重组NIS基因腺病毒的制备及在心肌细胞中的特异表达

目的 构建肌凝蛋白轻链-2(MLC-2v)启动子调控的NIS腺病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性.方法 将MLC-2v启动子和NIS基因亚克隆至腺病毒穿梭载体,再与含有骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌(BJ5183)同源重组,经人胚肾细胞(HEK293)包装并扩增得到重组腺病毒Ad-MLC-NIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的腺病毒Ad-CMV-NIS、仅含有启动子的腺病毒Ad-MLC和仅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作为对照组.腺病毒体外感染心肌细胞和非心肌细胞,通过Western blot检测NIS蛋白的表达,行动态摄碘及NaClO4摄碘抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性.通过台盼蓝染色实验检测腺病毒感染及NIS摄碘情况对心肌细胞活力和增殖的影响.结果 成功构建重组NIS腺病毒.Western blot检测示感染Ad-CMV-NIS的心肌细胞和非心肌细胞均呈NIS蛋白高表达；感染Ad-MLC-NIS的非心肌细胞出现微量蛋白表达,而心肌细胞中NIS蛋白高表达.动态摄碘实验示感染Ad-MLC-NIS的H9C2细胞、A549细胞、U87细胞摄碘峰值分别为5844.0、833.6、846.0放射性计数·min-1.H9C2细胞的摄碘被NaClO4抑制.感染复数(MOI)为100的腺病毒感染心肌细胞,感染和摄碘实验对心肌细胞活力和增殖的影响较小.结论 MLC-2v启动子调控的腺病毒载体可使外源基因NIS在心肌细胞内特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS在心肌中作为报告基因的研究奠定了基础.

17-AAG对转染NIS基因的未分化甲状腺癌摄碘动力学的影响

目的 探讨17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)对已转染NIS基因的未分化甲状腺癌(ATC)细胞摄碘动力学的影响.方法 采用脂质体转染法,将携带NIS基因的重组质粒pcDNA3.1-NIS转染入ATC细胞株FRO细胞中,G418抗性筛选获得稳定表达细胞系NIS-FRO.在NIS-FRO细胞的培养基中引入125I,进行125I内流及外流的系列实验,绘制时间-放射性曲线.进一步分析经1μmol/L的17-AAG作用24 h后NIS-FRO细胞125I内流及外流的变化,并与未经转染的细胞进行对比,2组间各个时间点的放射性计数采用两样本t检验进行统计学分析.结果 NIS-FRO细胞的摄125I能力明显提高,约为FRO细胞的10.68倍(t=45.329,P＜0.001),但去除孵育环境中的125I后30 min,细胞内的125I滞留率仅为初始的10.5％.1μmol/L的17-AAG作用于NIS-FRO细胞后24h,细胞摄125I能力进一步提高,在含125I的培养基中孵育20～60 min,其放射性计数为31771.8～54815.5 min-1,摄125I能力较对照组( 24020.3～41293.8)提高了24.8％～ 35.5％(t值依次为3.096、4.275、3.055、4.292和5.496,P均＜0.05);撤掉孵育环境中的131I后5～30 min,细胞内的125I滞留率为32.7％ ～85.2％,较对照组(10.5％～56.8％)明显增加(t值依次为22.801、13.096、19.631、38.205、43.519和29.322,P均＜0.01),125I的外流减少,30 min后17-AAG作用组的细胞内125I滞留率为32.7％,为对照组的3.1倍.结论 把NIS转染入ATC细胞后获得的稳定表达细胞株在经一定浓度的17-AAG作用后,可进一步提高肿瘤细胞的摄碘率,并可明显延迟碘的外流,提高细胞内碘的滞留率.

自身免疫性甲状腺疾病患者钠/碘转运体抗体的研究

目的:初步探讨血清钠/碘转运体自身抗体(NIS-Ab)与自身免疫性甲状腺疾病的关系.方法:选择门诊初发的自身免疫性甲状腺疾病患者54例,分为格雷夫斯甲状腺功能亢进(GD)和桥本甲状腺功能减退(HT)两组,采用酶联免疫吸附法检测血清中NIS-Ab水平.结果:GD组患者血清中NIS-Ab含量明显高于正常对照组和HT组;HT组与正常对照组比较血清NIS-Ab量差异无显著性.NIS-Ab在GD和HT患者中的阳性率分别为32%和20%,NIS-Ab水平与促甲状腺激素受体抗体(TRAb)无统计学相关关系.结论:NIS-Ab与自身免疫性甲状腺疾病密切关联,可能在GD和HT的发病机制中扮演重要角色.

甲状腺组织中钠/碘转运体基因表达的研究

目的:研究各种病理甲状腺组织中钠/碘转运体(NIS)基因的表达情况,探讨NIS与甲状腺疾病之间的关系.方法:甲状腺组织取自3例Graves病(GD)患者,2例桥本甲状腺炎(HT),2例甲状腺乳头状癌(TC),2例癌旁正常甲状腺组织,运用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测NISmRNA的表达情况.结果:癌旁正常甲状腺组织表达NISmRNA,GD甲状腺组织NIS基因表达量明显增多(P[

干扰素-γ对甲状腺细胞钠/碘转运体基因调控的研究

目的:研究干扰素-γ(IFN-γ)对甲状腺滤泡细胞膜上钠/碘转运体(NIS)基因表达的影响,探讨细胞因子在甲状腺生理功能调控和甲状腺疾病发病机制中的作用和地位.方法:取Graves病(GD)患者的甲状腺组织,进行甲状腺细胞原代培养,培养5天后,吸去培养液,换用含不同浓度IFN-γ的试验液,与单层培养的滤泡上皮细胞共同孵育48 h,运用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测钠碘转运体(NIS)mRNA表达的变化.结果:IFN-γ浓度在0、1 U/ml时,GD甲状腺滤泡上皮细胞膜上NIS mRNA表达无明显差异;IFN-γ浓度在10、100U/ml时,NIS基因表达比前一浓度时明显受抑制(P＜0.05);IFN-γ浓度为1000U/ml时,NIS基因表达量与前一浓度比较无统计学差别.结论:IFN-γ可抑制甲状腺滤泡细胞基膜上NIS基因的表达,提示细胞因子在甲状腺生理功能调控和甲状腺疾病发病机制中发挥重要作用.

含hNIS报告基因的乏氧调控重组质粒的构建及其功能鉴定

目的 构建乏氧应答启动子调控的人钠／碘共同转运体(hNIS)报告基因重组质粒,为实体瘤微环境乏氧的实时监测提供研究基础.方法 合成乏氧反应元件(HRE)的核苷酸片段,克隆入pGL3-promoter,构建为pGL3promoter-5×HRE载体.然后将扩增的hNIS基因插入pGL3-promoter-5×HRE载体中,构建为pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒并进行测序验证.以DMSO处理组作为对照,CoC12处理HEK293细胞模拟乏氧；将经验证的pShuttle-NIS质粒转染HEK293乏氧细胞,同时将构建的pcDNA3.1-HIF-1α质粒和pShuttle-NIS质粒按照3:1比例转染HEK293细胞,转染空质粒pcDNA3.1和pShuttle-NIS质粒组作为对照.通过qRT-PCR法检测hNIS基因表达的变化.并用高锝酸盐( 99mTcO4-)处理双质粒共转染的HEK293细胞,洗脱游离99m TcO4-后通过γ计数器采集细胞放射性计数,检测所表达NIS蛋白的功能.结果 克隆的基因产物与预期一致,序列无碱基的突变.共转染HIF-1α质粒组及转染pShuttle-NIS的CoC12处理组,其hNIS mRNA的表达量显著高于转染空质粒及DMSO处理组(均P＜0.01).共转染HIF-1α质粒组细胞的99mTcO4-摄取率显著高于空质粒对照组(P＜0.01).结论 pGL3-promoter-5×HRE-NIS重组质粒转染后能介导细胞摄取99mTcO4-,为微环境细胞乏氧的核素显像提供实验依据.

白细胞介素6对甲状腺细胞钠/碘转运体的基因调控

目的研究白细胞介素6(IL-6)对甲状腺滤泡细胞膜上钠/碘转运体(NIS)基因表达的影响,探讨细胞因子在甲状腺生理功能调控和甲状腺疾病发病机制中的作用和地位.方法取Graves病(GD)患者的甲状腺组织,进行甲状腺细胞原代培养,培养5d后,吸去培养液,换用含不同浓度IL-6的试验液,与单层培养的滤泡上皮细胞共同孵育48h,运用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测NIS mRNA表达的变化.结果 IL-6浓度在0U/ml、1U/ml时,GD甲状腺滤泡上皮细胞膜上NIS mRNA表达无明显差异;IL-6浓度在10U/ml、100U/ml时,NIS基因表达比前一浓度时明显受抑制(P＜0.05),且高浓度比低浓度抑制更加明显;IL-6浓度为 1000U/ml时,NIS基因表达量与前一浓度比较无统计学差别.结论 IL-6可抑制甲状腺滤泡细胞基底膜上NIS基因的表达,提示细胞因子IL-6的浓度不同在甲状腺生理功能调控中发挥的作用也不同.

人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞介导放射性碘治疗的实验研究

目的：检测碘131（131I）对转染了人钠/碘转运体（hNIS）基因的人结肠癌细胞（SW480细胞）的杀伤作用。方法：将SW480细胞分为转染组、空白质粒转染组（空白质粒组）和空白对照组，行体外摄131I试验、高氯酸盐抑制实验，及AnnexinV-FITC/PI双染行流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：转染组与空白对照组及空白质粒组比较，摄131I能力均增高8倍；高氯酸盐可以有效地抑制转染组的摄131I能力；AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞仪检测结果显示，转染组凋亡指数高于空白对照组和空白质粒组。结论：131I对转染hNIS-SW480细胞具有显著杀伤效果。

131I照射对分化型甲状腺癌细胞摄碘水平及NISmRNA表达的影响

目的 分析131I照射对分化型甲状腺癌细胞摄碘水平及钠/碘转运体(NIS)mRNA表达的影响.方法 收集50例分化型甲状腺癌(DTC)患者的临床资料,所有患者均应用同一活度的131I进行照射治疗,治疗前后应用γ计数仪测定125I摄取率,采用RT-PCR法检测甲状腺癌细胞的NISmRNA表达,对其相关性进行分析.结果 随着照射时间的延长,甲状腺癌患者对125I摄取率出现下降,凝胶电泳显示甲状腺癌细胞组细胞NISmRNA表达降低,前后比较差异明显,有统计学意义(P＜0.05).结论 131I照射可降低分化型甲状腺癌患者125I摄取率,可能与甲状腺癌细胞NISmRNA表达降低有关.

rhNIS基因转导胆管癌细胞介导125Ⅰ摄取的研究

目的 探讨人钠/碘同向转运体(hNIS)基因cDNA转导至胆管癌细胞系QBC939细胞后的表达水平及其对介导125Ⅰ摄取的影响.方法 将扩增出的hNIS基因cDNA序列克隆至pMD18-T载体;筛选后的亚克隆hNIS编码至真核表达型载体PDC316中,经脂质体途径导入胆管癌细胞(QBC939),建立新细胞系(QBC939-A).同时设立空质粒(QBC939-B)转染和空白(QBC939-C)对照组.在体外培养条件下采用半定量RT-PCR检测各组2,3,6 d细胞内hNIS.mRNA表达水平和1,2,3,6 d的125Ⅰ摄取情况.结果 建立了能稳定表达hNIS摹因的新型细胞系QBC939-A.hNIS-mRNA表达水平检测显示,Q13C939-A于3 d表达量达高峰,与QBC939-B和QBC939-C比较,有显著性差异(P＜0.05).且QBC939-A细胞的摄碘能力在转染后3 d达高峰,较QBC939-C高14倍,较QBC939-B高16倍.结论 rhNIS基因转导至胆管癌细胞足以在短期内介导125Ⅰ的摄取,为介导125Ⅰ靶向治疗胆管癌的研究奠定了基础.

甲状腺特异性转录因子和钠/碘转运体与甲状腺肿瘤的关系

甲状腺滤泡细胞的主要功能是合成、分泌甲状腺激素,此过程需要碘、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、H2O2等四种重要成分并依赖TSH-cAMP系统的调节.甲状腺激素合成通路中多种甲状腺特有基因的表达受甲状腺特异性转录因子调控.三种甲状腺特异性转录因子TTF-1、TTF-2和Pax-8中,TTF-1和Pax-8与甲状腺肿瘤的发生有关;浓缩碘的能力是正常甲状腺组织的一个功能特征,钠/碘转运体介导活性碘的转运,与同位素扫描的"冷、凉"结节关联,是甲状腺癌放射性碘治疗的依据之一.它们与甲状腺肿瘤的关系是当今甲状腺分子病理学研究的热点.

脂多糖对人甲状腺细胞钠/碘转运体的基因调节作用

目的 探讨脂多糖(LPS)对体外培养人甲状腺细胞一氧化氮(NO)的诱生作用及对细胞膜上钠/碘转运体(NIS)基因表达的影响.方法 采用细胞培养方法及半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,观察不同浓度LPS对甲状腺细胞NO的诱生作用及对NIS mRNA表达的影响.结果 (1)LPS(1、10、100 μg/mL)剂量依赖性刺激体外培养人甲状腺细胞产生NO和抑制NIS的表达.结论 LPS可抑制甲状腺细胞膜上NIS的基因表达,可能与LPS诱生甲状腺细胞产生NO有关.

一氧化氮对人甲状腺细胞钠/碘转运体基因的调节作用

目的:研究一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)对体外培养人甲状腺细胞膜上钠/碘转运体(NIS)基因表达的影响,阐明NO抑制甲状腺细胞碘摄取的分子机制.方法:采用细胞培养方法及半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,以NIS/β-actin光密度比值为指标观察不同浓度SNP(0、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3) mmol·L~(-1))对甲状腺细胞NIS mRNA表达的影响.结果:sNP(0、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)mmol·L~(-1))作用后各组NIS/β-actin光密度比值依次降低(P<0.05或P<0.01),呈浓度依赖性抑制NIS mRNA的表达.结论:NO抑制甲状腺细胞碘摄取可能与其抑制NIS mRNA表达有关.

131I照射对分化型甲状腺癌细胞摄碘水平及NIS mRNA表达的影响

目的:探讨131I不同时间照射后分化型甲状腺癌细胞摄取放射性碘(125I)水平的变化以及检测是否影响NIS mRNA表达.方法:分化型乳头状甲状腺癌细胞株(GTHW3)培养在DMEM培养基中,应用同一活度(20μCi)的131I对培养癌细胞进行不同时间(6h、12h、24h、48h)的照射.γ计数仪测定放射性碘(125I)摄取率.采用RT-PCR法检测甲状腺癌细胞的NIS mRNA表达.结果:不同时间的放射性131I照射使甲状腺癌细胞摄取125I降低;凝胶电泳显示放射性131I照射24h后GTHW3细胞NIS mRNA表达降低;照射组各时间点的125I摄取率及24h和48h的NIS mRNA表达与未照射对照组比较均有显著性差异.结论:131I照射可使DTC细胞的NIS mRNA表达降低,提示131I照射致DTC细胞失分化及其摄碘能力降低可能与DTC细胞NIS mRNA表达降低有关.

碘化钠对甲状腺细胞钠/碘转运体基因调节的研究

人钠/碘转运体354、395位点基因突变与先天性甲状腺功能减退症的相关性研究

钠/碘转运体与甲状腺疾病

钠/碘转运体(NIS)是一种膜蛋白,在甲状腺细胞摄碘中起重要作用.此蛋白受多种因素的调控,与其他甲状腺自身抗原关系密切.NIS在某些甲状腺疾病的发病及治疗中起重要作用,成为目前研究的热点.