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犬粪便中细粒棘球绦虫抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用
目的 建立简便、特异的检测犬粪便中细粒棘球绦虫抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用.方法 以细粒棘球绦虫EdiagA864蛋白为抗原,免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体;利用HRP标记兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体,通过溶解、超声方法处理犬粪便样品;以抗细粒棘球绦虫单克隆抗体2D12作为捕获抗体,HRP标记的兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体为检测抗体,通过棋盘法确定抗体佳包被浓度、佳封闭剂、待检粪样佳稀释比例及酶标抗体佳浓度.应用建立的双抗体夹心ELISA法对来自长春地区的64份犬粪便样品及来自新疆的8份犬粪便阳性样品进行检测.结果 兔抗EdiagA864多克隆抗体的效价为105.建立的双抗体夹心ELISA法的佳检测条件为:抗体包被浓度为1∶50,封闭剂为1％ BSA,粪液稀释度为1∶5,酶标二抗稀释度为1:800.建立的双抗体夹心ELISA法与犬贾第虫和犬蛔虫阳性样品均无交叉反应;检测不同稀释度的粪便液,当稀释至1∶20时,P/N仍大于2;检测6份阳性样品与4份阴性样品的批间和批内变异系数均小于8.用建立的方法检测8份阳性样品的结果均为阳性,64份待检样品的结果均为阴性.结论 建立的双抗夹心ELISA方法特异性较强,敏感性较高,重复性较好,为细粒棘球绦虫流行病学调查及诊断提供了一种更简便、快速、特异的免疫学检测方法.
关键词： 细粒棘球绦虫 双抗体夹心ELISA EdiagA864 多克隆抗体 -
犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条的制备
目的 制备犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条.方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用于标记抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体2D12制作金标垫,兔抗细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体标记检测线(T线),羊抗鼠Ig标记质控线(C线),制备胶体金试纸条,并进行特异性、敏感性、重复性及稳定性试验.用优化的胶体金检测试纸条对96份犬粪样品(36份参照阳性样,60份临床样品)进行检测.结果 制备的犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条与犬蛔虫阳性粪及犬贾第虫阳性粪样品均无交叉反应;粪便稀释度为1∶4时仍可检出正确结果;3次检测参照阳性样本均为阳性;于不同温度(室温、4及37℃)下保存不同时间(1、2、3、4个月)的试纸条均可检出正确结果.96份犬粪便样品中,36份参照阳性样品检出率为97.2％(35/36),60份临床样品均为阴性.结论 制备的试纸条具有良好的特异性及稳定性,可应用于临床样品检测及大规模流行病学调查.
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抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体,并进行鉴定.方法 以细粒棘球绦虫EdiagA864蛋白为抗原,经皮下多点免疫BALB/c小鼠,共免疫4次.末次免疫3d后制备小鼠脾细胞,在聚乙二醇(PEG)的作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株进行克隆,检测其染色体数及分泌的单克隆抗体亚型.采用体内培养法大量制备抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体,并经正辛酸-饱和硫酸铵法和HiTrap Protein G HP亲和层析结合法纯化.结果 经筛选克隆共获得4株可产生细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的杂交瘤细胞株:2D12、3H4、4A6和6E5,细胞染色体数分别为97、101、98和96,重链亚型均为IgG1,轻链亚型均为Kappa.2D12、3H4腹水效价为2×105,4A6和6E5腹水效价为1×105.纯化后的2D12抗体可见相对分子质量为46 000和26 000的重链和轻链条带.结论 本实验获得的2D12是一株稳定的杂交瘤细胞株,且可产生高效价细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体,为细粒棘球绦虫病的免疫诊断奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 EdiagA864蛋白 单克隆抗体 杂交瘤细胞 -
苦参碱联合阿苯达唑治疗小鼠继发性棘球蚴病效果观察
目的 评价中药苦参碱单独及联合阿苯达唑使用治疗小鼠继发性棘球蚴病的效果.方法 将感染棘球蚴的昆明小鼠分为4组:苦参碱组、阿苯达唑组、联合用药组、对照组,每组10只.在对小鼠进行药物治疗90 d后,检测各组小鼠棘球蚴湿重、抑囊率,并利用光镜、电镜对棘球蚴组织进行形态结构和超微结构观察.结果 苦参碱组、阿苯达唑组、联合用药组、对照组棘球蚴湿重分别为(0.32±0.12)、(0.31±0.10)、(0.05±0.03)、(1.16±0.43)g,苦参碱组及联合用药组对小鼠棘球蚴的抑囊率分别达到72.4%和95.7%,显示联合用药组明显优于苦参碱组(P<0.05).上述4组包囊组织Ⅲ级病理损伤率分别为40.9%(9/22)、43.5%(10/23)、91.3%(21/23)、9.5%(2/21).与对照组比较,其他3组包囊组织Ⅲ级病理损伤率明显增高(P均<0.01),且联合用药组为明显.结论 苦参碱对小鼠棘球蚴的增长有明显的抑制作用,尤其联合阿苯达唑使用治疗效果较好,说明两种药物具有协同治疗作用.
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细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗的培育及鉴定
目的 培育并鉴定细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗.方法 利用转pBI-Eg95质粒的根癌农杆菌LBA4404株介导的苜蓿子叶浸染法,将Eg95基因导人紫花苜蓿基因组,转Eg95基因苜蓿外植体在含有卡那霉素的选择培养基上经愈伤、出芽和生根阶段生长出小苗,后移栽到装有营养土的花盆中,生长2～3个月,获得完整的转Eg95基因苜蓿疫苗.提取转Eg95基因苜蓿的DNA、RNA及叶蛋白,采用PCR、RT-PCR、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot法进行鉴定.结果 PCR、RT-PCR法在471 bp处均扩增出目的条带;SDS-PAGE及Western blot法可见转Eg95基因苜蓿蛋白在相对分子质量约16.5×103处出现特异条带,与预期结果相符;Bio-Rad Quantity one系统分析表达效率约占提取总苜蓿叶蛋白的0.06%.结论 成功培育出细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗.
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细粒棘球绦虫重组双歧杆菌-Eg95疫苗诱导小鼠抗感染的保护性免疫作用
目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95疫苗免疫小鼠后对Eg原头节攻击感染的保护性免疫作用.方法 雌性BALB/c小鼠56只,12 ～ 14周龄,体质量20 ～ 25 g.将重组Bb-Eg95疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔黏膜接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,同时设有空载体、Bb和液体培养基(MRS)对照组,每组8只.免疫后8周,用Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算减蚴率；取血,分离血清,常规酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清免疫球蛋白IgG及其亚类和IgE水平；取脾,分离脾细胞,采用细胞培养的方法,在脾细胞悬液中分别加入Eg粗抗原(EgAg)和刀豆素A(ConA),四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测脾淋巴细胞增殖反应.组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验.结果 小鼠体内细粒棘球蚴质量组间比较差异有统计学意义(F=11.062,P＜ 0.05).其中皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔接种组和口服灌胃组细粒棘球蚴质量[(0.050±0.013)、(0.050±0.019)、(0.028±0.016)、(0.031±0.018)g]明显低于MRS对照组[(0.075±0.019)g,P均＜0.01],鼻腔接种组和口服灌胃组细粒棘球蚴质量明显低于皮下注射组和肌肉注射组(P均＜ 0.05)；减蚴率的高低与小鼠体内细粒棘球蚴质量变化成反比.小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3、IgE水平(吸光度,A),组间比较差异有统计学意义(F=21.774、36.977、27.071、14.746、10.131、9.444,P＜ 0.05或P＜0.01).其中血清IgG、IgG2a和IgG2b水平皮下注射组(0.022±0.004、0.007±0.002、0.008±0.002)、肌肉注射组(0.023±0.003、0.008±0.002、0,007±0.002)、鼻腔接种组(0.032±0.007、0.012±0.002、0.013±0.004)和口服灌胃组(0.028±0.006、0.010±0.003、0.010±0.002)均显著高于MRS对照组(0.015±0.002、0.002±0.001、0.003±0.001,P均＜0.01),鼻腔接种组和口服灌胃组高于皮下注射组和肌肉注射组(P＜ 0.05或P＜0.01)；小鼠血清IgGl、IgG3和IgE水平,皮下注射组(0.004±0.001、0.003±0.002、0.004±0.002)、肌肉注射组(0.004±0.001、0.004±0.001、0.004±0.002)、鼻腔接种组(0.005±0.002、0.005±0.003、0.005±0.002)和口服灌胃组(0.005±0.001、0.004±0.002、0.004±0.003)均显著低于MRS对照组(0.009±0.001、0.009±0.002、0.009±0.001,P均＜0.01).小鼠脾淋巴细胞增殖水平在脾细胞悬液、脾细胞悬液+ EgAg、脾细胞悬液+ConA时,组间比较差异有统计学意义(F=63.975、359.833、167.399,P均＜0.01),组内组间比较差异有统计学意义(F=6741.955、4953.667、869.320、201.235、175.413、139.653、169.994,P均＜0.01),其中在加入EgAg或ConA时,脾淋巴细胞增殖水平明显高于单纯脾细胞悬液,而且加入ConA高于EgAg(P均＜0.01).结论 细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗免疫小鼠,能有效的诱导小鼠产生保护性的免疫作用.
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子午沙鼠骨组织细粒棘球蚴病放射治疗后转归观察
目的 观察子午沙鼠骨组织细粒棘球蚴病放射治疗后转归情况.方法 建立子午沙鼠骨细粒棘球蚴病动物模型240只,按体质量采用随机数字表法分为3组:对照组、40 Gy/5次组、50 Gy/5次组,每组8C只,雌雄各半.对照组沙鼠未进行干预处理,40 Gy/5次和50 Gy/5次组采用6WV-X线定位照射治疗,5次连续放射,间隔2天后再重复放射5次.放疗结束后3、6个月时,观察子午沙鼠死亡和病变部位破溃、感染情况;每组选取存活沙鼠15只处死,观察计算囊液内头节死亡数并检测蛋白质、钙离子浓度,测量病变部位大直径和细粒棘球蚴囊湿重;显微镜下观察病变部位骨骼破坏、重建情况.结果 放疗结束后3、6个月时,随着放射剂量升高,沙鼠死亡数量明显减少(x2=10.4、17.4,P均＜0.05);沙鼠病变部位破溃、感染情况明显降低(x2=6.0、10.1,P均＜0.05);囊液内头节死亡例数明显升高[3个月:(22.4±3.1)、(95.0±5.2)、(136.0±5.4)个;6个月:(23.2±2.2)、(98.2±4.6)、(169.3±7.0)个;F=2 252.5、3 220.3,P均＜0.05];囊液蛋白质含量、钙离子浓度明显改变[3个月:(1.059±0.056)、(0.733±0.051)、(0.571±0.043)g/L和(2.802±0.157)、(3.056±0.060)、(3.546±0.135)mmol/L;6个月:(1.088±0.043)、(0.753±0.034)、(0.340±0.032)g/L和(2.804±0.019)、(3.068±0.052)、(3.886±0.046) mmol/L;F=366.0、138.9和1 550.5、2 727.3,P均＜0.05];病变部位大直径明显减小[3个月:(2.38±0.14)、(1.69±0.05)、(1.40±0.09)cm;6个月:(2.65±0.05)、(1.69±0.03)、(1.03±0.06)cm;F=372.5、3 846.1,P均＜0.05];细粒棘球蚴囊湿重明显减小[3个月:(3.47±0.11)、(2.54±0.12)、(1.46±0.07)g;6个月:(3.75±0.31)、(2.55±0.08)、(1.02±0.20)g;F=1 475.6、608.0,P均＜0.05].随着时间延长,对照组及40 Gy/5次组沙鼠死亡数量明显升高(x2=4.3、4.6,P均＜0.05),而50 Gy/5次组未见明显改变(x2=1.1,P＞0.05);对照组及40 Gy/5次组沙鼠病变部位破溃、感染情况明显增加(x2=5.5、4.3,P均＜0.05),而50 Gy/5次组未见明显改变(x2=0.3,P＞0.05);50 Gy/5次组囊液内头节死亡例数明显升高,囊液蛋白质含量、钙离子浓度明显改变(F=212.6、271.8、84.7,P均＜0.05);对照组病变部位大直径明显增加(F=47.1,P＜0.05),50Gy/5次组明显减小(F=188.3,P＜0.05);对照组细粒棘球蚴囊湿重明显增加(F=10.7,P＜0.05),50 Gy/5次组明显减小(F=68.5,P＜0.05).光镜下,随着放射剂量升高,病变部位骨基质及陷窝内细胞损伤情况逐渐加重;随着时间延长,对照组内骨陷窝内细胞少量死亡,而40Gy/5次组及50 Gy/5次组骨基质及骨陷窝内细胞都有变性坏死和部分修复.结论 经合适剂量(50Gy/5次)的放射线治疗,子午沙鼠细粒棘球蚴病的远期效果较好.
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青海高原棘球绦虫不同宿主感染情况及意义的研究
目的 分析1990 - 2010年青海省青南高原、祁连山-河湟谷地、柴达木盆地三类地形区终末和中间宿主棘球绦虫或棘球蚴感染情况,为青海高原棘球蚴病防治工作提供参考依据.方法 采用寄生虫形态学方法鉴定终末宿主犬、狐狸和狼棘球绦虫感染情况；家养及野生中间宿主棘球蚴感染情况调查采用解剖学和病理学方法鉴定,并对部分可疑病灶采用分子生物学方法进行虫种鉴定.结果 青南高原、祁连山-河湟谷地、柴达木盆地三类地形区无主犬均存在细粒棘球绦虫感染,其感染率分别为38.71％( 300/775)、49.60％( 124/250)、9.76％(4/41),不同地形区间比较,差异有统计学意义(x2=25.72,P＜ 0.01),另外,仅有青南高原的无主犬存在多房棘球绦虫感染,感染率为16.04％(98/611)；青南高原、祁连山-河湟谷地的狐狸多房棘球绦虫感染率分别为22.89％(38/166)、30.77％(12/39),且两地的狼存在细粒棘球绦虫感染.上述三类地形区家养绵羊、牦牛、山羊和猪棘球蚴感染率比较,差异有统计学意义(x2值分别为82.70、41.82、212.63、194.58,P均＜0.01)；且三类地形区家养绵羊、牦牛棘球蚴感染率[43.43％(5664/13 042)、49.47％(2917/5896),52.99％(887/1674)、42.18％(779/1847),50.70％(1049/2069)、52.90％(685/1295)]均处于较高水平,青南高原家养山羊和猪棘球蚴感染率[3.26％(7/215)、0.00％(0/108)]明显低于祁连山-河湟谷地、柴达木盆地[19.51％(119/610)、26.91％(43/1598),47.91％(343/716)、21.91％(71/324)].上述三类地形区野生高原鼠兔棘球蚴感染率分别为6.21％(243/3910)、1.80％(3/167)、0.00％(0/199),三类地形区间比较,差异有统计学意义(x2=18.50,P＜0.01),仅在青南高原发现青海田鼠、灰尾兔、岩羊、藏原羚、黄羊棘球蚴感染.结论 青海高原三类地形区的人群感染细粒和多房棘球蚴病的压力来自不同终末宿主,而无主犬是造成人群棘球蚴病的关键传染源;各种终末宿主和家养、野生中间宿主之间具有复杂的生活史循环链,提示青海高原是我国棘球蚴病防控的重点地区,其防治任务十分艰巨.
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细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的动态观察
目的 动态观察细牲棘球绦虫(Eg)转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫Balb/c小鼠后脾细胞因子的变化.方法 88只Balb/c小鼠按体质量随机分为两组,用转基因苜蓿叶蛋白提取液(20 s/L)100 μl口服灌胃和10μl鼻腔黏膜接种分别免疫小鼠,每3天1次,连续2个月.在末次免疫后0(对照)、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20周各组剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,体外经Eg粗抗原(EgAg)或刀豆蛋白A(ConA)刺激培养48 h,诱生白细胞介素(IL)-12、γ干扰素(IFN-γ)和IL-10;经EgAg或脂多糖(LPS)刺激培养72 h,诱生肿瘤坏死因子α(TNF-α).收集脾细胞培养上清液,常规ELISA法检测IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平.结果 口服灌胃组的IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后4～6、2～8、2～6、4～12周升高,分别在免疫后4、2、2、8周达高水平,其值分别为(25.0±5.8)、(575.0±28.9)、(50.0±11.5)、(42.5±2.9)ng/L,与0周[(11.3±2.5)、(125.0±28.9)、(11.3±2.5)、(12.5±2.9)ng/L]比较,差异有统计学意义(P均<0.01);鼻腔黏膜接种组的IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后4～6、2～10、4～10、6～16周升高,分别在免疫后6、4、6、6周达高水平,其值分别为(25.0±5.8)、(725.0±28.9)、(27.5±2.9)、(60.0±11.5)ng/L,与0周[(11.3±2.5)、(125.0±28.9)、(11.3±2.5)、(12.5±2.9)ng/L]比较,差异有统计学意义(P均<0.01).EgAg、ConA、LPS刺激组的细胞因子水平高于相应的脾细胞悬液组(P<0.05或<0.01),ConA或LPS刺激组的细胞因子水平高于相应的EgAg刺激组(P<0.05或<0.01).结论 细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗在免疫早期(2～10周)可诱导小鼠产生Th1和Th2混合型免疫应答.
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细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠脾细胞亚群的变化
目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化.方法 热絮凝法提取转基因苜蓿叶蛋白,用无菌双蒸水将叶蛋白提取液配成20 g/L,同时提取转空质粒(pBI121)苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白作对照.32只雌性Balb/c小鼠按体质量随机分为4组,每组8只.口服灌胃组:灌胃接种100 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液;鼻腔黏膜接种组:滴鼻接种10 μl转基因苜蓿叶蛋白提取液;空质粒对照组:滴鼻接种10μl转空质粒苜蓿叶蛋白提取液;正常蛋白对照组:灌胃接种100μl正常苜蓿叶蛋白提取液.小鼠每3天免疫1次,连续免疫2个月.末次免疫后第8周,各组小鼠用Eg原头节腹腔注射攻击感染(50个/只),感染后第24周剖杀小鼠,分离脾细胞,用流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群百分比.结果 口服灌胃组小鼠脾CD4+T细胞亚群百分比(0.286±0.009)、CD8+ T细胞亚群百分比(0.102±0.004)和CD4+/CD8+比值(2.814±0.014)均显著高于正常蛋白对照组(0.166±0.018、0.083±0.006、2.019±0.369,P<0.01或<0.05);鼻腔黏膜接种组小鼠脾CD4+T细胞亚群百分比(0.269±0.016)和CD4+/CD8+比值(2.955±0.986)与正常蛋白对照组比较明显升高(P均<0.01);口服灌胃组小鼠脾CD4+T细胞亚群百分比高于鼻腔黏膜接种组(P<0.05);空质粒对照组小鼠脾CD4+、CD8+T细胞百分比和CD4+/CD8+比值(0.169±0.018、0.093±0.019、1.852±0.188)与正常蛋白对照组比较,差异无统计学意义(P均>0.05).结论 CD4+T细胞亚群可能与细粒棘球绦虫转Eg95-Eg31融合基因苜蓿疫苗诱导的小鼠抗Eg原头节攻击感染的保护力有关.疫苗灌胃接种可能是一种较好的免疫途径.
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细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒构建及鉴定
目的 构建并鉴定细粒棘球绦虫(Eg)转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒.方法 从细粒棘球蚴包囊中分离原头节.经超声粉碎后抽提总RNA,反转录成eDNA,设计合成引物,以eDNA为模板.通过PCR从cDNA中扩增出目的 基因Eg95,经电泳及测序鉴定后,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒,电穿孔转化根癌农杆菌(At)LBA4404株;从转化的At阳性株中抽提质粒进行双酶切和以抽提的质粒为模板进行PCR鉴定.结果 RT-PCR扩增出1条约471 bp的特异性条带,DNA序列分析与GenBank知的序列同源性为100%.从转化的At中抽提的质粒,双酶切及PCR测定的结果与预期相符.结论 成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.
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高强度聚焦超声波对细粒棘球绦虫原头节的杀伤效应
目的 探索高强度聚焦超声波(HIFU)对体外分离的细粒棘球绦虫原头节的急、慢性杀灭作用.方法 实验对象为感染细粒棘球蚴病的羊肝原头节.选择声功率为0(对照组)、25、50、100、200、250 W的超声波辐照离体原头节,每种功率辐照时间分别为5、10、20、30、40、50、60 s,观察HIFU对离体原头节的即刻杀灭作用.以不致即刻杀伤的超声剂量作用原头节后,观察HIFU对原头节的迟发性生长抑制作用.光镜下,根据台盼蓝排斥法染色结果及观察原头节形态变化计算原头节死亡率.结果 HIFU对原头节有明显的急性杀伤作用,在一定的功率和时间范围内有剂量-效应关系,不同功率和辐照时间对原头节死亡率的影响,组间比较差异均有统计学意义(F值分别为5201.59、1865.65,P＜0.05),且功率与辐照时间之间存在交互效应(F=214.50,P＜0.05).随着超声照射剂量增大,其生物学效应越明显,声功率≥200 W的短时照射即可致原头节全部即刻死亡,部分原头节被打碎.以不致原头节即刻杀伤的超声照射后,体外培养2～7 d的原头节死亡率均较对照组明显增高(P＜0.05),随超声剂量的增大抑制原头节生长作用增强,培养第2天开始,50 W×10 s组强于25 W×20 s组(P＜0.05).结论 HIFU能够即刻杀灭原头节并能抑制原头节在体外的生长.
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细粒棘球绦虫Eg95基因工程疫苗研究进展
细粒棘球蚴病(echinococcosis)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)的中绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病.手术及药物治疗都因其局限性而受到限制,有保护作用的疫苗将成为控制该病流行的有效工具.目前为成功的棘球蚴病疫苗为Eg95疫苗,作者综述了细粒棘球绦虫Eg95基因工程疫苗的研究进展.
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细粒棘球绦虫疫苗研究进展
细粒棘球绦虫疫苗是防治囊型包虫病的一种重要途径,它包括死疫苗、分子疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和重组伤寒沙门氏杆菌疫苗等,文章综述了这几种疫苗的研究进展.
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PCR方法诊断家犬感染细粒棘球绦虫的特异性及在临床诊断中的应用价值
目的 验证PCR方法检测终宿主家犬感染细粒棘球绦虫的特异性及其在临床诊断中的应用价值.方法 取感染细粒棘球绦虫家犬粪便,显微镜下计数细粒棘球绦虫虫卵,稀释后PCR检测其敏感性.同时取家犬小肠内水泡带绦虫、多头绦虫、羊绦虫,将其DNA与细粒棘球绦虫DNA一起进行PCR扩增,观察其特异性.对133 bp的目标条带进行序列测定,对比分析.结果 PCR检测终宿主家犬感染细粒棘球绦虫具有高度的灵敏性,即使粪便中有1个虫卵(8 pg的DNA),也能测出,但扩增后特异性较差,无法利用扩增带型进行诊断.4种寄生虫均具有相同的133bp DNA重复序列,在400 bp均可检测出相同条带.结论 PCR方法检测终宿主感染细粒棘球绦虫DNA重复序列尽管有优良的灵敏性,因其特异性差,不适合用于临床诊断和推广.
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细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗的构建及鉴定
目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(rBb)-Eg95疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得Eg95抗原编码基因,采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌(E.coli-Bb)穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95.抽提质粒进行双酶切鉴定后,电穿孔转化到Bb中,构建细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出4947 bp的载体片段和471 bp的目的 基因片段:以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到471 bp的Eg95基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了理论基础.
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拉萨地区特殊肝包囊虫的手术治疗
肝包囊虫病是西藏地区一种常见的寄生虫病.细粒棘球绦虫的蚴是造成肝包囊虫的原因,被感染的病人可能在许多年无症状,并且初并未感痛苦.而手术是治愈此病的唯一较完善的方法,手术质量及手术方式的选择与治疗效果密切相关.现将我院1993年以来收治的80例肝包囊虫手术治疗情况报告如下.
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食源性寄生虫肝病
食源性寄生虫肝病是因进食生鲜或未经彻底高温处理的含有寄生虫病原体的食物，导致肝脏寄生虫感染的一类疾病的总称。近年来，我国部分地区独特的饮食习惯和人们对新奇食物的追求，使食源性寄生虫肝病逐渐成为新的公共卫生问题［1］。华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、肝片形吸虫、并殖吸虫等是临床常见的感染肝脏的食源性寄生虫，现就这几类食源性寄生虫肝病的发病机制、临床表现、诊断和治疗综述如下。
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影响细粒棘球绦虫病传播动力学的因素分析
细粒棘球绦虫的生活史包括两种宿主和一个自由牛存的卵期,其传播动力学取决于细粒棘球绦虫、两种宿主、生态环境等三者的相互作用,主要包括细粒棘球绦虫的生物潜能、聚集性,宿主的免疫激活能力,虫卵的散播、分布、活力,环境温度、湿度、地理景观,肉类检疫、死亡动物及其内脏处理、犬驱虫和流浪宿主处理,人群生活卫生习惯和生产方式等.了解它们的相互关系及其对传播动态的影响,对制定和评价防治措施至关重要.该文重点就细粒棘球绦虫的生物因素、两种宿主、生态环境和防治手段埘其传播动力学的影响进行讨论.
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基于组学研究的细粒棘球绦虫分泌蛋白组预测与分析
目的 在组学水平高通量、系统地预测及筛选细粒棘球绦虫的分泌蛋白组,研究分泌蛋白及其信号肽特征,为后续诊断和疫苗相关抗原(簇)研究奠定基础. 方法 利用SignalP4.1对细粒棘球绦虫全基因组蛋白序列进行信号肽预测,对含有信号肽的蛋白依次应用生物信息学软件TMHMMv2.0、Phobius、Big-PI predictor及TargetP1.1进行细粒棘球绦虫经典分泌蛋白质组筛选.随后利用LipoP1.0和TatP1.0分析分泌蛋白信号肽酶切位点类型,用SPSS19.0统计归纳信号肽和分泌蛋白的氨基酸序列特征,Blast2GO对分泌蛋白质组进行基因本体(gene ontology,GO)注释与聚类. 结果 在细粒棘球绦虫14 235条全基因组序列所编码的蛋白中,共发现984条含有信号肽的蛋白序列;其中有363条属于膜结合蛋白,另有25条定位于亚细胞器;终筛选到596条经典分泌蛋白序列.分泌蛋白质组的信号肽长度集中于15～ 31个氨基酸残基,其中疏水性氨基酸含量为62％,主要被Ⅰ型信号肽酶所识别,且酶切位点在-3及-1位相对保守;分泌蛋白氨基酸含量集中于50～ 700个氨基酸残基,小于非分泌蛋白氨基酸含量(t=3.06,P＜0.01);GO分析显示分泌蛋白主要参与新陈代谢、细胞过程、调节和发育等生物过程,并行使催化、结合、抗氧化和酶调节功能. 结论 本研究预测筛选到含有596条蛋白序列的细粒棘球绦虫分泌蛋白组,可用于后续的诊断和疫苗相关抗原筛选研究.
