的巢式PCP产物长度为436 bp,RFLP2获得309 bp和127 bp两个片段,为RPSS2基因G191R突变(即GGA→AGA)所致.DNA测序证实PRSS2基因G191R突变.AP患者中5例发生RPSS2基因G191R突变,突变率为6.1％(5/82),OR=0.682,95％ CI 0.231 ～ 2.010; CP患者突变率为1.4％ (1/73),OR =0.145,95％ CI 0.019～1.145;健康对照组为8.7％ (12/138).CP组的G191R突变率显著低于健康对照组(x2 =0.432,P=0.035),而AP组与健康对照组的差异无统计学意义(x2=0.487,P=0.485).结论 PRSS2基因G191R突变可促进阴离子型胰蛋白酶原的降解,降低慢性胰腺炎的发生率.
关键词： 胰腺炎 阴离子型胰蛋白酶原基因 点突变 聚合酶链反应 碱基序列
