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上海部分健康体检人员中感染TTV的基因分型
目的调查上海地区健康人群TTV感染情况及其基因分型.方法用PCR法检测血清标本中的TTV DNA,对TTV DNA阳性标本作核酸序列测定.结果 100份健康体检人员血清标本,用PCR法检出TTV DNA阳性标本21份.其中14份作了部分序列测定,10份部分序列与TTV G1a基因亚型组的TA278株等的同源性为96.2%～99.5%.另4份与G1a组同源性为66.2%～67.6%,与TTV G4基因型组同源性为81.9%～84.8%,与国内报道的各株TTV中同源性大的61.SEQ为81.9%～84.3%.结论上海地区部分健康人群中除分布有TTV G1a基因亚型感染外,还分布有国内未见报道的TTV基因型感染,其可归为TTV G4的一基因亚型.
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167.生物信息学
生物信息学(Bioinformatics)是近几年来迅速发展起来的一门新兴学科,又称computational biology、in silico biology等.其定义因人而异,基本是指通过计算机技术分析诸如基因组碱基序列的大规模数据,从而探索生命现象的研究学科.
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肝病
一、乙型肝炎1.HBV基因型此前虽依S抗原的抗原性将HBV分类为4个主要亚型,这一血清型分类固然有其流行病学分布差异,但在临床上的重要性尚欠明了.近年在进行大量HBV基因测序的工作中发现了其多态性,以其碱基序列相差超过8%为指标,可分类为A～G基因型,并对其与临床表现的相关性作了深入的分析.至2002年,又发现H型,故HBV目前分类已有8个基因型(表1).
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表面等离子共振技术在蛋白质组学中的应用
被誉为"生命登月计划"的人类基因组计划于2001年2月迎来了它的一个重要里程碑--人类基因组工作框架图完成[1]!它公布了覆盖人类基因组97%的基因序列,并提示仅有3-4万个基因编码蛋白质.面对这些浩如烟海的碱基序列,如何破译全部遗传信息、解码生命的奥秘成为"后基因组时代"的重要任务.结构基因组学正向功能基因组学、蛋白质组学过渡,研究重点变为从整体水平上探讨基因组动态的生物学功能,研究蛋白质结构与功能的关系及蛋白质间的相互作用,解释人类生命现象何以如此复杂多变.
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一株新型散发型戊型肝炎病毒部分核苷酸序列测定与分析
目的:了解长春地区戊型肝炎病毒(HEV)株的变异程度.方法:用逆转录-套式-聚合酶链反应方法从患者血清中获取病毒,用双脱氧终止法进行核苷酸序列分析.结果:China Changchun220MC与日本株、猪的HEV分离株(AF082843)、美国株-1(AF060669)、墨西哥株(M74506)、第四基因型(AJ272108)、缅甸株(M73218)、中国株(M94177、D11093、D11092)、尼泊尔株(AF051830)、巴基斯坦株(M80581、AF185822)核苷酸同源性为72%～88%,氨基酸同源性为93%～97%.结论:China Changchun-220MC株与其它HEV株相比有较高的基因异质性,可能是一新型的HEV株.
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基因芯片在肿瘤研究中的应用
人类全基因组的核苷酸序列分析已在2001年提前完成,目前已逐步进入了功能基因组时代.人类面临的更艰巨的任务是研究基因组功能,也就是说不仅要了解基因组的碱基序列,而且还要掌握其中所包含的时空信息.基因芯片技术的出现使全面、综合分析某些生命现象成为可能.随着人类基因组计划的完成通过基因芯片技术能确定细胞内所有基因的表达谱,可同时获得成千上万个基因活化的模式.目前研究认为,肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程,实际是多种肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活所致[1].
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进入疟疾研究的后基因组时代
恶性疟原虫基因组测序有望带来疟疾研究方法的革命.除了简单的基因发现,基因组测序将便于综合鉴定寄生虫发育阶段的基因表达、病理以及对药物治疗的宿主遗传背景等环境变量的反应.本文介绍了恶性疟原虫基因组测序计划的近况及功能基因组学开发的生物信息学及其分析工具的应用,其目的是根据对疟原虫生物学的深入观察,确定合理的、基于信息的、新的治疗策略和目标.
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辽宁省2009年至2011年病毒性腹泻流行病学研究
目的 通过监测辽宁省哨点医院病毒性腹泻病例,了解病毒性腹泻病原流行特征,探讨病毒性腹泻病原变异和流行规律.方法 收集2009年1月至2011年12月辽宁省哨点医院粪便标本639份,采用PCR和RT-PCR检测轮状病毒、杯状病毒、星状病毒和腺病毒.计数资料分析采用x2检验或Fisher确切概率法.结果 639份粪便标本中轮状病毒阳性率为15.96％,杯状病毒为11.25％,星状病毒为1.25％,腺病毒为0.31％.检出A组轮状病毒101份,G3、P[8]型为优势株；C组轮状病毒1份,为辽宁省首次检出,并通过分子生物学分析,C组轮状病毒核苷酸序列JX407109与日本暴发疫情核苷酸序列AB648916亲缘关系较近,核苷酸序列一致性达到99％.检出杯状病毒72份,包括诺如病毒70份,为GⅡ/4型,札如病毒2份.检出星状病毒8份,以1型为主.检出腺病毒2份为41型.辽宁省病毒性腹泻高发月份为12月至次年2月,轮状病毒和星状病毒以5岁以下儿童高发,杯状病毒感染无年龄差异.结论 辽宁省病毒性腹泻主要病原为A组轮状病毒和杯状病毒,C组轮状病毒与日本暴发疫情核苷酸序列较近,需引起注意.
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乙型肝炎病毒X基因突变与疾病进展的相关性
HBV基因组负链碱基序列至少包含4个开放读码框(ORF):S、P、C和X.其中,HBV X基因位于第1374～1838位核苷酸(nt),长约465个碱基,是HBV基因组内结构和功能重叠明显的区域,包含增强子2、C基因启动子、直接重复序列1(DR1)和直接重复序列2(DR2),这些区段在HBV基因的复制、转录调节及表达中具有重要作用[1].目前,HBV慢性感染者疾病不同转归的机制尚不明确.
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成人手足口病四例患者肠道病毒71型的检测及核苷酸序列分析
目的 了解成人手足口病的病原体,并分析肠道病毒71型(EV71)核苷酸序列特征.方法 RT-PCR技术对4例成人手足口病患者标本进行肠道病毒基因检测,并测定EV71核苷酸序列,所得序列通过BLAST程序作EV71序列的进一步确认,与基因库中不同基因型EV71核苷酸序列进行比对分析、同源性分析,并构建种系进化树.结果 4例患者肠道病毒通用引物和EV71特异性引物RT-PCR检测均阳性.经BLAST分析,测序所得4条核苷酸序列(分别命名为GZl9610、GZ99310、GZ99355和GZ46477)与EV71毒株序列同源.序列分析表明,4条核苷酸序列之间的同源性为96.O%～99.1%,与2008年初我国安徽省阜阳市暴发的手足口病疫情所分离的EV71毒株同源性高.EV71序列遗传进化分析确定其均为EV71基因亚型C4,与阜阳、深圳、重庆、上海地区及2004年我国台湾地区流行毒株基因型一致,且距离近.结论 成人也可感染EV71引起手足口病,与我国现在及既往流行病毒株相比,此次4例成人手足几病患者感染的EV71未发生大的变异;应加强对成人手足口病患者的隔离治疗,以免其传播病毒引起疾病更大的流行.
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广州戊型病毒性肝炎暴发株和散发株部分序列比较
目的了解广州某部新兵连戊型病毒性肝炎(戊型肝炎)暴发流行的分子病毒学特征,并与当地散发毒株比较,以查找病原可能来源.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法,对抗HEV-IgM阳性的34例暴发性戊型肝炎及46例散发性戊型肝炎患者的血清和粪便标本进行HEV RNA检测,并对HEV RNA阳性标本的基因开放读码框(ORF)2部分片段进行克隆测序分析.结果 34例暴发流行病例标本中检测出12株病毒,46例散发病例标本中检到2株.经克隆测序分析,各暴发毒株的核苷酸同源性为95.3%～100%;氨基酸同源性为94.0%～100%.且暴发毒株和散发毒株的核苷酸及氨基酸的同源性也较高,分别为95.3%～99.3%和94.0%～100%;暴发毒株和散发毒株与各型中的标准株相比,与Japl株同源性高,其核苷酸同源性为92.0%～95.3%,氨基酸同源性为96.0%～100.0%.进化树分析提示本次戊型肝炎暴发流行病毒株与戊型肝炎病毒基因Ⅳ型距离近.结论 本次戊型肝炎暴发流行的病原可能来于广州本地;广州地区戊型肝炎流行毒株属戊型肝炎基因型Ⅳ型.
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寻常型银屑病与HLA-C第73位密码子相关性的研究
目的探讨寻常型银屑病与人类白细胞抗原(HLA)复合体C基因座位第73位氨基酸密码子的相关性。方法采用聚合酶链反应—变性聚丙烯酰胺凝胶电泳—DNA银染、测序，检测了104例寻常型银屑病患者和110例健康对照者的HLA-C基因第73位氨基酸密码子。结果寻常型银屑病患者编码HLA-C抗原第73位的丙氨酸序列、苏氨酸序列的频率与健康对照组差异有显著性，在有、无家族史的寻常型银屑病患者中差异亦有显著性。结论HLA-C第73位密码子与寻常型银屑病发病存在相关性；HLAC的第73位丙氨酸序列可能是该病的易感因素，而第73位苏氨酸序列似乎是该病的保护性因素。
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通用引物检测儿童血和脑脊液的6种疱疹类病毒
目的:通过PCR-RFLP、DNA克隆和测序分析来检测和区分6种疱疹类病毒,探讨其在临床上的应用价值.方法:在疱疹类病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中设计两对通用引物,一对扩增单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦-马尔病毒、人巨细胞病毒4种病毒,另一对扩增水痘-带状疱疹病毒和人类疱疹病毒6型2种病毒,经DNA PCR扩增,并对扩增产物进行分子克隆、序列分析后,选择BamHⅠ或BstUⅠ酶切扩增产物进行鉴别.后,对临床38份脑脊液(CSF,临床诊断为病毒性脑炎的病例)和49份血标本(其中27份为确诊病例,22份为临床诊断病例)进行疱疹病毒的检测.结果:38份CSF标本中13份阳性(34.2%),27份确诊病例标本均阳性(100%),22份临床诊断病例标本16份阳性(72.7%).这些阳性标本通过BamHⅠ或BstUⅠ两种酶切后能明确系何种疱疹类病毒.68例正常健康儿童的血和9份非病毒感染的脑脊液标本6种疱疹类病毒DNA均为阴性.结论:聚合酶链反应加限制性内切酶片段长度多态性分析为疱疹类病毒感染的临床诊断提供了一种有效的手段.
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杭州地区健康献血员输血传播病毒的检测及部分阳性标本的核苷酸序列分析
目的:了解杭州地区健康献血员中输血传播病毒(TTV) 的感染情况和病毒基因组片段的变异性.方法:用酚-氯仿法从献血员的血清标本中提取DNA,半套式聚合酶链反应检测TTV,部分阳性标本的扩增片段T-A克隆后测序.结果:203例献血员血清标本中TTV DNA的阳性率为15.3%,部分阳性标本扩增产物与报道的TTV TA278 株的核苷酸和氨基酸序列比较,其同源性分别为63.51%～67.12%和59.46%～66.22%.结论:杭州地区献血员中TTV的携带率比较高,献血员感染的TTV可能是一种新的基因型.
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大肠癌相关基因ST13转录启动区的增强子研究
目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～+74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.
关键词： ST13基因 增强子元件(遗传学) 碱基序列 -
幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定
目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)ureB基因并构建其原核表达系统.方法:采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增ureB基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的ureB表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性.结果:所克隆的ureB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.88%～97.82%,氨基酸序列同源性高达99.65%～99.82%.pET32a-ureB-BL21DE3系统的UreB融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40%左右.UreB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗体.结论:本研究成功地构建了Hp ureB高效表达系统,所表达的UreB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的抗原.
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幽门螺杆菌临床菌株hpaA基因的克隆和表达及鉴定
目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)hpaA基因,构建hpaA基因表达载体,鉴定其表达的融合蛋白免疫性.方法:采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增hpaA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的hpaA表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性.结果:所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为94.25%～97.32%,氨基酸序列同源性高达95.38%～98.46%.pET32a-hpaA-BL21DE3系统的HpaA融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40%左右.HpaA融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗体.结论:本研究成功地构建了Hp hpaA高效表达系统,所表达的HpaA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的抗原.
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大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定
目的:克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及霍乱弧菌肠毒素B亚单位(CTB)基因,构建其表达载体.方法:采用高保真PCR分别从E.coli 44815株与V.cholerae东74株基因组DNA中扩增LTB与CTB基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.分别构建pET32a的LTB及CTB表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达.采用SDS-PAGE及GM1-ELISA鉴定表达产物.结果:所克隆的LTB和CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为99.12%～99.71%和98.54%～99.42%,氨基酸序列同源性分别高达97.58%～99.19%和96.77%～99.19%.pET32a-LTB-BL21DE3和pET32a-CTB-BL21DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的30%和10%左右.GM1-ELISA结果证实LTB及CTB融合蛋白均能与牛GM1结合.结论:本研究成功地构建了LTB与CTB表达系统,所表达的LTB与CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性.
关键词： 大肠杆菌 ltB基因 霍乱弧菌 ctB基因 碱基序列 克隆 分子 LTB融合蛋白/免疫学 CTB融合蛋白/免疫学 -
幽门螺杆菌临床菌株flaB基因的克隆和表达及鉴定
目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)鞭毛素B基因(flaB),构建其原核表达系统,鉴定融合蛋白免疫性.方法:采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增flaB基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET32a的flaB表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性.ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中FlaB抗体和41株Hp临床菌株FlaB表达.结果:所克隆的flaB基因与报道的相应核苷酸序列同源性为96.31%～97.73%,氨基酸序列同源性高达99.41%～100.00%.pET32a-flaB-BL21DE3系统的FlaB融合蛋白表达量为细菌总蛋白的40%左右.FlaB融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗体.结论:本研究成功地构建了Hp flaB高效原核表达系统,所表达的FlaB融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性;Hp临床菌株FlaB表达率高,且能刺激机体产生抗体.FlaB可作为Hp疫苗及诊断试剂盒的抗原.
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2004年宁波大学流感爆发病毒株的血凝素基因分析
目的了解宁波地区流行性感冒(流感)病毒株的变异情况. 方法采集2004年5月宁波大学流感爆发期间病人的含漱液进行病毒分离、鉴定,并对其中1株病毒的血凝素重链区进行了核苷酸和氨基酸序列分析. 结果在9份样品中共分离到流感病毒3株,经血清学试验鉴定为甲3型.与2002年宁波市流感病毒流行株的核苷酸同源性为98.2%～98.3%,氨基酸同源性为96.7%～97.3%; 与2003年流行株的核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为97.6%; 与参考株A/Sydney/05/1997的核苷酸同源性为95.9%,氨基酸同源性为92.7%; 与参考株A/Wuhan /359/1995的核苷酸同源性为94.6%,氨基酸同源性为91.2%. 结论 2004年宁波大学流感爆发的病毒为甲3型.其HA1区序列更接近2003年流行毒株, 与A/Sydney/05/1997毒株的同源性要高于A/Wuhan /359/1995.该爆发流行的毒株可能是在宁波以前流行毒株的基础上进化而来的.
