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Ⅲ型前列腺炎相关微生物的再认识
Ⅲ型前列腺炎是一种严重影响男性健康的疾病,虽然有很高的发病率,但其病因却迄今未明.伴随着各种微生物检测和鉴定技术的改进,特别是16S rDNA基因鉴定技术在微牛物检测中的广泛应用,使得我们对于Ⅲ型前列腺炎相关微生物有了更加全面的认识.本综述就各种方法在检测Ⅲ型前列腺炎相关微生物中的应用进行介绍,以期能够对微生物在该疾病发生过程中所扮演的角色有更加深入的理解.
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淋球菌对大观霉素耐药基因的初步检测
目的 检测导致大观霉素耐药的淋球菌16S rRNA基因中的突变位点.方法 对6株大观霉素耐药淋球菌[小抑菌浓度(MIC)≥128 mg/L]、20株大观霉素敏感菌株(MIC 32 mg/L和16 mg/L各10株)的16S rRNA基因进行DNA扩增和序列测定,分析16S rRNA基因突变情况.结果 6株大观霉素耐药淋球菌的16S rRNA基因均发生了突变,其中2株(MIC＞256 mg/L)为C1192T突变,1株(MIC 256 mg/L)为C1344T和T1345A突变,1株(MIC 256 mg/L)为T990G和T991C突变,1株(MIC 128 mg/L)为T990G、G1343C和C1344T突变,1株(MIC 128 mg/L)为T991C突变.20株大观霉素敏感菌株均未发生突变.结论 淋球菌16S rRNA基因不同位点突变可能与大观霉素不同程度的耐药相关,C1192T突变可能导致高度耐药,其他单一位点或多位点突变与不同程度的耐药相关.
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脓肿分枝杆菌16S rRNA检测及生物学特性研究
目的 鉴定1株脓肿分枝杆菌临床分离株.方法 取2017年12月18日就诊于潍坊医学院附属医院的1例疑似非结核分枝杆菌感染患者的脓液标本行细菌培养、革兰染色和抗酸染色;药敏试验采用比例法.提取菌株基因组DNA,选用16S rRNA通用引物进行PCR扩增,回收、纯化产物后测序,与GenBank数据库中已知脓肿分枝杆菌序列比较同源性.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定分离株.结果 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与16S rRNA基因检测均鉴定该分离菌为脓肿分枝杆菌.药敏试验显示该菌对阿米卡星、莫西沙星、左氧氟沙星敏感,对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素、卷曲霉素、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺、利福布汀耐药.诊断为左膝关节皮下软组织感染.根据药敏试验结果,给予阿米卡星和左氧氟沙星治疗后,症状好转.结论 16S rRNA检测与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱可用于脓肿分枝杆菌鉴定.
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四重PCR检测致病性嗜水气单胞菌
目的 建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的四重PCR方法.方法 根据致病性嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶(ahpA)基因、气溶素(aerA)基因和溶血素(hlyA)基因的保守序列以及嗜水气单胞菌的16S rRNA基因种属特异性序列分别设计4对特异性引物,通过优化各引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,确定了四重PCR的佳反应条件;然后进行特异性和敏感性试验,并比较其与常规微生物学方法对不同菌株和临床样本的检出率.结果 该方法特异性好,能特异性检测并鉴别出嗜水气单胞菌致病性菌株;检测灵敏度高,低可检测到约100 fg的嗜水气单胞菌基因组DNA;对9株嗜水气单胞菌的检测结果与常规微生物学方法一致,对56份送检的水产动物样品的检出率为21.4%,高于常规微生物学方法的16.1%,两者检测结果符合率为94.6%.结论 成功建立了能同时检测嗜水气单胞菌16S rRNA、aerA、ahpA和hlyA基因的四重PCR方法,能快速、准确地对嗜水气单胞菌进行检测并区分致病性与非致病性菌株.
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贵州省2011年黑线姬鼠钩端螺旋体分离株16S rRNA基因序列分析及基因种鉴定
目的 了解贵州省钩端螺旋体病(简称钩体)病原学特征,分析2011年贵州省钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株16S RNA基因序列并对其进行基因种鉴定,为贵州省钩体病的有效预防和控制提供科学依据.方法 应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,从NCBI数据库下载钩体17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体16S rRNA基因序列,采用生物信息软件比较分离株和各基因种代表株间的核苷酸序列,分析其亲缘进化关系,确定分离株基因种.结果 通过PCR扩增和基因测序技术获得4株钩体分离株16S rRNA基因核苷酸序列(1492 bp),4株钩体分离株的核苷酸同源性为100%,与17个钩体基因种中的问号钩体(L.interrogans)基因种黄疸出血群代表菌株的同源性高(99.9%),系统进化树分析显示,钩体分离株与17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体形成致病性、非致病性、未知致病性和其它分支,贵州4株分离株分属于致病性基因种分支,其中与致病性钩体8个基因种中的问号钩体基因种亲缘关系近.结论 贵州省2011年钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株均属致病性钩体的L.interrogans 基因种,该基因种菌株可能为当地流行菌株,该结果 将为贵州省钩体病的预防和控制提供科学依据.
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郭霍原则与16S rRNA基因序列分析在确定病原微生物中的应用
19世纪郭霍提出了关于某种微生物是否是病原的理论,这一理论后来被称为郭霍原则.郭霍原则包括以下3点[1-2]:1.某种微生物在某种疾病的所有病人中存在,包括那些有疑问的以及发生病理改变的病人.
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宁波地区鲍曼不动杆菌16S rRNA甲基化酶基因研究
目的:调查宁波地区3家综合性医院临床分离鲍曼不动杆菌中介导高水平氨基糖苷类抗生素耐药的16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB的分布情况.方法:收集宁波市李惠利医院、宁波市第一人民医院、宁波市第二人民医院氨基糖苷类抗生素高水平耐药鲍曼不动杆菌20株.琼脂稀释法测定5种氨基糖苷类抗菌药物的MIC值;PCR检测ar-mA、rmtA、rmtB 3种16S rRNA甲基化酶基因,克隆测序明确基因型;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性.结果:对5种氨基糖苷类抗生素全部耐药的20株菌株中,17株检出armA基因;未发现rmtA、rmtB基因阳性菌株.armA基因阳性菌株PFGE分型以A型为主.结论:宁波地区鲍曼不动杆菌检测出16S rRNA甲基化酶基因armA,菌株以克隆播散形式流行.
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基因检测在新生儿脓毒症早期诊断中的价值
目的 分析16S rRNA基因检测在新生儿脓毒症早期诊断中的临床价值,探讨快速、可靠地诊断该症的试验方法.方法在16S rRNA基因保守区选择一对通用引物,收集临床常见的致病菌株37株,提取细菌DNA并进行PCR检测,采用琼脂糖凝胶电泳法观察扩增结果,同时对该引物的灵敏性及特异性进行检验.对106例临床疑诊为脓毒症的新生儿于入院24 h内,在严格无菌条件下采集血标本,提取DNA进行PCR扩增,同时行血培养、血常规检查及CRP及ESR水平检测,并与同期住院的20例非感染性疾病患儿进行比较.结果 PCR检测细菌DNA均得到预期的约371 bp大小的扩增产物,该引物仅扩增细菌DNA,与病毒及人基因组DNA无交叉反应,其扩增下限为104CFU·L-1的大肠埃希菌.106例疑诊为脓毒症的患儿,血培养阳性15例,PCR检测阳性36例,PCR的阳性检出率显著高于血培养(P<0.005),20例非感染组患儿PCR结果均为阴性.依据新生儿脓毒症诊断标准,PCR的敏感性、特异性及诊断指数分别为82.93%、96.92%和179.85,优于血培养及5项非特异指标至少2项异常的诊断方法.PCR方法6～8 h即能检测出结果,改良核酸提取技术可以将检测时间缩短至4～6 h.结论 PCR方法检测细菌16S rDNA能迅速判断临床标本中是否存在细菌,对于早期诊断新生儿脓毒症具有较高的敏感性及特异性.
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16S rDNA序列分析方法用于慢性前列腺炎患者前列腺液细菌鉴定
慢性前列腺炎病因较为复杂,病原微生物是为重要的病因之一[1].为了更多地了解前列腺内的菌群,我们采用16S rDNA序列分析方法观察慢性前列腺炎患者前列腺液的细菌.
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南疆维吾尔族儿童龋病及16S rRNA高通量测序菌斑微生物群落结构
目的:分析南疆维吾尔民族儿童患龋情况及微生物学角度研究龋病可能高发的原因.方法:通过分层整群抽样随机抽取南疆第三师51团5个连队幼儿园3～5岁维吾尔族儿童296名调查患龋情况及充填率,应用Illu-mina Miseq高通量测序技术分析高龋儿童、无龋儿童口腔微生物群落结构及多样性.结果:南疆第三师51团维吾尔族3～5岁儿童总患龋率83.4％ 、龋均(3.07±3.22)、龋补充填率2.07％.5岁组儿童患龋率、龋均明显高于3岁组,不同性别儿童患龋率和龋均之间差异均无统计学意义.无龋组与高龋组口腔菌斑呈微生物多样性,共98个outs,归属于12个门、18个纲、25个目、34个科、60个属.无龋组微生物多样性较高龋组丰富,Streptococcaceae,Porphyromonadaceae、Fusobacteria、Veillonellaceae、peptostreptococcaceae在两组所有样本中均存在,在高龋组中构成比高于无龋组.结论:南疆维吾尔族儿童患龋率明显高于国内平均水平,应加强对南疆地区群众的口腔资源投入,当地维吾尔族儿童中高龋和无龋人群口腔微生物群落结构存在一定的差异,高龋组中优势菌(Streptococcace-ae,Porphyromonadaceae、Fusobacteria、Veillonellaceae、peptostreptococcaceae)对龋病发生发展的作用还有待进一步的研究.
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聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因
根据细菌16S rRNA基因的高度保守性,设计合成所有细菌、革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌的共同引物,采用聚合酶链反应检测已知细菌13株,三对引物分别扩增的阳性率为100%,倍比稀释法能检出细菌的低浓度为4?!CFU·ml-1,同时检测临床样本40份,阳性率为67.5%(27/40),同期细菌培养阳性率为45%(18/40),二者比较差异有显著性(P<0.05).结果提示聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因具有高度的特异性和敏感性.
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脑梗死患者肠道菌群紊乱与恢复研究
目的 探索脑梗死患者肠道菌群的紊乱特征和恢复情况.方法 收集28例脑梗死患者和28例健康对照人群的粪便样本,提取粪便中细菌DNA并进行16S rRNA测序分析.结果 和对照组相比,脑梗死患者肠道菌群显著改变(P<0.001),肠道中机会致病菌肠杆菌科、韦荣球菌科和链球菌科等显著增加而常驻菌如普氏菌属和拟杆菌属等显著减少.4周后其肠道菌群结构开始趋向于对照组但伴随菌群多样性的显著下降(P<0.05).结论 本研究发现了脑梗死患者肠道菌群紊乱与恢复的特征,但其菌群变迁的意义需要进一步研究.
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微生物组学大数据分析方法、挑战与机遇
微生物组学是新兴学科，与肠道、代谢、生殖、神经等大量慢性疾病相关。通过测序分析微生物组，主要包括16S rRNA和宏基因组两大技术。16S rRNA数据分析主要包括序列处理、样品多样性分析及统计分析3个步骤。宏基因组数据分析主要包括序列处理、分类、注释及统计分析4个环节。随着测序技术的升级，测序成本将逐步降低，而大数据分析将成为核心内容。数据的标准化和可积累性、通过数据建模和预测疾病的发生发展是未来应用的基础，数据知识产权保护以及数据本身价值的开发与保护价值将日益显现，培养和基于培养的功能验证将是未来的重点之一。人体微生物组学将阐述并调整人与微生物组之间的关系，此领域相关研究有巨大的发展空间。
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人苍白杆菌深圳分离株16S rRNA基因部分核苷酸序列分析
目的 对深圳市布吉人民医院分离鉴定的1株人苍白杆菌进行16S rRNA基因的部分核苷酸序列分析,以探讨该菌株在分类学上的准确地位.方法 对该菌株进行PCR扩增及16SrRNA基因序列测定,并与人苍白杆菌标准株及羊种布氏杆菌比较.结果 3株细菌均可扩增到大小约900bp的16S rRNA基因片段,经核苷酸序列分析比较,发现人苍白杆菌深圳分离株与人苍白杆菌标准株和羊种布氏杆菌具有高度同源性,同源程度大于98%.结论 该院分离的人苍白杆菌不仅与购自美国的人苍白杆菌ATCC株有高度同源性,而且与北京保存的羊种布氏菌在遗传学上也具有非常密切的亲缘关系.
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16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因间区在微生物鉴定中的应用
目前临床上引起感染的病原菌种类繁多,抗菌药物的不正规使用导致细菌培养阳性率进一步降低[J].因此,传统分类方法的不足随着新型微生物菌株的分离的增多而越来越明显,亟需一种能快速准确鉴定出微生物种类的新技术以便及时指导抗菌药物的合理使用从而控制临床感染疾病的进展.文章综述了16S rRNA及16S～23S rRNA基因间区快速鉴定微生物的基本原理、方法、存在的问题及进一步解决方案等.原核生物的rRNA有3类:5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA,其编码基因(rDNA)长度依次为120、1 540及3 300个核苷酸.它们位于同一操纵子序列中,但被一些间隔区域所分开,从5’～3’端依次是:16S、间隔区、tRNA、间隔区、23S、间隔区和5SrRNA[2],一个操纵子进行转录后处理成为成熟的16S、23S和5S rRNA.rRNA结构既具保守性又具高变性,保守性反映生物物种的亲缘关系,高变性则揭示生物物种的特征核酸序列,是属种鉴定的分子基础[J].因此,可以利用保守区设计通用引物扩增细菌的相应靶序列,再利用可变区的差异鉴别菌种.其中以16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因间区在细菌鉴定中的应用为成熟及广泛.
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16S rRNA在医学微生物鉴定中的应用
随着分子生物学的快速发展以及该技术在医学微生物研究中的应用,16S rRNA作为微生物分类依据已得到广泛认同,本文就其基因特征、技术步骤、临床应用及注意事项的新进展作一简要综述.
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特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立和优化
目的 以16S rRNA编码序列为靶基因,建立特异引物PCR鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌方法 并优化.方法 以类鼻疽伯克霍尔德菌标准菌株K96243的16S rRNA编码序列为靶序列,通过Primer Premier 5软件搜索特异的引物,以该菌为模板,优化特异引物PCR的退火温度、退火时间和反应循环数等条件.得到优PCR反应条件后,将该方法 用于检测临床分离的类鼻疽伯克霍尔德菌菌株和常见细菌感染病原体(大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌和乙型链球菌),评价该方法 的有效性和特异性.结果 共设计3对引物,分别扩增16S rRNA编码序列283～672、760～1 061、771～1 193片段,优化后PCR反应条件为:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性40 s,54.5 ℃退火20 s,72 ℃延伸40 s,24个循环,后延伸1 min;特异性分析发现此方法 能将类鼻疽伯克霍尔德菌与其他常见感染病原菌进行有效地鉴别诊断.结论 成功建立并优化一种快速鉴定类鼻疽伯克霍尔德菌的方法,通过此方法 能有效的从单个菌落中和基因组水平鉴定临床分离的8株类鼻疽伯克霍尔德菌.
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前列腺结石患者结石中纳米细菌的分离和16S rRNA基因的鉴定
目的 检测纳米细菌在前列腺结石中的分布情况,探讨其在前列腺结石发病中的作用.方法 采集前列腺结石患者的前列腺结石标本,分离培养纳米细菌,采用PCR法对纳米细菌16S rRNA基因进行扩增,电泳分析结果并测序.结果 将PCR得到的特异性片段的测序结果与已知纳米细菌16S rRNA序列进行比较,相似度为98%:分值=2 480 bits(1290),期望值=0.0;相似度=1387/1409(98%),缺失=4/1409(0%);链=正/正.结论 PCR法和测序可以作为纳米细菌16S rRNA基因的检测手段;前列腺结石患者的结石中存在着纳米细菌的感染.
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黄芩提取物逆转细菌耐药性及对16S rRNA甲基化酶基因表达影响的研究
目的 研究黄芩提取物对临床常见3种耐药菌的体外抑制效果及对16S rRNA甲基化酶基因表达的影响.方法 采用纸片扩散法分别测量环丙沙星、黄芩提取物、黄芩提取物+环丙沙星、万古霉素和氨曲南对耐药金黄色葡萄球菌、耐药铜绿假单胞菌和耐药肺炎克雷伯杆菌的抑菌圈大小,同时采用荧光定量聚合酶链反应方法及琼脂糖凝胶电泳法测定不同药物对细菌16S rRNA甲基化酶mRNA的转录水平.结果 黄芩提取物对耐药金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用;黄芩提取物+环丙沙星对耐药铜绿假单胞菌和耐药肺炎克雷伯菌的增殖具有良好抑制作用;黄芩提取物可以抑制耐药铜绿假单胞菌及耐药肺炎克雷伯菌16S rRNA甲基化酶基因的转录.结论 黄芩提取物可以降低16S rRNA甲基化酶mRNA转录,提高耐药菌对抗菌药物的敏感性.
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云贵地区淡水湖中类蛭弧菌多样性分析
目的:对贵州阿哈湖、百花湖及云南滇池不同深度湖水中分离的类蛭弧菌进行分类鉴定,了解云贵地区淡水中类蛭弧菌多样性.方法:培养云贵地区3个湖泊中分离的类蛭弧菌,进行16S rRNA基因测序分析,用MEGA 6.0软件以邻接法构建3个湖泊中类蛭弧菌16S rRNA序列的系统发育树,并以大似然法(PHYLIP3.1软件)加以验证.结果:从阿哈湖、百花湖及滇池不同深度湖水中分离的类蛭弧菌覆盖率C值为75％,根据类蛭弧菌16S rRNA构建发育树,本研究所得的类蛭弧菌分属3个簇群,γ-Proteobacteria (8.3％)、δ-Proteobacteria(50.0％)及Sphingobacteria(41.7％);在百花湖中分离得到1株路德维希肠杆菌,分离自贵州阿哈湖的6株菌株与噬菌弧菌属的Bacteriovorax sp.EPA同源性较高,分离于滇池的5株菌株的序列为不可培养细菌序列.结论:云贵地区阿哈湖、百花湖及滇池不同深度湖水中的类蛭弧菌具有较高多样性,推测在云南滇池区域存在着尚未开发的新型类蛭弧菌资源.
