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改良贴壁法结合内皮细胞培养基培养小鼠肺微血管内皮细胞
背景:肺微血管内皮细胞是研究微循环的重要内皮细胞模型之一,众多培养方法中单纯贴壁法操作相对简便,但耗时长,杂质细胞多,是批量培养细胞的大障碍.目的:建立优化的小鼠肺微血管内皮细胞体外培养方案,观察细胞生长状态并鉴定细胞性质.方法:无菌状态下快速剪碎5 日龄C57BL/6J 小鼠的肺叶外周组织,肺组织颗粒贴壁法获得肺微血管内皮细胞,并用内皮细胞培养基培养.倒置显微镜观察培养细胞生长和行为状态,Ⅷ因子相关抗原免疫组化和免疫荧光进行细胞鉴定.结果与结论:肺组织块培养24 h 内可见梭形细胞爬出,传代后细胞生长迅速,形态规则呈鹅卵石状,纯度高达98%以上,结合Ⅷ因子相关抗原检测证实其为内皮细胞.结果可见联合运用肺组织颗粒贴壁和内皮细胞培养基可高效获得原代小鼠肺微血管内皮细胞.
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金黄色葡萄球菌α毒素对肺水通道蛋白表达的影响
目的:观察金黄色葡萄球菌α毒素(α-toxin)对Balb/c小鼠肺微血管内皮细胞(LMEC)水通道蛋白1(AQP1)表达的影响.方法:将实验组小鼠15只腹腔注入α-toxin后根据6 h、10 h、24 h取材时间,随机将它们分为α-toxin 6 h组、α-toxin 10 h组和α-toxin 24 h组.取左肺行病理HE染色和免疫组化染色,检测肺组织病理变化情况和AQP1表达的变化.结果:α-toxin各组肺泡间隔增宽、水肿,炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,以α-toxin 10 h组为明显.免疫组化α-toxin各组AQP1表达下降(P＜0.05).其中以α-toxin 10 h组为明显.α-toxin 6 h组和α-toxin 10 h组及α-toxin 10h组和α-toxin 24 h组均有显著性差异(P＜0.05).结论:AQP1表达于LMEC.金葡菌α毒素可致小鼠肺LMEC的AQP1表达下降,随着炎症的减轻,AQP1也随之表达增加,进而恢复正常.
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复合培养对肺动脉平滑肌细胞周期的影响
目的探讨肺微血管内皮细胞(LMVEC)与肺动脉平滑肌细胞(PASMC)复合培养时LMVEC对PASMC周期的影响.方法 LMVEC滤膜培养后,与PASMC复合培养,采用流式细胞仪检测PASMC周期的变化.结果不同明胶浓度处理滤膜、不同种植密度相同、不同孵育时间处理滤膜对LMVEC生长数量有明显的影响,但不同孔径滤膜对LMVEC生长的影响无显著性差异.用1‰明胶处理滤膜, 105/cm2的种植密度及孵育2 d即可获得较好效果.复合培养后,PASMC的G1期细胞数减少,S+ G2/M期细胞数增多,即促进细胞生长;使LMVEC的G1期细胞数增多,S+G2/M期细胞数减少,即抑制细胞生长.结论复合培养后,促进PASMC细胞生长,抑制LMVEC细胞生长;但对两种细胞的凋亡影响不明显.
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血必净注射液对百草枯刺激的大鼠肺微血管内皮细胞损伤的保护作用
目的 探讨血必净注射液对百草枯(PQ)刺激的大鼠肺微血管内皮细胞(rPMVECs)损伤的保护作用及其可能的机制.方法 将rPMVECs原代培养后,分为空白对照组、PQ组(加入PQ溶液)和血必净组(加入PQ溶液30 min后再加入三种浓度的血必净,分别为10、20、50 mg/mL).用分光光度比色法测定细胞培养上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,ELISA法检测细胞培养上清液中血管假性血友病因子(vWF)和内皮素(ET)含量,观察各组不同时间点(3、12、24、48 h) SOD活性和MDA、vWF、ET含量.结果 PQ组四项检测指标在各时间点上与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).不同浓度的血必净在各时间点上均有不同程度减慢SOD活力下降和降低MDA、vWF、ET浓度的作用,并呈剂量依赖关系,以高剂量的血必净作用为明显;与PQ组比较,高剂量血必净组在各时间点上差异均有统计学意义(P＜0.01或0.05).同时,三种浓度血必净组的SOD活力和MDA、vWF、ET浓度随时间的延长而变化,与PQ组比较,其变化速度相对较慢.结论 血必净注射液通过提高SOD活力和降低MDA、vWF、ET含量而对PQ刺激rPMVECs的损伤起到保护作用.
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丙泊酚对脂多糖诱导的大鼠肺微血管内皮细胞AQP-1表达的影响
目的 观察丙泊酚对脂多糖(LPS)刺激的大鼠肺微血管内皮细胞水通道蛋白-1(AQP-1)表达的影响,阐明其减轻急性肺损伤的可能机制.方法 大鼠肺微血管内皮细胞体外培养后随机分为7组,每组5份:①C组(对照组);②LPS0.1组(脂多糖终浓度为0.1 μg/mL);③LPS1组(脂多糖终浓度为1μg/mL);④LPS10组(脂多糖终浓度为10μg/mL);⑤P4(丙泊酚终浓度为4μg/mL)+LPS10组;⑥P40(丙泊酚终浓度为40 μg/mL)+LPS10组;⑦I40(脂质溶剂的体积和浓度同P40)+LPS10组.按上述分组,在相应组中分别加入不同浓度丙泊酚、等量脂肪乳剂或培养液,于37℃5%CO2培养箱中孵育30 min,再在相应组中加入LPS,置于培养箱继续孵育6 h.收集细胞并测定下列指标:AQP-1(免疫细胞化学和Westem blotting)和蛋白质渗透压反射系数(σ).结果 LPS可浓度依赖性减少内皮细胞AQP-1的表达和(值P＜0.01).与LPS10组比较,P4+LPS10及P40+LPS10两组能显著增加内皮细胞AQP-1的表达和(值P＜0.01),而I40+LPS10组变化不明显(P＞0.05).结论 丙泊酚可通过调节AQP-1的表达和σ变化,从而减轻ALI/ARDS肺水肿的形成.
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脂多糖对大鼠肺微血管内皮细胞Gsα和Giα蛋白亚型的影响*
目的:观察脂多糖(LPS)对大鼠肺微血管内皮细胞(R PMVECs) G蛋白的影响及甲基强的松龙的干预作用.方法:用流式细胞技术(FCM)检测G蛋白亚型的变化.结果:①10 μg/ml LPS作用于 RPMVECs 30和90 min后,Gsα蛋白水平较对照组显著下降.甲基强的松龙干预30和90 min后 ,对LPS致RPMVECs膜Gsα蛋白水平的变化有显著抑制作用.②10 μg/ml LPS作用于RPMVECs 30和90 min后,Giα蛋白水平较对照组显著下降.甲基强的松龙干预30和90 min后,对LPS 致RPMVECs膜Giα蛋白水平的变化有显著抑制作用.结论:①LPS诱导RPMVECs Gsα和Giα蛋白水平的变化可能是LPS诱导RPMVECs单层通透性增加的机制之一. ②甲基强的松龙参与抑制LPS诱导RPMVECs单层通透性增加的作用.
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烧伤后CD11b/CD18介导的中性多形核白细胞粘附对肺微血管内皮细胞单层通透性的影响
目的:观察烧伤后中性多形核白细胞(PMN)对肺微血管内皮细胞单层通透性的影响,以及PMN粘附及其粘附分子CD11b/CD18在该影响中的介导作用.方法:用培养血管内皮细胞单层模型,建立培养肺微血管内皮细胞(PMEC)单层通透性测定的方法,根据处理内皮细胞单层的不同成分,将实验分为7组,用含荧光素异硫氰酸酯-清蛋白的灌流液灌流后,测定液体滤过系数(kf)和渗透压反射系数(δ).结果:烧伤后PMN能使反映小分子物质通透性的kf值明显增加,使δ值显著下降.用单抗封闭PMN膜上CD11b/CD18能使δ值的变化得到纠正;用孔径0.2 μm的滤膜阻断PMN与内皮细胞单层的粘附则使kf值和δ值均接近正常水平.结论:白细胞与内皮细胞的粘附是介质类物质发生作用的前提条件,这些物质主要影响肺血管对小分子物质的通透性.粘附分子CD11b/CD18本身可能具有生物学信号调控的作用,并介导着对肺血管内皮细胞大分子物质通透性的影响.
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烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及可能机制
目的 探讨烟曲霉对肺微血管内皮细胞通透性的影响及其机制.方法 利用激光共聚焦扫描显微镜检测人肺微血管内皮细胞肌动蛋白(F-actin)和细胞跨膜电阻仪测定细胞跨膜电位,以观察细胞通透性的改变,并利用p38 MAPK抑制剂、ROCK抑制剂和蛋白激酶C抑制剂探讨其机制.结果 烟曲霉处理后肺微血管内皮细胞F-actin染色的荧光强度显著下降(P＜0. 01),烟曲霉处理组也出现细胞跨膜电阻值的显著下降( P＜0. 01).与单独烟曲霉处理组比较,SB203580(20 μmol/L, p38 MAPK抑制剂)干预组、Y27632(20 μmol/L, ROCK抑制剂)干预组以及LY317615(10 μmol/L,蛋白激酶C抑制剂)干预组的跨膜电阻值均显著上升(P＜0. 05).结论 烟曲霉处理致肺微血管内皮细胞通透性增加,其机制可能涉及p38 MAPK、ROCK激酶以及蛋白激酶C通路.
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休克淋巴液对大鼠内皮细胞VEGF表达的影响
目的 观察休克淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)、肠系膜微淋巴管内皮细胞(MMLEC)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 无菌条件下复制大鼠重症失血性休克模型,引流休克时肠系膜淋巴液或收集门静脉血,同时收集正常淋巴液及门静脉血作为对照.以4%终浓度的处理因素与第3代PMVEC及MMLEC共同孵育6 h,RT-PCR测定VEGF Mrna表达.结果 不同处理因素与PMVEC及MMLEC孵育6 h后,休克淋巴液组两种内皮细胞的VEGF Mrna表达均显著低于休克血浆组、正常淋巴液组、正常血浆组、胎牛血清(FBS)组、DMEM组;休克血浆组显著低于正常淋巴液组、正常血浆组、FBS组和DMEM组;其它组间无统计学差异.结论 休克淋巴液可抑制内皮细胞的VEGF Mrna表达,且作用强于休克血浆.
关键词： 休克淋巴液 肺微血管内皮细胞 肠系膜微淋巴管内皮细胞 血管内皮生长因子 -
LPS的直接诱导对肺微血管内皮细胞ICAM-1的表达及对PMN黏附作用影响的研究
目的探讨内素毒(Endotoxin LPS)的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(PMVEC)ICAM-1表达的影响及诱导发生的PMVEC对多形核中性粒细胞(PMN)黏附作用的影响.方法100ng/ml LPS刺激PMVEC 0、2、4、6、8 h或10、50、100ng/ml LPS刺激6 h,同时检测PMVEC ICAM-1的表达(免疫细胞化学法)、PMVEC-PMN黏附率及抗ICAM-1抗体对黏附作用的影响,并进行PMVEC与PMN黏附作用的扫描电镜观察.结果LPS的直接刺激可诱导PMVEC ICAM-1的表达增加,且表现为随LPS刺激的时间、剂量增加而增加;同时LPS直接刺激也促进了PMVEC对PMN的黏附率增加,其变化在时间与方式上几乎与ICAM-1的表达增加同步.Anti-ICAM-1抗体可以显著地抑制LPS诱导的PMVEC-PMN黏附(P<0.01).扫描电镜可以直观地显示PMVEC-PMN黏附的超微结构表现,并且首次通过这种方式观察到了"间接系链"现象的存在.结论表明细菌致病因子LPS的直接诱导可以促进PMVEC表达ICAM-1,从而为PMVEC-PMN的黏附提供物质基础,而"间接系链"的发生更扩大和巩固了黏附效果.
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LPS的直接诱导对肺微血管内皮细胞IL-8的表达及对PMN趋化作用影响的研究
目的探讨 LPS的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞 (PMVEC)IL- 8表达的影响及诱导发生的 PMVEC对多形核中性粒细胞( PMN)趋化作用的影响.方法 100 ng/ml LPS刺激 PMVEC 0、 1、 2、 4、 6、 8 h或 1、 10、 100 ng/ml LPS刺激 6 h, ELISA和原位杂交试验分别检测培养液上清中分泌的 IL- 8及 PMVEC内 IL- 8 mRNA的表达,同时琼脂糖平板法检测对 PMN的趋化作用,并通过抗 IL- 8的抗体抑制试验观察对趋化作用的影响.结果 LPS能显著促进 PMVEC表达 IL- 8,包括促进 IL- 8 mRNA的表达及 IL- 8的分泌.在时间上 mRNA的表达先于 IL- 8分泌. LPS能促进 PMVEC对 PMN的趋化,随刺激作用的持续,诱导的 PMVEC对 PMN的趋化作用加强.抗 IL- 8抗体能显著抑制对 PMN的趋化作用 (P<0.01).结论表明细菌致病因子 LPS的直接诱导确能促进 PMVEC高效表达和分泌 IL- 8,从而为 PMN的迁移提供必需的物质条件 ,发挥对 PMN的趋化作用而参与导致肺损伤.
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LPS诱导肺微血管内皮细胞ICAM-1的表达及 NF-κ B作用的实验研究
目的研究 LPS诱导的肺微血管内皮细胞( PWVEC) ICAM- 1的表达及调控机制.方法 100ng/ml LPS刺激 PMVEC 0h、2h、4h、6h、8h或 10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml LPS刺激 6h,免疫细胞化学检测 PMVEC ICAM- 1的表达.凝胶电泳迁移率变化分析检测 NF- κ B的活化.并通过加入活化阻断剂 PDTC观察对 PMVEC ICAM- 1表达的影响.结果 PMVEC ICAM- 1的表达与 LPS的刺激呈时相 - 剂量依赖方式.LPS的刺激迅速活化 NF- κ B,60min达到高峰,后逐渐下降.PDTC能显著降低 ICAM- 1的表达( P<0. 01).结论 LPS刺激诱导 NF- κ B的活化,启动 ICAM- 1的合成表达.
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用流式细胞仪检测鲨鱼软骨粉提取物对大鼠微血管内皮细胞的作用
目的研究鲨鱼软骨粉提取物对大鼠肺微血管内皮细胞的影响.方法用流式细仪(PI染色)测定体外培养的肺微血管内皮细胞中细胞周期和细胞凋亡的变化.结果体外培养的微血管内皮细胞与鲨鱼软骨粉全成份(6mgml)、成份A(0.01mg/ml)、成份B(0.01mg/ml)一起培养24h后经流式细胞仪检测发现, 成份B使细胞周期中G2-M期细胞明显减少(P<0.05),成份A使凋亡细胞明显增加(P<0.01).结论成份B可能是鲨鱼软骨粉中的一种水溶性抑制成份,它对微血管内皮细胞的增殖起抑制作用,成份A对细胞凋亡的作用,还有待于进一步研究.
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肺缺血/再灌注损伤的体外研究模型应用进展
背景 肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells.AECs)或肺微血管内皮细胞(pulmonary microvaseular endothelial cells,PMECs)缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型是体外研究肺缺血/再灌注损伤(lung ischemia/reperfusion injury,LI/RI)机制及保护策略的模拟模型. 目的 探讨模型的建立方法和建模过程中的相关问题,为有效建立该模型提供参考.内容 从模型建立的一般程序、细胞种类的选择与培养、H/R的方法、损伤检测指标等方面,对近年来国内外肺细胞H/R损伤模型的研究与应用情况进行综述. 趋向 关于肺细胞H/R损伤模型的建立,目前尚无统一方法,需进一步研究.
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升降散对急性肺损伤大鼠肺微血管内皮细胞NF-kB表达的影响
目的 探讨升降散对急性肺损伤的治疗作用机理.方法 40只雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组、升降散大剂量组、中剂量组及小剂量组.给药6 d后,舌下静脉注射LPS复制急性肺损伤模型,取肺组织切片,免疫组化检测.采集图像.分析微血管内皮细胞核的平均灰度.结果 药物治疗组与模型组比较,能明显抑制微血管内皮细胞核中NF-kB的表达,有显著性差异.结论 升降散可通过抑制肺微血管内皮细胞NF-kB的表达,抑制炎症反应对肺组织造成的急性损伤,对急性肺损伤起到防治作用.
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肺微血管内皮细胞的信号通路在肝肺综合征发病机制中的研究进展
肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是慢性肝病的严重并发症,以肺微血管扩张(pulmonary vaso dilatation,PVD)引起的低氧血症为典型病理改变,主要发生于各型肝硬化及各种慢性肝病.由于肺微血管主要构成细胞为肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs),因此针对HPS发病机制的研究常以PMVECs的异常改变及其相关信号通路为切入点,文中就此方面近年的研究报道进行综述.
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依达拉奉对脂多糖内毒素诱导急性肺损伤中性粒细胞肺内扣押与氧自由基损伤的抑制作用
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的主要病理特征为全身过度激发失控的炎症反应在肺部的表现,即导致肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤,以严重的肺水肿、肺内分流增加及恶化的氧合为主要病理生理改变,临床表现为顽固性难以纠正的低氧血症,急性肺损伤的严重阶段即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS).
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脂氧素A4对TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应的影响
目的:探讨脂氧素A4(LXA4)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMECs)炎症相关因子的影响,并初步探讨其可能的机制.方法:实验分为对照组、TNF-α单独刺激组和不同浓度LXA4 (5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL)预处理组.实时荧光定量PCR检测HPMECs单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)、E-选择素(E-selectin)、白介素-6(IL-6)mRNA表达水平；细胞免疫化学方法定位检测核因子-κ B/p65(NF-κ B/p65)；蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测细胞核内和细胞总蛋白中NF-κB/p65的水平.结果:LXA4可以抑制TNF-α诱导的HPMECs MCP-1、E-selectin、IL-6 mRNA表达的上调；LXA4可以抑制TNF-α引起的HPMECs p65由细胞质向细胞核的转位.结论:LXA4可能通过抑制NF-κB细胞信号通路而抑制血管内皮细胞炎症相关因子的表达,发挥抗炎作用.
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免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞
目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠，随机分成3组，分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs，观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞，计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间，测定细胞纯度，MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞，血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组，差异有统计学意义（P＜0.01），从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组，差异有统计学意义（P＜0.05），细胞纯度显著高于酶消化法组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法，免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好，分离速度快，细胞纯度高及活性好的优点。
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血管紧张素转化酶与急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征关系的研究进展
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是急性肺损伤(ALI)严重阶段的表现.肺微血管内皮细胞(PMVEC)等肺内效应细胞以及炎性介质介导的肺微血管通透性增高、肺水肿是ALI/ARDS的主要病理基础.由于ALI发病机制复杂,迄今尚未完全解释清楚,其治疗与预后一直是临床危重急症中的难题之一.血管紧张素转化酶(ACE)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RASS)的成员之一,在机体血压调节和水盐平衡中发挥着重要的作用.
