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用聚合酶链反应加反相杂交扩增细菌16SrRNA基因快速诊断新生儿败血症
探讨新生儿败血症的快速诊断方法.方法 采用聚合酶链反应(PCR)加反相杂交技术对131例拟诊败血症的新生儿血清中16 SrRNA基因进行检测,同时以血细菌培养及5项非特异性指标(包括C反应蛋白、微量血沉、外周血白细胞计数、血小板计数和未成熟粒细胞与中性粒细胞总数之比值)作为对比.结果 PCR检测阳性率为41.9%,显著高于血培养阳性率(17.6%)和非特异性指标的阳性率(P＜0.05).对55份PCR阳性标本进一步进行反相杂交,显示G+菌27份,G-菌28份,其结果与血培养结果相符.若以血培养加非特异性指标为诊断标准,PCR法的灵敏度为88.9%,特异性为90.9%,正确诊断指数达到0.798.结论 PCR加反相杂交技术检测血清中细菌16 SrRNA基因能快速诊断新生儿败血症并鉴别细菌属G+抑或G-菌,较血培养和非特异性指标等方法具有更好的敏感性与特异性,有较大的推广及应用价值.
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细菌16S rRNA基因检测在新生儿败血症早期诊断中的临床意义
目的 分析16S rRNA基因检测在早期诊断新生儿败血症中的临床意义.方法 收集临床常见的致病菌菌株37株并提取DNA,对106例临床拟诊为败血症的患儿于入院后24 h内采集血标本,提取DNA,在16S rRNA基因的保守区选择一对通用引物进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),并检验实验方法的灵敏性和特异性;106例临床拟诊为败血症的患儿同时查血培养、非特异性炎症指标及降钙素原(procalcitonin,PCT),并采用x2检验与同期住院的20例非败血症患儿进行比较.结果 所有细菌PCR均得到预期的约371 bp大小的扩增产物,与病毒及人基因组DNA无交叉反应,其扩增下限为10 CFU/ml的大肠埃希菌.106例拟诊败血症患儿血培养阳性15例,PCR阳性36例.PCR的敏感性、特异性及诊断指数分别为82.9%、96.9%和179.85,优于血培养及5项非特异指标至少2项异常的实验诊断方法;在围产儿中,PCR的特异性高于PCT.结论 PCR方法检测细菌16S rRNA基因能迅速判断临床标本中是否存在细菌,对于早期诊断新生儿败血症具有较高的敏感性及特异性,对于区分败血症与局部感染和非细菌性感染具有重要意义.
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极低出生体重儿生后6个月内肠道菌群构成的动态变化
目的 探讨极低出生体重儿生后6个月内肠道菌群定植特征及动态变化特点.方法 选择2015年1月至12月收入新生儿重症监护病房的53例极低出生体重儿为研究对象,收集生后第1、7、14、28和1 80天(出院后)的粪便.采用Illumina MiSeq高通量测序技术对粪便样本DNA进行16S rRNA基因高通量测序及生物信息学分析,比较不同时间点肠道菌群相对丰度及多样性变化.采用Kruskal-Wallis秩和检验或Mann-Whitney U检验进行统计学分析. 结果 (1)门水平:5个时间点优势菌门均为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门,其中变形菌门中位相对丰度第1天为0.598 5(0.122 3～0.942 6),1周后上升至0.893 2(0.478 1～0.987 0),14和28 d内维持在0.943 2～0.966 0,生后第180天回落至出生水平(P值均＜0.05).放线菌门则出现相反的趋势,生后第1 80天相对丰度显著高于第1、7、14和28天(P值均＜ 0.05).(2)属水平:克雷伯菌属出生第1天相对丰度较低为0.003 1(0.000 8～0.026 0),7～28 d间(0.326 5～0.368 2)显著高于出生时水平(P值均＜ 0.05),第1 80天回落至较低水平[0.008 1(0.000 5～0.067 1)];埃希菌属丰度在生后1～14 d之间无显著差异,自28 d开始较前有显著上升(P值均＜0.05),180d时显著高于住院期间其他各时间点(P值均＜ 0.05).双歧杆菌出生时有一定丰度[0.000 5 (0.000 1～0.004 2)],但1～28 d一直维持在极低水平,至180 d达0.045 1(0.010 2～0.124 8),较前均有显著上升(P值均＜ 0.05).(3)生后第14、28 d的Shannon指数显著低于生后第1天和第180天(1.81±0.71和1.89±0.56与2.33±1.29和2.26±0.55,P值均＜0.05). 结论 与出生时相比,极低出生体重儿住院期间菌群多样性下降,变形菌门、克雷伯菌属成为优势菌;出院后菌群多样性恢复,双歧杆菌属、埃希菌属等常驻菌增加.NICU住院是极低出生体重儿肠道菌群多样性下降、微生态失衡的危险因素.
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细菌16S-23S rRNA 基因特异DNA图谱的分子诊断
目的应用聚合酶链反应(PCR)、限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)及测序技术,建立检测不同属种细菌的 16S-23SrRNA基因区间的特异图谱.方法对临床上常见的细菌进行PCR扩增、RFLP、分子克隆及序列分析,同时对临床标本进行培养与PCR-RFLP比较.结果 27株不同细菌行PCR扩增后,得到不同DNA 图谱.其中15种细菌经PCR扩增即可区分,另10种经Hinf I或Alu I 酶切后才能区分.肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌的差异只在第779位碱基上不同,Xma III酶能区别.42例临床诊断为新生儿败血症者,15例培养阳性,阳性率35.7%;而PCR阳性者则为27例,阳性率为64.29%,明显高于血培养(P<0.01).6例脑脊液标本中,1例PCR及培养均阳性(表皮葡萄球菌);2例培养阴性标本,其PCR也阳性;经图谱分析为葡萄球菌,1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性.另2例PCR及培养均阴性.结论建立了PCR-RFLP技术快速检测细菌16S-23S rRNA基因区间的方法,具有特异、敏感、快速、准确的特点,为临床细菌感染的病原诊断提供新的科学依据.
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细菌16S rRNA基因荧光定量PCR诊断新生儿败血症
目的 探讨新生儿败血症的快速可靠诊断方法,以提高临床检测细菌的速度及准确性.方法 以细菌16S rRNA基因为靶序列,设计通用引物及TaqMan探针,建立细菌16S rRNA基因实时荧光定量PCR反应体系;选择临床引起新生儿败血症的常见菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠埃希菌等进行浓度梯度实验;对临床疑为新生儿败血症的830例感染性疾病的新生儿抽取静脉血分别做细菌16S rRNA基因荧光定量PCR和血培养检测.结果 临床常见分离株金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌荧光定量PCR检测结果均为阳性;巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒,新型隐球菌及白色念珠菌,人基因组DNA及空白对照均为阴性.细菌荧光定量PCR低能检测到3个细菌,其荧光定量CT值为37.90;对临床疑为感染性疾病的830例患儿标本中,荧光定量PCR检测血标本阳性率5.18%(43/830),血培养阳性率2.41%(20/830),前者明显高于后者,差异具有统计学意义,P＜0.01,30例非感染性疾病患儿血标本荧光定量PCR检测及细菌培养均为阴性.若以血培养作为对照,荧光定量PCR方法的诊断敏感性为100%,特异性为97.16%,正确诊断指数为0.972.结论 建立了细菌165 rRNA基因荧光定量PCR诊断新生儿败血症方法.其检测快速、简便,为新生儿败血症提供早期、敏感的病原学诊断依据.
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16SrRNA基因PCR加基因芯片杂交快速诊断新生儿败血症
目的探讨新生儿败血症的快速诊断方法.方法 (1)以16SrRNA基因为靶序列,设计引物及寡核苷酸探针;将探针固定在特制的玻片上制作成基因芯片;(2)对临床疑为细菌感染的285例新生儿抽取静脉血分别做血培养和细菌16SrRNA基因检测:于血标本及脑脊液中抽提DNA后采用聚合酶链反应(PCR)扩增,将扩增产物加样在基因芯片上杂交后进行激光扫描及读片.结果 (1) PCR检测阳性率 5.96%(17/285)明显高于血培养的2.81%(8/285),差异有显著意义(P<0.01).若以确诊败血症作为对照,PCR 的诊断敏感性为100%,特异性为96.75%,正确诊断指数为0.968.(2) 对17份PCR阳性标本进一步做基因芯片杂交,结果通用探针均阳性, 其中G+探针阳性12份、G-探针阳性5 份;8份PCR和血培养均阳性的标本,基因芯片杂交探针阳性菌株与血培养细菌阳性结果完全一致.结论基因芯片杂交技术检测临床标本中16SrRNA基因能快速诊断新生儿败血症,除较血培养等方法有更好的敏感性和特异性外,还能快速明确系何种病原菌感染,因此有较大的推广及应用价值.
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慢性根尖周炎感染根管中微小小单胞菌与牙髓优势致病菌的相关性研究
目的 研究慢性根尖周炎感染根管中微小小单胞菌的检出率及其与牙髓优势致病菌检出之间的相关性,探讨该菌在慢性根尖周炎感染根管中的定植情况.方法 采集104例慢性根尖周炎患者的120颗患牙根管内标本,其中包括慢性根尖周炎初次治疗组和再次治疗组(患牙需经根管治疗2年以上,X线片表现为患牙根管充填不完善,根尖周病变不愈合或出现新的根尖周病变),两组各60颗患牙(初次治疗组47例,再次治疗组57例).利用菌种特异性引物16S rDNA PCR法检测标本中的微小小单胞菌DNA,并计算其检出率.利用Logistic回归分析(OR直)方法分析该菌与粪肠球菌、牙髓卟啉单胞菌和牙龈卟啉单胞菌之间的相关性.结果 在慢性根尖周炎初次治疗组中微小小单胞菌的检出率为40％(24/60),再次治疗组中微小小单胞菌的检出率为5％(3/60).两组间差异有统计学意义(x2=21.06,P＜0.05).Logistic回归分析结果显示,在慢性根尖周炎初次治疗组(OR=5.98)和再次治疗组(OR=33.50)中微小小单胞菌与牙髓卟啉单胞菌之间均具有相关性,与粪肠球菌和牙龈卟啉单胞菌之间无相关性.结论 微小小单胞菌为慢性根尖周炎感染根管微生态环境中的组成菌之一,与牙髓卟啉单胞菌的定植之间可能存在共生关系.
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PCR-RFLP技术在布氏菌鉴定与分型中的应用
目的 利用PCR-RFLP技术扩增7株布氏菌临床分离株16S RNA基因片段,为该菌的分子诊断学、遗传学和流行病学研究提供实验依据.方法 参考GenBank公布的布氏菌ATCC 25840标准株序列,设计针对该菌16S RNA保守区的特异性引物,从临床分离培养7株布氏菌,提取DNA并行16S RNA片段的PCR扩增.将PCR产物克隆至PGEM-T载体进行测序并选用合适的限制性内切酶进行RFLP分析,将分析结果用于临床株的同源性及变异位点的研究,并对感染患者的临床资料进行回顾性分析,研究不同布氏菌基因型与感染患者临床特征的相关性.结果 利用PCR扩增出的目的片段与预期一致,大小约为1500bp.测序及同源性分析表明,7株临床分离株之间存在98.88%的同源性和11个变异位点.RFLP结果将7株菌分为4个基因型,临床资料回顾性分析患者不同基因型与临床表现之间无明显联系.结论 利用PCR技术扩增布氏菌16S RNA基因片段可以实现对该菌的早期诊断,为布氏菌的分子遗传学和流行病学提供依据.
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新型MGB探针特异性检测变形链球菌
目的:设计一种新型TaqMan(R) MGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性.方法:提取 6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqMan(R) MGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性.巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物.TaqMan(R) MGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配.将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16 μg/L 按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线.结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果.TaqMan(R) MGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好.TaqMan(R) MGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的低检出浓度为20 μg/L.结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqMan(R) MGB探针,建立利用TaqMan(R) MGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法.
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天津地区鲍曼不动杆菌16SrRNA甲基化酶基因的检测与耐药性分析
目的:了解天津地区鲍曼不动杆菌16SrRNA甲基化酶基因的携带情况,并进行耐药分析.方法:收集天津地区2所医院2010年8月-12月临床分离的152株鲍曼不动杆菌,采用琼脂稀释法或纸片扩散法测定菌株药敏情况；聚合酶链反应(PCR)对鲍曼不动杆菌扩增7种16SrRNA甲基化酶基因(armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA)并测序.结果:152株鲍曼不动杆菌对多黏菌素B的耐药率低(0),其次是头孢哌酮/舒巴坦(15.79％)和左氧氟沙星(36.84％),对其他11种抗菌药物耐药率均在45％以上.83株耐氨基糖苷类菌株中armA阳性率为87.95％ (73/83),占实验菌株的48.03％(73/152),未检出其他6种16SrRNA甲基化酶基因.armA阳性菌株耐药严重,除多黏菌素B外,armA阳性菌株对其余13种抗菌药物的耐药率明显高于armA阴性菌株(均p＜0.01).多重耐药和泛耐药占的比例在armA阳性株中(100％和69.86％)也明显高于阴性株(21.52％和11.39％).结论:armA广泛存在于鲍曼不动杆菌中,未检出其他6种基因.
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16S rRNA基因在临床上的应用进展
传统的细菌检测主要依靠血清学、生物化学、细菌形态学及细菌培养等方法进行分类鉴定,但前三者敏感性和特异性不高,后者费时且阳性率低.近10余年来分子生物学技术发展迅速,各种基因方法如DNA杂交、质粒图谱和16S rRNA序列分析等在临床上得到广泛应用.该文就近年来国外16S rRNA在细菌学研究及其应用的一些新进展作一综述.
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放线菌P-127菌株抗菌活性物质的初步考察
目的 初步确定放线菌P-127菌株的类别及其抗菌活性物质的结构.方法 采用琼脂扩散法研究放线菌P-127菌株代谢产物的抑菌活性,采用16S rDNA序列分析法初步对菌株进行分类,采用大孔树脂柱色谱和制备型高效液相色谱对活性成分进行分离纯化,通过紫外、红外、质谱初步确定活性物质的结构.结果 放线菌P-127菌株产生的活性物质对啤酒酵母菌、白色念珠菌以及小麦赤霉病菌等6种真菌具有显著的抑菌活性,16s rDNA序列分析表明菌株的序列与Streptomycespaddnus的序列完全相同(相似性100%),质谱显示活性物质的相对分子质量为670,紫外吸收波谱显示活性物质具有多烯大环内酯类抗生素的特征吸收峰.结论 经16S rDNA序列比对分析,初步确定放线菌P-127菌株为Streptomyces padanus,其产生的抗真菌活性谢物质为fungichromin.
关键词： 放线菌 16S rDNA序列 抗真菌抗生素 fungichromin -
16S rDNA扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用
16S rDNA扩增及测序技术在细菌的鉴定与分类研究中发挥着越来越重要的作用.本文就16S rDNA结构、可变区和保守区部分序列或全序列在临床上细菌鉴定和新细菌识别等方面的研究进展进行综述,并对其在临床实验室中的应用进行展望.
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一种新的氨基糖苷类耐药决定因子:质粒介导的16S rRNA甲基化酶
氨基糖苷类抗生素在治疗革兰阳性和阴性细菌引起的危重感染中起着重要的作用.该抗生素通过与细菌30S核糖体亚基的16S rRNA的A位点结合而阻碍蛋白质的合成.耐该类抗生素的机制主要包括产氨基糖苷修饰酶、作用靶位改变、膜通透性降低和外排系统导致的细胞内药物浓度降低.质粒介导的16S rRNA甲基化酶是近年来新发现的一种耐药决定因子,可导致4,6-二取代基-脱氧链霉胺类氨基糖苷类高水平耐药.该类甲基化酶编码基因常位于细菌特异性重组系统中(如转座子),使得其可在细菌不同种属间广泛传播.在致病性革兰阴性菌中发现的甲基化酶基因的G+C含量与其推测的起源菌--放线菌中的G+C含量存在较大差异,因此其真正的起源有待进一步研究.由于16S rRNA甲基化酶在临床上的重要性,为引起医务人员的重视,本文就其耐药机制、分类、基因背景以及流行病学特征等方面的研究进展作一综述.
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山东省首例实验室诊断人单核细胞埃立克体病调查
目的 报告山东省首例人单核细胞埃立克体病的发现、诊治经过及其实验室检测.方法 对该疑似病例开展流行病学调查并填写个案调查表,采集其血标本,套式-PCR技术检测血液中嗜吞噬细胞无形体和查菲埃立克体特异性16S rRNA基因.结果 患者为不明原因发热,伴WBC和PLT减少.嗜吞噬细胞无形体特异性核酸检测阴性,查菲埃立克体特异性核酸检测阳性.PCR扩增阳性产物进行测序并与GenBank中注册的已知序列进行比较分析,显示与查菲埃立克体的同源性＞99％.结论 山东省存在查菲埃立克体感染病例,进一步开展自然疫源地调查十分必要.
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肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及临床意义
目的 利用PCR测序方法检测肝硬化患者腹水中的细菌DNA,探讨肝硬化患者发生细菌移位的高危因素及其后果.方法 在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对37份肝硬化患者腹水标本进行扩增,腹水中细菌DNA阳性者纯化后经核苷酸测序鉴别细菌种类;同时对患者的临床症状及实验室检查结果进行统计分析.结果 37份腹水标本中有9份获得530 bp细菌DNA片段,占24.3%.测序共检测出4种细菌,其中大肠埃希菌6例,表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、阴沟肠杆菌各1例;统计分析表明,腹水中细菌DNA阳性和阴性两组肝硬化患者在Child-Pugh积分(12.3±0.8,10.9±1.2)、上消化道出血的发生率(3例,1例)、血清Tbil水平[(395.5±216.6)μmol/L,(192.7±206.3)μmol/L]、凝血酶原活动度[(31.3±9.7)%,(50.4±15.1)%]、腹水总蛋白浓度[(4.1±2.8)g/L,(7.9±5.2)g/L]、外周血WBC总数[(12.3±7.5)×109/L,(5.3±4.1)×109/L]等方面比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PCR测序方法可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究;肝功能损害、腹水调理活性低下和上消化道出血是肝硬化患者发生细菌移位的高危因素和后果.
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16S rRNA基因芯片诊断新生儿败血症
目的建立16S rRNA基因加基因芯片检测新生儿败血症的诊断技术,以提高临床检测细菌的速度及准确性.方法对125例拟诊为败血症的新生儿血标本及部分脑脊液标本进行细菌16S rRNA基因及基因芯片检测,包括DNA提取、设计引物和探针、聚合酶链反应(PCR)扩增、基因芯片的制备、杂交、激光扫描与读片.结果 125例中PCR检测血标本阳性64例,占51.2%;血培养阳性32例,占25.6%;非特异性指标41例,占32.8%,差异有统计学意义(P<0.01).若以血培养阳性和/或非特异指标至少两项阳性为诊断标准,PCR灵敏度为90.3%(56/62),特异度为87.3%(55/63),正确诊断指数为0.776.3例脑脊液标本中PCR阳性2例,培养阳性仅1例.对64例PCR阳性血标本进一步作基因芯片检测,结果通用探针均阳性.其中G+探针阳性60份,G-探针阳性4份.30份PCR和血培养均阳性的标本中其探针菌株与血培养细菌阳性结果相符.2例脑脊液标本PCR阳性,基因芯片检测结果与培养结果相符.结论 16S rRNA基因PCR加基因芯片杂交可为新生儿败血症提供早期、敏感的病原学诊断依据.
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16S rRNA甲基化酶基因在鲍曼不动杆菌中的分布
目的 调查国内6个省市25家医院临床分离鲍曼不动杆菌中介导高水平氨基糖苷类抗生素耐药的16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB的分布情况.方法 收集2004年12月一2005年12月国内6省市8家省级医院、浙江省11个地区17家市级医院临床分离的700株鲍曼不动杆菌.琼脂稀释法测定其对妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、异帕米星、奈替米星5种氨基糖苷类抗生素的低抑菌浓度(MIC)值;PCR筛选三种甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB,克隆测序明确基因型;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株的同源性;质粒抽提、接合试验及Southern杂交确定armA基因定位.结果 对妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、异帕米星、奈替米星的耐药率分别为67.7%、70.9%、75.7%、63.5%和71.5%.对5种氨基糖苷类抗生素全部耐药的菌株有377株,其中334株检出armA基因;未发现rmtA、rmtB阳性菌株.armA基因阳性菌株PFGE分型以A、B、C为主.碱裂解法反复抽提未得到质粒,多次接合试验未成功;Southern杂交显示,armA基因分别位于克隆A、B、C菌株染色体ApaⅠ酶切PFGE约220、300、220 kb大小的PFGE片段上.结论 16S rRNA甲基化酶基因armA在鲍曼不动杆菌中广泛存在,armA基因位于鲍曼不动杆菌的染色体上.
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细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用
目的:构建细菌16S rRNA基因芯片,并将其应用于细菌检测.方法:根据细菌16S rRNA基因保守区设计合成针对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌的通用探针,以及针对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的特异性探针,并构建基因芯片.利用所构建的芯片检测相应细菌,并观察其特异性及敏感性.结果:成功构建了相应的基因芯片;所构建的基因芯片能准确检出相应细菌,无交叉阳性现象,检测时间约需6 h;所构建的基因芯片能检测出DNA含量为15 fg的大肠埃希菌基因组DNA.结论:细菌16S rRNA基因芯片可用于细菌的检测,具有良好的特异性及敏感性,且耗时少.
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前列腺组织中细菌16S rRNA基因、IL-1β、TNF-α和NGF的表达
目的:探讨慢性前列腺炎(CP)的细菌学病因.方法:前列腺标本取自162例猝死于非前列腺疾病的器官捐献者,年龄20～38岁.取前列腺周围带组织,一式两份,一份做常规病理检查和白细胞介素-1β(IL1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、神经生长因子(NGF)的免疫组化分析,另一份用PCR方法检测细菌16S rRNA基因(16S rDNA). 结果:31.5%(51/162)的组织病理呈CP改变,其中轻度灶性间质炎44例,轻度灶性间质伴腺体周围炎5例,轻度灶性腺体周围炎2例.16S rDNA阳性率为19.1%(31/162),其中CP标本阳性率为51.0%(26/51),非CP标本阳性率为4.5%(5/111),CP标本阳性率高于非CP标本(χ~2=29.783,P＜0.01).在CP标本中,16S rDNA阳性组IL-1β、TNF-α和NGF表达高于16S rDNA阴性组(P＜0.01). 结论:细菌感染可能是引起CP的重要原因.
