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转基因鼠内外源基因比较的研究进展
转基因鼠在用于突变检测的同时,必须考虑外源基因突变在多大程度上代表内源基因的突变,即检测的一致性.本文综述了目前常见的几种转基因鼠,其内源性Hprt和Dlb-1基因与外源性LacI、LacZ和rps L基因在突变频率、突变位点、突变类型等方面的比较结果,并阐述了转基因鼠在毒理学研究中的应用前景和亟待解决的问题.
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复合营养素早期干预对阿尔茨海默病模型小鼠认知功能障碍的影响
目的 观察复合营养素对阿尔茨海默病模型——APP-PSN双转基因鼠认知功能障碍的早期干预效果.方法 36只两月龄的APP-PSN转基因鼠,随机分为干预组和对照组,干预组又分高低两个剂量组;12只APP-PSN转基因阴性鼠作为阴性对照组.干预组饲喂添加复合营养素的饲料,其他两组饲喂基础饲料.在干预3个月时,利用Morris水迷宫、穿梭实验、跳台实验三项试验评价各组的认知功能状况.结果 各组别的体重变化和摄食量没有统计学差异.干预组水迷宫的潜伏期明显短于对照组,而其跳台实验的潜伏期明显长于对照组,穿梭试验中高低干预组条件反应分别占46.67％和45.00％,对照组条件反应占20.83％.三项行为学实验,干预组与对照组均有统计学差异(P＜0.05),对照组和阴性组均有统计学差异(P＜0.05),干预组与阴性组均无统计学差异(P＞0.05).结论 复合营养素的早期干预能够延缓阿尔茨海默病模型小鼠的认知功能障碍的发生与发展.
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成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓增殖细胞的分化
目的 探讨成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内增殖细胞的类型及分化情况. 方法 对ALS转基因鼠发病期进行BrdU标记,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光双标及三标染色技术检测ALS转基因鼠病变进展过程中脊髓内增殖细胞的分化情况. 结果 成年ALS转基因鼠发病期脊髓的中央管、灰质、白质均未检测到BrdU/DCX双标记阳性细胞和BrdU/NeuN双标记阳性细胞.灰质、白质和中央管周围检测到大量NG2阳性细胞,阳性细胞数量随病变进展逐渐减少,NG2阳性细胞多呈BrdU阳性表达;可检测到少量BrdU/A2B5双标记阳性细胞;ALS转基因鼠发病期脊髓BrdU/GFAP双标记阳性细胞较多,部分双阳性细胞呈Nestin阳性,而野生型鼠脊髓内未检测到BrdU/GFAP双标记阳性细胞.结论 神经退行性病变激活ALS转基因鼠脊髓内源性增殖细胞向神经胶质细胞方向分化,未检测到向神经元方向分化,内源性增殖细胞尚不能有效地促进退行性病变的修复.
关键词： 肌萎缩脊髓侧索硬化症 脊髓 分化 免疫荧光 转基因鼠 -
成年肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓细胞增殖的研究
目的 观察成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内源性细胞的增殖和存活情况.方法对ALS转基因鼠进行BrdU注射,分别于不同时间点取材,冷冻切片,应用免疫荧光染色技术检测脊髓内细胞的增殖、分布和存活情况. 结果成年ALS鼠脊髓的中央管、灰质、白质均可检测到BrdU阳性细胞,经常可检测到形状相似、成对出现的细胞.在灰质内,BrdU阳性细胞主要分布于脊髓前角.在白质内,BrdU阳性细胞散在分布.前角ALS鼠脊髓内BrdU阳性细胞数量较野生型鼠多.BrdU末次注射后1d、14d均可检测到BrdU阳性细胞,但细胞数量逐渐减少,28d ALS鼠脊髓内仍可检测到少量BrdU阳性细胞,主要分布于中央管部位.增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的分布和变化规律与BrdU阳性细胞一致.在95d龄ALS鼠(BrdU末次注射1d后),脊髓中Nestin阳性细胞较野生型鼠多,多数Nestin阳性细胞分布于脊髓前角,某些细胞呈BrdU/Nestin双标阳性.在BrdU注射后14d、28d脊髓中,未检测到BrdU/Nestin双标阳性细胞. 结论神经退行性病变可激活ALS转基因鼠脊髓的细胞增殖,且细胞存活可达28d.
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分泌型卷曲相关蛋白4在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因鼠脊髓中的表达变化
目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白4(sFRP4)在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型鼠脊髓内的表达变化,及sFRP4在ALS发病中的作用.方法 选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各30只,分别于鼠95d、108d和122d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定,分离脊髓和制备冷冻切片,部分鼠分离脊髓,提取RNA和蛋白.分别应用免疫组织化学染色技术、RT-PCR和Western blotting检测sFRP4 mRNA和蛋白水平在不同时间点的变化情况.结果 与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠sFRP4 mRNA和蛋白表达在95d、108d和122d均升高(P< 0.05).免疫组织化学结果 显示,sFRP4阳性细胞主要分布在脊髓灰质前角,白质轴突呈阳性反应,与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠sFRP4阳性细胞明显增多.免疫荧光双标结果 显示,sFRP4标记的阳性细胞共表达胶质纤维酸性蛋白和β-tubulin Ⅲ,ALS转基因鼠sFRP4/GFAP双阳性细胞增多.结论 在ALS转基因鼠发病脊髓中sFRP4阳性细胞明显增多,sFRP4 mRNA和蛋白表达升高,表明sFRP4与肌萎缩脊髓侧索硬化症的发生密切相关.
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热休克蛋白27改善小鼠内毒素血症心功能不全的机制
目的 探讨Hsp27的保护作用是否与激活P13K/Akt信号通路、减轻炎症反应有关.方法 (1)诱导小鼠内毒素血症心肌特异性高表达Hsp27转基因鼠(Hsp 27 Tg)和野生型对照鼠(WT)均腹腔注射内毒素(LPS,10ms/ks);(2)心功能测定 LPS注射后6 h,以心脏超声评价,n:6;(3)P13K/Akt信号通路活性测定 LPS注射后1 h收集心脏,以Western blot法测定Akt及Gsk-3(的磷酸化水平,n=4;(4)NF-B炎症通路活性检测 LPS注射后1 h以Western blot测定IκBα水平,n=4;同时在大鼠心肌细胞中进行相同实验,n:3;(5)心肌细胞凋亡LPS注射后24 h,以TUNEL法检测,,n=4.结果 (1)Hsp27显著改善LPS所致的心功能不全.与基础值相比,LPS处理使WT,Hsp27 Tg均出现心功能不全,但Hsp 27 Tg的心功能不全程度显著轻于WT(P<0.01或P<0.05).(2)Hsp27显著抑制LPS所致的IκBα降解.与WT比较,高表达Hsp27显著减轻了LPS诱导的小鼠心肌IκBα降解[(41.43±24.10)%vs.(72.92±9.20)%,P<0.05],培养的大鼠心肌细胞实验结果与之类似.(3)Hsp27可增强激活P13K/Akt信号通路.LPS处理后,WT和Hsp27Tg鼠心肌组织中磷酸化Akt水平分别为(3.11±0.83)和(5.13±0.73),磷酸化GSK-30水平分别为(3.19±1.04)和(5.71±1.20).与WT比较,Hsp27Tg心肌组织中的磷酸化Akt和GSK-3β水平均显著提高(P<0.05).类似结果在体外培养的细胞实验中也被证实.(4)Hsp27显著抑制LPS所致的心肌细胞凋亡.LPS处理后24 h,WT和Hsp27Tg心肌细胞凋亡率分别为(6.46±1.74)%和(2.88±0.91)%,与WT比较,心肌细胞凋亡在Hsp27Tg中被显著减轻(P<0.01).结论 高表达Hsp27对小鼠内毒素血症心功能不全有显著改善作用,其保护作用与激活P13K/Akt信号通路、抑制NFκB;依赖性炎症反应有关.
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蛋白激酶Cη转基因过渡表达未引起心肌肥厚和心衰--介绍转基因小鼠体内心功能评价方法
目的蛋白激酶Cη(PKCη)转基因对心脏表型的影响.方法表达低水平(Tg-PKCη-L)和高水平(Tg-PKCη-H) 靶心脏野生型PKCη的转基因小鼠通过标准技术被建立.Tg-PKCη-L、Tg-PKCη-H阳性鼠通过PCR和Southern 印迹鉴定,转基因阴性鼠作为研究对照.用非开胸经颈总动脉插管的显微外科技术测血液动力学指标和评价小鼠左室收缩功能.Western免疫印迹分析α-骨骼肌肌动蛋白(α-Skeletal Muscle Actin)和PKCη表达水平.苏木精染色进行心脏组织学分析.结果与对照鼠相比Tg-PKCη-L、Tg- PKCη-H鼠基线左室大收缩压、左室收缩压、大收缩速率(dp/dt)、-dp/dt、左室舒张末压、舒张压均无明显变化(均P>0.05),异丙肾上腺素激发后左室dp/dt剂量依赖的升高无明显抑制(均P>0.05).此外,Tg- PKCη- H、Tg-PKCη-L鼠心脏/体重比、心肌α-肌动蛋白表达无显著变化,(P>0.05),心肌组织学分析表现了正常的心肌细胞形态.结论低水平和高水平PKCη的转基因过渡表达未导致心肌肥厚、心衰表型的出现.用非开胸经颈总动脉插管的显微外科方法能敏感、准确地评价小鼠左室收缩功能.
关键词： 蛋白激酶Cη(PKCη) 转基因鼠 心肌肥厚 心衰 -
CaMKIIδC在心肌肥厚中被激活并诱导扩张型心肌病及心衰
近研究证实,转基因表达Ca2+/calmodulin依赖的蛋白激酶Ⅳ(CaMKIV)或CaMKIIδB这两种定位于细胞核内的蛋白激酶可以导致心脏肥厚.然而,CaMKIV不在心脏中表达,心肌细胞在表达核蛋白CaMKIIδB同时也表达其胞浆同功酶CaMKIIδC.在近的研究中,我们证实在压力负荷出现后的第二天以及其后的连续七天里,CaMKII的δC同功酶的表达选择性增强,磷酸化活性升高.为了确定胞浆δC同功酶活性的增加是否会使Ca2+调节蛋白磷酸化并且导致心肌肥厚,我们培育了表达CaMKI-IδC同功酶的转基因小鼠.从这些小鼠中分离出心肌细胞做免疫细胞化学染色表明,转入基因的表达仅限于细胞浆.这些小鼠表现出扩张型心肌病,心肌短縮分率的降低超过65%,并在幼年死亡.分离出的心肌细胞体积变大,收缩能力降低,Ca2+摄入能力也发生改变.Ryanodine受体(RyR)CaMKII位点的磷酸化在心衰发生前就有增加,免疫共沉淀表明CaMKII可以与转基因鼠中的RyR发生作用.PLB的磷酸化同样在CaMKII位点被特异性增强,但其PKA磷酸化位点未发生改变.这些发现首次阐明CaMKIIδC能够在体内介导Ca2+调节蛋白的磷酸化,并为CaMKIIδC的活化参与了扩张型心肌病和心衰的病程提供了证据.
关键词： Ca2+/calmodulin 依赖的蛋白激酶Ⅱ 转基因鼠 扩张型心肌病 心衰 -
经诱导的绿色荧光蛋白转基因C57BL雄鼠脾细胞移植重建雌鼠造血功能研究
目的 探讨雄性C57BL绿色荧光蛋白(GFP)鼠诱导的脾细胞移植对造血衰竭小鼠造血重建的作用.方法 建立小鼠造血衰竭模型,移植鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞,检测诱导后细胞的干细胞标志抗原表达;观察受体存活时间,检测外周血白细胞计数、外周血GFP阳性细胞,进行荧光原位杂交检测Y染色体;各组受体脾和肺切片观察GFP细胞分布.结果 鱼卵提取物诱导的雄性C57BL荧光鼠脾细胞比未诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原.1×106个脾细胞经尾静脉回输经致死剂量照射的雌性小鼠,明显延长小鼠存活时间,提高小鼠外周血白细胞计数.诱导组受体外周血中检测到GFP阳性细胞,骨髓中检测出60%的细胞含Y染色体.诱导组受体脾和肺切片观察到GFP阳性细胞分布.结论 鱼卵提取物诱导的小鼠脾细胞中含较多的多能干细胞,回输给造血衰竭小鼠能重建其造血功能.
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JC病毒T抗原诱发肺肿瘤转基因动物模型检测
目的:利用细胞角蛋白19(K19)启动子构建胃黏膜上皮细胞中JC病毒(John Cunningham virus,JCV)T抗原表达转基因鼠,试图建立胃黏膜自发肿瘤动物模型.方法:利用限制性内切酶NdeⅠ,酶切K19-JCV T抗原表达质粒,电泳分离带有K19启动子的T抗原核酸序列后,显微注射入C57BL/6J 30只小鼠受精卵中.PCR检测转基因阳性鼠,组织学观察主要脏器的形态学表现及免疫组化检测T抗原表达.结果:显微注射K19-JCV T抗原(KT) DNA片段后成功获得11种转基因阳性鼠,其中2个月龄KT7的各脏器组织学检测显示,脑、肝、肾、食管、前胃、胃、小肠、大肠、胰腺、肺、心脏和脾组织未见异常形态学改变,JCV T抗原特异表达于胃黏膜上皮细胞和支气管上皮细胞的细胞核中,16个月龄的KT7转基因鼠13.3％ (2/15)出现肺肿瘤和腺癌的病理学改变,T抗原定位于癌细胞细胞核中.结论:JCV T抗原直接诱发肺肿瘤动物模型的建立为JCV T抗原嵌入所致上皮肿瘤提供了直接的实验依据,为JCV所致上皮肿瘤发生和演进分子机制奠定基础,同时为抗肿瘤药物筛选及基因治疗监控提供了良好的动物模型.
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饮水中微囊藻毒素与我国原发性肝癌关系的研究
目的阐明在肝癌高发区东南沿海肝癌与水中微囊藻毒素(MC)的关系。方法应用生态学、病例对照、定群、Meta分析和危险度评估等流行病学调查方法。通过F344和HBVx转基因鼠动物试验进一步证明。结果用Meta分析的方法对6个肝癌病例进行对照研究，结果表明，饮沟塘水的合并比数比为2.46(95%CI，1.69～2.59)，归因危险度为30.39%(95%CI,23.30%～37.47%),一致性检验P＞0.05。沟塘水由于富营养化，造成藻类疯长，藻细胞死后释出藻类毒素。实验室研究证明，这种毒素是趋肝的促癌因素，在HBVx转基因鼠中，与起始剂黄曲霉毒素和MC一起可引起肝细胞肝癌。结论沟塘水中以MC为代表的藻类毒素是趋肝致肝炎和肝癌的促癌剂。MC与乙型肝炎和黄曲霉毒素3个环境危险因素组合，可能是我国肝癌高发的原因之一。
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脑缺血对阿尔茨海默病转基因鼠记忆功能的影响
目的 观察脑缺血对阿尔茨海默病转基因鼠记忆功能的影响.方法 选用3月龄携带突变淀粉前体蛋白(APP)基因和早老素-1(PS1)基因的转基因鼠与非转基因鼠,应用光化学法诱导脑梗死形成并将转基因鼠与非转基因鼠分别分为脑缺血组和假手术组,以TTC方法测定脑梗死体积,应用Morris水迷宫试验测定记忆功能.结果 梗死后第7 d APP/PS1转基因鼠总梗死体积和皮层梗死体积显著大于非转基因鼠(n=6,P＜0.01);与假手术组相比,缺血组APP/PS1转基因鼠在梗死后第4 d逃避潜伏期显著延长(P＜0.01),在梗死后第7 d目标象限游泳时间显著缩短(P＜0.05);缺血组非转基因鼠上述两项指标均无显著变化.人为地将非转基因鼠分为大梗死体积非转基因鼠组和小梗死体积非转基因鼠组,梗死体积相似的APP/PS1转基因鼠组和大梗死体积非转基因鼠组记忆功能间差别有显著性意义(P＜0.05).结论 脑缺血促进APP/PS1转基因鼠记忆障碍提早发生,其机制与梗死体积无关.
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5×FAD阿尔茨海默病小鼠模型的研究现状及展望
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是多种因素共同作用的多病因疾病.因AD的发病机制复杂,现有的动物模型不能满足对其病因及治疗药物研究的需要.携带5个家族性基因突变的APP/PS1转基因AD模型小鼠(transgenic mice with five familial Alzheimer's disease,5×FAD)为新型AD模型小鼠,该转基因小鼠具有与AD相似的功能学及病理变化特征,与其他AD模型动物相比其神经病理学变化更为明显.5×FAD小鼠是可以用于研究AD发病机制、治疗靶点及治疗药物的动物模型.
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转基因鼠前列腺癌模型CT灌注成像及介入治疗初探
目的 运用CT灌注成像评价转基因鼠前列腺癌模型生长过程中的血流灌注情况并报告初步介入治疗结果.方法 6只转基因鼠前列腺癌模型及正常小鼠5只进行CT灌注成像;1只转基因鼠前列腺癌模型进行介入手术(TAE).结果肿瘤边缘的BF、BV,大于肿瘤中心和正常前列腺组织,P＜0.01,后两者没有明显差异,P＞0.05.MTT方面,三者没有明显差异(P＞0.05).PD方面,肿瘤中心大于肿瘤边缘和正常前列腺组织,P＜0.01,后两者没有明显差异,P＞0.05.1只转基因鼠成功行介入手术(TAE),CT扫描显示碘油沉积在肿瘤内,处死后病理观察肿瘤坏死严重.结论 CT灌注成像技术可以用来评价转基因鼠前列腺癌模型的血流动力学变化,介入治疗对前列腺癌具有潜在的临床应用价值.
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脂肪细胞因子 CTRP4转基因鼠的构建与鉴定
目的：建立人CTRP4基因的转基因小鼠，为脂肪细胞因子CTRP4的体内功能研究奠定基础。方法首先构建人CTRP4的转基因小鼠线性化表达载体，再利用显微注射的方法将载体注射入小鼠受精卵，从而构建人CTRP4的首建鼠（ Founder ）并与野生型小鼠交配繁殖得到F1代阳性小鼠，再通过近亲繁殖与测交的方法，得到CTRP4转基因纯合子小鼠，并通过PCR和western blot 的方法对纯合子小鼠进行鉴定。结果得到人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠两个品系，western blot鉴定该转基因小鼠心脏，肝脏，脑，肾脏等多种组织中均呈现CTRP4高表达。结论成功构建了人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠。
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转基因鼠在脑缺血氧化应激研究中的应用
活性氧自由基作为脑内一类重要的病理因素直接或间接地参与脑缺血/再灌注的损伤过程.氧自由基不仅受到脑内促氧化酶与抗氧化酶间平衡的调节,同时也参与了细胞内信号转导通路,在神经元死亡中发挥着决定性作用.近年来,转基因及基因敲除鼠已广泛应用于这些影响活性氧自由基的形成和清除过程的酶类物质及各种介导细胞死亡与凋亡过程的蛋白质的研究中,为脑缺血/再灌注损伤治疗的基础及应用提供了必要条件.
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转基因鼠中人α类珠蛋白基因簇染色质构象调控变化
目的 用人珠蛋白转基因鼠模型建立染色质构象捕获的技术体系,探讨人α类珠蛋白基因簇的染色质构象变化与基因表达调控的关系.方法 使人α类珠蛋白转基因纯合子公鼠与KM母鼠交配,从怀孕14.5 d的母鼠体内取出珠蛋白基因表达组织胎肝和非表达组织胎脑细胞,用甲醛交联固定细胞核内的染色质构象,限制性内切酶NcoⅠ消化后用T4 DNA连接酶连接,解交联后提取并纯化连接的基因组DNA,在连接位点的两侧设计引物,用半定量PCR分析胎肝和胎脑中人α类珠蛋白基因簇染色质构象模式.结果 以含HS40的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,表达的珠蛋白基因α2、α1的酶切片段与其交联效率明显高于胎脑,含有已关闭珠蛋白基因ζ的酶切片段与其交联效率与胎脑相当.以含α2的限制性酶切片段作固定片段时,在胎脑中其他限制性酶切片段与其交联效率随线型距离增加而降低;而在胎肝中,上游调控元件HS 40和33与其交联效率明显高于胎脑;HS 10和8与其交联效率略低于胎脑.结论 在表达组织中,人α类珠蛋白基因簇上游远端调控元件通过形成染色质环与下游表达基因靠近,从而调控α类珠蛋白基因的表达;而在非表达组织中,无此染色质环形成.
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JCV病毒T抗原诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立
目的 利用α-crystallin启动子构建晶状体上皮细胞中JCV T抗原表达转基因鼠,试图建立晶状体自发肿瘤动物模型.方法 利用限制性内切酶(Bcll)分离pBSK(pBluescript SK)-T抗原,BamH I同尾连接插入以pBSK为载体的α-crystallin启动子下游,通过Ncil酶切电泳分离带有α-crystallin启动子的T抗原核酸序列后显微注射入C57BL/6J小鼠受精卵中.PCR检测转基因阳性鼠及JCV病毒T抗原拷贝数,大体和组织学观察眼球及病变组织,免疫组织化学观察T抗原、p53和β-catenin表达.结果 成功构建α-crystallin JCV T抗原表达质粒,转基因阳性鼠中2号鼠(αAT-2)拷贝数高,该鼠眼球于11个月表现出肿瘤样改变,肿瘤细胞中T抗原、p53和β-catenin呈强阳性表达.结论 JCV T抗原直接诱发晶状体上皮肿瘤动物模型建立为JCV T抗原嵌入所致上皮肿瘤提供了直接实验依据,为JCV所致上皮肿瘤发生和演进分子机理研究奠定坚实基础,同时为抗肿瘤药物筛选及基因治疗监控提供了良好的动物模型.
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晶状体自发肿瘤转基因鼠脑横截面标本制备及鉴定
目的 确定JCV T抗原诱发晶状体肿瘤转基因鼠脑中肿瘤来源及路径.方法 18月龄转基因鼠麻醉后4％多聚甲醛灌流固定,EDTA脱钙颅骨软化后脑经横截制备石蜡标本并进行HE染色.免疫组化和免疫荧光确定脑组织T抗原表达.结果 经过脱钙处理后颅骨组织非常软,横截后发现白色肿瘤组织蔓延至脑组织中,HE染色确定眼部和脑部白色组织均为晶状体肿瘤细胞,免疫组化和免疫荧光结果显示细胞核中存在T抗原强阳性表达.结论 JCV T抗原诱发晶状体肿瘤是经过视神经孔进入脑组织,鼠头横截面组织标本制备对研究头部肿瘤的毗邻关系和肿瘤组织在脑组织中侵袭部位极具应用价值.
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脑源性神经营养因子靶向药物的制备及其对阿耳茨海默转基因鼠的治疗作用
目的:检测脑源性神经营养因子(BDNF)靶向药物对阿耳茨海默病(AD)转基因鼠的治疗作用.方法:将BDNF与抗胰岛素受体单克隆抗体(29B4)相结合,制备嵌合肽BDNF-PEG-29B4/SA.药物静脉注入AD转基因鼠tg2576体内,应用ELISA方法检测AD转基因鼠脑内BDNF的粥样蛋白(Aβ)的含量.结果:AD鼠脑内的BDNF浓度较高和平稳.可以有效降低AD转基因鼠脑内Aβ含量.结论:BDNF-PEG-29B4/SA可以通过主动转运进入血脑屏障,对AD转基因鼠有治疗作用.
