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支气管哮喘患者外周血IL-15的测定及意义
目的探讨IL-15在支气管哮喘发病机制中的作用.方法收集20例哮喘急性发作患者、20例缓解期患者、20例健康人的血清,采用ELISA测定IL-15和IgE的含量;采外周血按常规做嗜酸性粒细胞(EOS)计数.结果急性发作期患者血清IL-15水平明显高于缓解期及正常对照组(P<0.05),发作期IL-15水平与EOS计数呈正相关(r=0.696,P<0.01),与IgE水平呈正相关(r=0.593,P<0.01).结论 IL-15参与了哮喘的发病过程,其机制可能是通过抑制EOS凋亡、提高IgE水平参与哮喘的变应性炎症.
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复方独活寄生合剂治疗佐剂性关节炎大鼠的实验研究
目的:研究独活寄生合剂对佐剂性关节炎大鼠模型血清中IL-1β、IL-15及TGF-β1表达水平的影响,探讨独活寄生合剂对佐剂性关节炎的治疗作用及相关机制.方法:雌性大鼠40只,随机分为正常对照组、佐剂性关节炎模型组、独活寄生汤治疗组、强的松治疗组,每组10只,2周后,处死全部大鼠,断头取血,检测血清中IL-1β、IL-15及TGF-β1表达水平.结果:模型组与正常组比较,血清IL-1β、IL-15水平升高,TGF-β1水平降低,治疗组与模型组比较血清IL-1β、IL-15表达水平明显降低,TGF-β1表达水平上调.结论:独活寄生合剂降低佐剂性关节炎大鼠血清IL-1β、IL-15的表达,上调TGF-β1的表达水平,对类风湿性关节炎的治疗有一定意义.
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抗CD28单抗和IL-15对CIK增殖和杀肿瘤作用的研究
CIK是肿瘤过继性细胞免疫治疗中的免疫效应细胞.为使CIK在实验室里能被更有效地诱导增殖并赋予其更强的杀肿瘤效应,我们在CIK常规培养环境中加入抗CD28单抗和IL-15,探讨抗CD28单抗和IL-15对CIK增殖和杀肿瘤效应.取人外周血单个核细胞(PBMC),预先以常规方法诱导CIK,然后加入抗CD28单抗和IL-15与CIK共培养.用全自动五分类血液分析仪计数CIK增殖率;用流式细胞术测定CIK中粒酶B、穿孔素和CD107a等分子的表达率;用ELISA方法检测CIK分泌IL-10、IL-12、INF-γ和TNF-α水平;用乳酸脱氢酶释放法测定CIK对人肺癌细胞株(A549)、乳腺腺癌细胞株(MFC-7)和人黑素瘤细胞株(HME1)的杀伤活性.PBMC经常规CIK诱导培养以后再加入抗CD28单抗和IL-15与对照组比较,前者细胞增殖率明显增强(P＜0.05);在CIK培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15可促进颗粒酶B、穿孔素和CD107a等分子的表达率进一步增强(P＜0.05);加入抗CD28单抗和IL-15,培养8d后CIK对A549、MFC-7和HME1细胞杀伤活性分别为82.2％、59.3％和70.6％,与对照组(分别为60.9％、49.6％和48.4％)相比差异有统计学意义(P＜0.05);在培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15,培养8d后其细胞因子IFN-7γTNF-α分泌水平显著高于对照组(P＜0.05),组间IL-10和IL-12的分泌量未见显著差异(P＞0.05).实验说明在CIK培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15可增加CIK增殖率并提高其抗肿瘤效应.
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双表达外源性4-1BBL/IL-15的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究
为肿瘤过继免疫治疗开发体外激活T细胞、NK细胞的高效途径,研究双表达外源性4-1BBL和IL-15的K562细胞刺激外周血淋巴细胞活化的能力.采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和IL-15基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-IL-15.经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、IL-15分子的K562细胞(K562/4-1BBL/IL-15).经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/IL15细胞和K562细胞分别用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24 h,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达.对NK细胞不仅同时检测活化性受体NKG2D的表达,还用乳酸脱氢酶释放法观察NK细胞受不同刺激细胞作用后,细胞毒活性的变化.结果显示受K562/4-1BBL/IL15细胞刺激后,T细胞CD69的表达无明显变化.γδT细胞CD69表达增长5倍.NK细胞CD69表达增长6倍,而NKG2D的表达增加1.5倍;NK细胞受K562/4-1BBL/IL15细胞作用72 h后,细胞毒活性明显提高.提示双表达4-1BBL/IL-15的K562细胞能够高效激活γδT细胞及NK细胞,有望用于肿瘤的过继免疫治疗.
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IL-15在类风湿关节炎治疗中的研究进展
IL-15是一种非常重要的致炎症细胞因子,它在类风湿关节炎中的表达机制尚不清楚.因而对类风湿关节炎的传统治疗,尤其是对TNF-a的抗体治疗,其效果不理想.随着免疫学的进一步研究,发现类风湿关节炎滑膜细胞表面能够持续地高表达IL-15,这提示IL-15在类风湿关节炎的发病机制中具有重要的作用.本文阐述了近年来IL-15对类风湿关节炎发病机制的研究中所取得的一些认识和进展,以期为以后的研究工作提供帮助.
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γc家族细胞因子对体外培养T细胞表型的影响
目的:探讨γc家族细胞因子对体外培养T细胞表型的影响,为过继免疫治疗体外细胞制备提供实验依据.方法:采用健康人外周静脉血单个核细胞(PBMC),应用尼龙毛柱法、CD3磁珠阳性分选法、CD3磁珠阴性分选法和自然沉降法等4种方法分选T细胞,比较各种方法获取的T细胞纯度、回收率和细胞增殖.用CD3/CD28免疫磁珠激活CD3+T细胞,γc家族细胞因子分为IL-2组和IL-7、IL-15、IL-21混合组,比较两组T细胞扩增倍数和表型的差异.结果:CD3磁珠阴性分选的T细胞纯度显著高于尼龙毛柱分选、CD3磁珠阳性分选、自然沉降分选[(94.06±1.07)％vs (86.74±1.06)％、(89.61±1.40)％、(88.48±1.86)％,P＜0.05],自然沉降分选的T细胞回收率显著高于其余3种分选法[(60.29±1.53)％ vs (45.03±2.79)％、(20.15±3.41)％、(42.98±2.82)％,P＜0.05),综合比较效果以自然沉降法为优选择.IL-2组T细胞扩增倍数显著高于混合组[(262.6±143.2)vs(73.0±25.8)倍,P＜0.05].混合组的早期记忆T细胞占总T细胞的比例、Tscm和Tscm-like、Tcm所占比例均显著高于IL-2组[(55.6±±.82)％ vs (39.6±±.52)％,(16.6±±.82)％ vs(9.8±1.30)％,(39.0±1.58)％ vs (29.2±1.79)％;均P＜0.05].结论:自然沉降法从PBMC中分选T细胞具有低成本、高纯度、高回收率的优势.IL-7、IL-15和IL-21混合培养有利于早期记忆T细胞的生成,为肿瘤过继免疫治疗的体外细胞制备提供了实验依据.
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转基因细胞株BaF3-mb15-RAE对IKDC功能分子表达的影响
目的:探讨单独或共同表达视黄酸早期转录因子1ε(retinoic acid early transcript 1ε,RAE1ε)和膜型IL-15的B淋巴细胞BaF3对小鼠产生IFN的杀伤性DC(IFN producing killer DC,IKDC)功能分子表达的影响.方法:以小鼠原B淋巴细胞株BaF3为基础,分别构建表达膜型IL-15的BaF3-mb15细胞和表达RAE1ε的BaF3-RAE细胞及同时表达膜型IL-15和RAE1ε的BaF3-mb15-RAE细胞.通过体外细胞因子诱导产生骨髓来源的小鼠成熟DC,将丝裂霉素灭活后的3株BaF3工程细胞株作为刺激细胞,分别与DC共培养,流式细胞术检测其对DC中CD11clowB220+NK1.1+IKDC比例和DC表面CD40、CD80表达的影响.流式细胞术分选DC中的IKDC,将丝裂霉素灭活后的3株BaF3工程细胞株与其共培养24 h,流式细胞术检测共培养对IKDC表面CD40、CD80、CD86、NKG2D、MHCⅡ类分子、CD107a和FasL表达的影响.结果:成功获得骨髓来源的小鼠成熟DC.与BaF3-mb15细胞和BaF3-RAE细胞相比,BaF3-mb15-RAE细胞刺激显著提高DC中IKDC比例[(50.0±5.6)％ vs(30.3±8.2)％、(36.0±4.6)％,均P＜0.05],并且有效刺激IKDC表面CD40(180.1±28.2 vs 44.7 ±7.8、36.0±3.1,P＜0.01)和FasL(P＜0.05)表达上调;与BaF3细胞和BaF3-mb15细胞相比,BaF3-mb15-RAE细胞有效刺激IKDC表面CD80(P＜0.05)表达上调,而3株BaF3工程细胞刺激均不影响DC表面CD40、CD80的表达(P＞0.05);同时,3株BaF3工程细胞对IKDC表面CD86、MHCⅡ类分子、NKG2D和CD107a的表达也没有显著影响(P＞0.05).结论:RAE-1ε和膜型IL-15协同作用可促进IKDC增殖并诱导其高表达CD40和FasL.
关键词： IL-15 视黄酸早期转录因子1ε 产生IFN的杀伤性DC FasL 肿瘤免疫 -
IL-2+IL-15组合培养方案对乳腺癌患者外周血中NK细胞体外扩增的效果
目的:观察IL-2+ IL-15组合体外培养方案对于NK、NKT和T细胞亚群的比例、表型、杀伤肿瘤细胞活性与黏附活性的影响,并初步探讨其作用机制.方法:采集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年5月至2012年7月期间收治的5例乳腺癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用IL-2+ IL-15联合培养方案进行培养,观察培养15 d后细胞的扩增倍数和淋巴细胞亚群比例变化,流式细胞术检测细胞免疫表型、细胞表面受体的表达,LDH释放法和CD107a释放法检测不同细胞亚群对于HLA匹配或不匹配的靶肿瘤细胞系的杀伤活性,活细胞工作站检测总扩增产物对于不同靶肿瘤细胞系的黏附作用.结果:与扩增前相比,IL-2+ IL-15培养方案扩增15 d后,NK细胞[(36.74±17.10)％vs (16.34±3.12)％,P＜0.05]、NKT细胞[(24.88±12.34)％ vs (4.06±2.05)％,P＜0.05]比例显著增加,CD4+T细胞和Treg细胞比例显著降低(P＜0.05),CD8+T细胞比例显著升高(P ＜0.05);NK细胞表面活化受体NKp30[(92.38±7.19)％vs(32.14±17.64)％,P ＜0.05]、NKp44[(74.26±16.28)％ vs(1.94±1.60)％,P＜0.05]、NKG2D[(98.58±1.28)％ vs(66.50±24.84)％,P＜0.05]的表达率均显著升高,CD16表达率显著降低[(85.12 ±7.66)％ vs(95.60±2.53)％,P＜0.05];NKT细胞、T细胞表面活化受体DNAM-1和NKG2D明显升高(P＜0.05).总扩增产物、NK细胞和NKT细胞对HLA不匹配的靶肿瘤细胞的杀伤率均显著高于HLA匹配靶细胞系的杀伤(P＜0.05);在共孵育至84 min时,与HLA匹配的靶肿瘤细胞系相比,总扩增产物细胞与HLA不匹配的靶细胞系黏附结合数目显著增多[(4.80±0.53)vs(2.25±0.35)个,P＜0.05].结论:IL-2+ IL-15组合方案在扩增NK细胞的同时,也能够有效扩增NKT细胞,即可以扩增CD56+细胞群.并且,扩增产物主要以不受HLA限制的NK细胞杀伤活性为主来杀伤肿瘤细胞.
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去甲斑蝥素增强IL-15活化的PBMC对白血病KG1a细胞的杀伤作用
目的:探讨去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是否能增强IL-15活化的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)对人急性髓系白血病KG1a细胞的杀伤作用及其可能机制.方法:锥虫蓝拒染法、CCK-8法检测NCTD对KG1a细胞增殖的影响,流式细胞术检测NCTD对KG1a细胞周期的影响,LDH释放法检测IL-15活化的PBMC(IL-15-PBMC)对NCTD处理后KG1a细胞的细胞毒活性,流式细胞术检测KG1a细胞表面NKG2D(natural killer group 2 member D)配体的表达.结果:NCTD有效抑制白血病KG1a细胞的增殖,呈时间(r=0.398,P=0.000)和剂量依赖性(r=0.861,P=0.000),并阻滞KG1a细胞周期于G2/M期；4μg/ml以下的NCTD对IL-15-PBMC没有明显的增殖抑制作用(P＞0.05).当效靶比为10∶1和20∶1时,IL-15-PBMC对0.125 μg/ml NCTD处理后KG1a细胞的杀伤率较对照组明显增加[志愿者A:(37.44±5.78)％ vs (9.33±1.69)％,(38.33±3.07)％vs (16.75 ±1.20)％；P＜0.05].NCTD不影响KG1a细胞表面NKG2D配体蛋白的表达(P＞0.05).结论:NCTD能增强IL-15-PBMC对白血病KG1a细胞的杀伤作用,可能与抑制细胞增殖、阻滞细胞周期于G2/M期有关.
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CD137单抗联合IL-15体外扩增NK细胞及其对肺癌细胞的杀伤活性
目的:建立CD137单抗联合IL-15体外扩增NK细胞的方案,研究扩增后NK细胞对肺癌细胞的杀伤活性.方法:分离健康人外周血单个核细胞,经免疫磁珠阴性分选获取CD3 CD56+ NK细胞,将NK细胞分成对照组、IL-2组、IL-2+CD137单抗组、IL-2+ IL-15组、IL-2+ CD137单抗+IL-15组进行培养,经锥虫蓝染色法计算NK细胞的扩增倍数,流式细胞术检测NK细胞的表型,LDH酶释放法检测NK细胞对肺癌细胞株A549的杀伤活性,ELISA法检测扩增后NK细胞培养液上清中IFN-γ的分泌量.结果:经磁珠分选后NK细胞纯度为(93.28±3.21)％.IL-2+ CD137单抗+IL-15组NK细胞扩增倍数明显高于IL-2+ CD137单抗组、IL-2+IL-15组、IL-2组及对照组[(86.20 ±5.00)vs(60.01 ±5.00)、(49.06±4.39)、(17.04±1.49)、(3.95 +0.23)倍,P＜0.01].IL-2+ CD137单抗+IL-15组NK细胞对A549细胞的杀伤效率明显高于其他各组[(93.14±3.27)％vs (83.15 ±4.03)％、(71.25±3.24)％、(62.27±3.01)％、(49.38±2.35)％,P＜0.01]. IL-2+CD137单抗+IL-15组培养液上清中的IFN-γ的分泌水平明显高于IL-2+CD137单抗组、IL-2+IL-15组、IL-2组及对照组[(296.25±9.79)vs(260.47±11.55)、(201.13±6.36)、(138.36±6.09)、(38.42 ±3.56) pg/ml,P ＜0.01].结论:CD137单抗联合IL-15能高效扩增NK细胞,扩增的NK细胞高效杀伤A549肺癌细胞.
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IL-2、IL-15增强免疫编辑后NK细胞NKG2D的表达及其对鼻咽癌CNE2细胞的杀伤活性
3.56)%、(40.18±2.94)%,IL-2再培养组、IL-15再培养组明显提高编辑后NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性(P＜0.01),IL-15的作用强于IL-2.结论:高剂量IL-2、IL-15可以上调免疫编辑后NK细胞表面NKG2D的表达,恢复编辑后NK细胞对鼻咽癌细胞CNE2的杀伤活性,IL-15的作用强于IL-2.
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去甲斑蝥素联合IL-12、IL-15处理增强PBMC对Raja细胞的杀伤效应
目的:探讨细胞因子IL-2、IL-15激活的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)对去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)处理后的人Burkitt淋巴瘤Raji细胞的杀伤效应及其可能机制.方法:锥虫蓝拒染法检测NCTD对Raji细胞和PBMC细胞增殖的影响；LDH释放法检测IL-2、IL-15激活后的PBMC对K562细胞和Raji细胞的杀伤；流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测IL-2、IL-15诱导后PBMC表面NKG2D的表达,以及NCTD作用前后Raji细胞表面NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达.结果:NCTD抑制Raji细胞的增殖,具有剂量、时间依赖性(P＜0.05),但对PBMC增殖无影响(P＞0.05).在效靶比为10∶1、20∶1时,IL-2、IL-15激活的PBMC对K562细胞的杀伤率较未激活的PBMC明显增高[(52.42±3.89)％vs (15.82±5.12)％,(79.55±9.22)％vs(27.67±3.66)％,P＜0.05]；PBMC对NCTD处理后Raji细胞杀伤率较未经NCTD处理的Raji细胞明显增高[(23.63±6.20)％vs (5.04±1.25)％,(41.80±4.09)％ vs (8.59±2.19)％；P＜0.05],且IL-2、IL-15激活的PBMC对NCTD处理后Raji细胞的杀伤率较NCTD处理前明显提高[(38.97±2.76)％ vs(13.19±3.67)％,(63.09 ±7.30)％ vs(19.89 ±4.15)％；P＜0.05].激活后PBMC表面NKG2D表达率升高[(44.91±5.85)％vs (25.28±7.69)％,P＜0.05].NCTD作用后Raji细胞表面NKG2D的配体ULBP2表达显著升高[(12.69±3.99)％vs(1.03 ±0.42)％,P＜0.05],而其他配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP3的表达无明显变化(P＞0.05).结论:NCTD联合细胞因子IL-2、IL-15处理能增强PBMC对Raji细胞的杀伤效应,其机制与NCTD上调Raji细胞表面ULBP2表达和细胞因子上调PBMC表面NKG2D表达有关.
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四种NK细胞体外扩增方案的比较
目的:通过对4种NK细胞体外培养方案扩增后产物的细胞免疫表型、扩增倍数以及杀伤活性进行比较,确定一种高效的NK细胞体外扩增方案.方法:建立4种NK细胞体外培养方案:方案1为经典的NK细胞体外扩增方案(IL-2+IL-15)；方案2为IL-2+ IL-15+ IL-18；方案3为IL-2+ IL-15+ IL-7；方案4为新型NK培养基(IL-2+ OKT3).收集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年2月至2012年4月间10例晚期实体瘤患者的PBMC,按照4种方案进行体外扩增.在体外扩增的0、5、10、15 d,采用流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群(尤其是NK细胞)的比例；比较各方案体外扩增15 d后的NK细胞的扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化,并采用LDH法检测各方案扩增产物对人白血病K562细胞的杀伤活性.结果:上述4种NK细胞培养方案体外扩增15 d后,细胞总数分别扩增(40.1 ±20.00)、(44.08±22.09,)、(44.82±23.67)、(46.82±25.02)倍,其中NK细胞的扩增倍数分别为(75.86±28.57)、(93.32±32.16)、(88.66±24.94),(58.88±41.53)倍.NK细胞比例由0d的(20.44±2.23)％分别扩增至15 d的(48.30±13.90)％、(54.72±12.25)％、(55.94±12.70)％和(54.5±14.93)％；各培养方案组在总细胞扩增倍数、NK细胞扩增倍数上的差异均无统计学意义(P＞0.05).前3种培养方案体外扩增产物的杀伤活性明显高于方案4[(63.40±5.00)％、(77.30±9.40)％、(62.17±5.60)％ vs (37.39±10.42)％,均P＜0.05],而方案1、2、3之间体外扩增产物杀伤活性的差异则无统计学意义(P＞0.05).结论:细胞因子组合对于体外大规模培养NK细胞有着一定的优势,但不同的细胞因子组合(方案1中是否加入IL-18或IL-7)对NK细胞体外大规模扩增的影响差异并不显著；但前3个方案扩增产物对K562细胞的杀伤活性明显强于方案4.
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小鼠白细胞介素-15与其受体α亚单位协同作用的初步研究
目的 原核表达小鼠白细胞介素-15(mouse interleukin 15,mIL-15),并初步研究其与受体α亚单位(mIL-15Rα)的协同效应.方法 从小鼠肾脏组织克隆mIL-15成熟肽部分的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pQE-30,所得重组表达质粒pQE-30/mIL-15转化E.coli M15.得到的转化子经IPTG诱导后获得重组表达产物,并进行SDS-PAGE和Western Blot检测.Ni-NTA亲和层析柱上纯化、复性重组蛋白,以获得成熟的mIL-15.采用MTT法检测重组mIL-15促CTLL-2细胞增殖的生物学活性,并进一步研究mIL-15与mIL-15Rα结合后协同促进靶细胞增殖的功能.结果 重组mIL-15主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约为14ku,并能为抗His和抗mIL-15抗体所特异性识别.经Ni-NTA柱上蛋白纯化、包涵体复性后,可得到纯度约为95%的成熟蛋白.成熟mIL-15能够促进CTLL-2细胞增殖,并具有明显的量效关系;并且,在mIL-15Rα的配合下,mIL-15的促CTLL-2细胞增殖的活性显著增强,尤其是在低mIL-15浓度条件下该协同作用表现得愈发明显.结论 获得了具有生物活性重组mIL-15,并初步研究了其与mIL-15Rα组成复合物的体外协同效应.该研究成果为进一步研究IL-15 及IL-15Rα协同性的作用机理和开展小鼠成体免疫治疗研究奠定了基础.
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IL-15Rα生物协同作用的体外细胞学评价
目的 在细胞水平对IL-15R α的生物协同效应进行观察和评价.方法 以IL-15敏感细胞株CTLL-2为靶细胞,采用MTT法检测细胞的活性及增殖情况,在摸清CTLL-2细胞增殖同IL-15之间的剂量依赖关系的基础上,分别在中、低剂量上观察经倍比稀释后的IL-15R α对IL-15体外细胞学活性的影响,其间还分别观察了IL-15R α单独作用以及IL-15R α和IL-15特异性抗体介入对CTLL-2细胞增殖的影响.结果 CTLL-2细胞增殖同IL-15之间有着显著的剂量依赖关系;在50ng/mL的IL-15适中浓度下,1ng/mL的IL-15R α可以显著促进靶细胞的增殖(0.270±0.008vs.0.593±0.026,P＜0.05)10ng/mL的IL-15临界浓度下,同样浓度的IL-15R α可使靶细胞产生近100倍的增殖(0.005±0.017 VS.0.498±0.060,P＜0.05)10ng/mL和50ng/mL的IL-15浓度下,IL-15R d发挥大牛物协同效应的浓度分别为7.81ng/mL和15.63ng/mL;单独IL-15Rα没有促靶细胞的增殖效应,抗IL-15和IL-15R α的特异性抗体可有效阻断IL-15/IL-15R α之间的协同作用.结论 IL-15R α能够特异地通过IL-15发挥生物协同效应,该效应在低IL-15浓度下表现得尤为明显,IL-15/IL-15R α间适宜的配伍比例是确保该协同效应大程度发挥的关键.
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类风湿关节炎的药物研究新进展
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种常见的慢性致残性炎性自身免疫疾病.RA的患者约占全球总人口的0.5%～1%;我国的患病率在0.32～0.36%.发病高峰年龄在25～55岁,女性的发病几率约是男性的3倍 [1] .
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人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建
目的 克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体.方法 通过PCR方法 从HaCaT细胞基因组DNA中获得IL-15基因编码序列5'上游七段逐步缺失的IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因pGL3-Basic载体上,构建IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含长启动子序列的报告基因载体转染至HaCaT细胞,并设置空白对照组和LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性.结果 经PCR方法 扩增出七段逐步缺失的IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆长序列具有启动子活性.结论 成功构建了IL-15系列启动子报告基因载体,并在HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆 IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究IL-15表达调控机制奠定了实验基础.
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IL-10抑制脂多糖诱导的Hela细胞IL-15和IL-6转录
目的 研究IL-10对脂多糖(LPS)诱导的Hela细胞IL-15mRNA和IL-6mRNA表达的影响,分析其激活的信号转导通路.方法 培养的Hela细胞,经不同浓度的LPS及IL-10单独或联合处理后,提取细胞总RNA和总蛋白,RT-PCR分析IL-15和IL-6转录水平的变化,Western blot分析信号转导通路蛋白变化.结果 RT-PCR分析得知①1 ng～10 μg LPS刺激Hela细胞12 h后,IL-15mRNA和IL-6mRNA水平均明显上调(与对照组比较:P＜0.01),且存在剂量依赖关系,100 ng/mL时达峰值;100 ng/mL LPS刺激Hela细胞0～24 h,IL-15mRNA和IL-6mRNA水平亦明显上调(与对照组比较:P＜0.01),24 h内存在时间依赖关系,12 h时达峰值.②单独IL-10(10 ng/mL)作用于Heh细胞12 h后,IL-15mRNA和IL-6mRNA没有明显变化(与对照组比较:P＞0.05).不同浓度的IL-10(1,10,100 ng/mL)均下调100 ng/mL LPS诱导的Hela细胞IL-15mRNA和IL-6mRNA的表达,且浓度越高IL-10抑制作用越明显.Western blot 分析显示LPS主要通过磷酸化信号蛋白PI3K/AKT和ERK1/2上调IL-15和IL-6转录,IL-10能阻断AKT的磷酸化而对ERK1/2的磷酸化没有影响.结论 IL-10可抑制LPS诱导的炎症细胞因子IL-15和IL-6的转录,这可能与其阻断AKT的磷酸化有关,因而,IL-10可能应用于某些临床感染性疾病的预防和治疗.
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HIV感染者血清IL-1α、IL-7、IL-12和IL-15水平的变化及意义
目的:观察HIV感染者血清IL-1α、IL-7、IL-12和IL-15水平的变化.方法:采用ELISA法检测20例HIV感染者及20例健康体检者血清IL-1α、IL-7、IL-12和IL-15水平.结果:HIV感染者血清IL-1α、IL-7、IL-15水平显著高于正常对照组(P均＜0.01),IL-12水平显著低于正常对照组(P＜0.01).结论:HIV感染者血清IL-1α、IL-7、IL-12和IL-15水平发生明显变化,可用于HIV感染者病情的评估和预后判断.
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应用CRISPR/Cas9技术构建IL-15敲除的MGC-803胃癌细胞株
目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立IL-15基因敲除的MGC-803胃癌细胞株.方法:针对IL-15基因作用的功能域,设计了靶向IL-15基因Exon2的gRNA.构建PX458-gRNA重组质粒并转化感受态细胞Stbl3,筛选出重组子后进行测序,通过测序确认了所设计的gRNA的有效性.并进一步通过流式细胞分选以及ELISA法检测筛选出的MGC-803胃癌细胞株IL-15基因的表达水平.结果:测序结果显示敲除质粒构建成功,与阴性对照组相比,转染PX458-IL-15-gRNA质粒组IL-15的表达水平明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P＜ 0.001).结论:利用CRISPR-Cas9系统成功构建了IL-15基因敲除的MGC-803细胞,为后续研究IL-15在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础.
关键词： IL-15 CRISPR/Cas9系统 基因敲除
