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聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT-PCR中的应用
目的:探讨聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT-PCR中的应用.方法:提取正常组大鼠和链脲佐菌素致糖尿病模型组大鼠心肌组织总RNA,逆转录得到cDNA第一链,以此为模板进行PCR扩增,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染技术分析不同循环数及模板量与PCR产物量间的关系.结果:PCR扩增反应在第20～25个循环,起始模板量为0.8～2.4μg时,PCR产物量与起始模板量呈现较好的线性关系.结论:通过控制起始模板量,减少PCR循环数使目的基因的扩增处于PCR扩增指数期,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DM银染技术,可以通过比较PCR扩增产物量的变化以分析目的基因表达水平的差异.
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地高辛掺入RT-PCR半定量检测WT1基因在AML中的表达及其意义
目的建立客观的半定量检测WT1基因表达的方法,探讨WT1基因表达水平与急性髓细胞性白血病(AML)预后的关系.方法用地高辛标记的脱氧三磷酸尿苷(DIG-11-dUTP)掺入逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测,用KG-1细胞建立WT1表达的半定量稀释曲线,分析53例AML及21例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因的表达.结果倍比稀释的KG-1细胞WT1基因表达水平与稀释倍数有良好的线性关系;将WT1基因与β-actin基因的表达水平之比＜0.16定为(-),≥0.16～＜0.6为(+),≥0.6～＜1.0为(),≥1.0为().21例非恶性疾患病人骨髓中WT1基因均为阴性,41例初治AML病人WT1基因表达阳性率为92.7%,随着WT1基因表达水平的升高,完全缓解(CR)率有明显下降的趋势(＜0.6及≥0.6组比较P＜0.025).CR后WT1基因表达水平明显下降,复发后又显著升高.结论 DIG掺入RT-PCR半定量检测WT1基因表达的方法客观、准确,WT1基因表达水平与AML的预后相关.
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蓝氏贾第鞭毛虫类高尔基体的研究
目的 探讨类高尔基体结构在蓝氏贾第鞭毛虫滋养体和成囊不同时段的存在情况及其动态变化机理.方法 用可特异性标记真核细胞高尔基体的荧光染料C6-NBD神经酰胺,标记有活性的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体及成囊6、12、18 h虫体,并用荧光显微镜观察.同时利用半定量RT-PCR方法检测高尔基体膜结合蛋白golgin245和膜泡融合的调节蛋白Rab1在蓝氏贾第鞭毛虫对数生长期滋养体及成囊6、12、24 h的虫体中的表达水平.结果 极少数蓝氏贾第鞭毛虫滋养体被C6-NBD神经酰胺标记;多数处于成囊6、12、18 h时段的虫体均可见被特异标记成亮绿色的核周围区域.golgin245和Rab1在滋养体及成囊诱导6、12、24 h的虫体中的表达水平无显著变化.结论 蓝氏贾第鞭毛虫在成囊过程中出现类高尔基体结构,而在对数期滋养体中却没有.在蓝氏贾第鞭毛虫成囊过程中,高尔基体结构成分无大量合成,出现的类高尔基体结构可能是各组分临时组装的结果.
关键词： 蓝氏贾第鞭毛虫 类高尔基体 C6-NBD神经酰胺 半定量RT-PCR -
VEGF-C和FLT-4在非小细胞肺癌组织中的表达及其意义
目的 研究VEGF-C、FLT-4在非小细胞肺癌组织中的表达及其与淋巴结转移的关系.方法 采用半定量RT-PCR和免疫组化方法,检测60例非小细胞肺癌肿瘤组织中VEGF-C、FLT-4的表达.结果 60例非小细胞肺癌组织中,36例(60%)VEGF-C阳性表达,30例(50%)FLT-4阳性表达.有淋巴结转移者VEGF-C和FLT-4的阳性表达率分别为80.5%和69.4%,明显高于淋巴结阴性组(29.2%和33.3%),有非常显著性差异(P值均＜0.01).经半定量RT-PCR分析,VEGF-C和FLT-4在有淋巴结转移者中的表达量明显高于无淋巴结转移者,有显著性差异(分别为P＜0.01,P＜0.05).结论 VEGF-C及其受体FLT-4的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移有关.
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半定量RT-PCR技术在肿瘤相关基因检测中的应用
目的探讨半定量反转录PCR(RT-PCR)对肿瘤相关基因的检测及方法的改进.方法用RT-PCR法检测食管癌患者的癌组织MMP-2 mRNA的表达.结果改进的RT-PCR具有相同的检测灵敏性,并可降低工作强度.结论半定量RT-PCR为一种灵敏可靠的检测RNA表达的方法.
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BIT1基因在伴淋巴结转移的食管鳞癌中的表达
目的:探讨BIT1(Bcl-2 inhibitor of transcription1)基因在伴淋巴结转移的食管鳞癌组织中的表达及与食管鳞癌侵袭、转移的关系.方法:采用半定量RT-PCR法检测30例食管鳞癌、30例癌旁不典型增生组织及30例正常食管粘膜组织中BIT1基因的相对表达量.结果:BIT1基因的表达在癌组织中均高于不典型增生组织及正常食管粘膜组织(P＜0.05),而其在不典型增生及正常食管粘膜中无统计学意义(P＞0.05).BIT1基因的表达水平与患者的年龄、性别及肿瘤浸润深度均无明显相关(P＞0.05),但其表达水平与淋巴结转移及临床TNM分期有关.BIT1基因在淋巴结转移组中的表达明显高于无淋巴结转移组(P＜0.001);BIT1基因在TNMⅢ/Ⅳ期组中的表达明显高于Ⅰ/Ⅱ期组(P＜0.05).结论:BIT1基因高表达可能与食管鳞癌的侵袭、转移有关.
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黄连素诱导体外培养的肺腺癌A549细胞凋亡
目的 研究黄连素对体外培养的A549增殖和凋亡作用.方法 利用MTT法观察黄连素对A549的增殖影响;荧光显微镜观察细胞形态的改变;琼脂糖凝胶电泳检测DNA的损伤;半定量RT-PCR法分析Bcl-2,Bax,p53mRNA的表达情况;流式细胞仪测定细胞周期的阻滞情况;血清药理学观察大鼠含药血清对A549的作用.结果 黄连素能显著抑制A549增殖,并呈一定的量效和时效关系;细胞的形态发生明显改变,出现凋亡小体;DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的梯状条带;黄连素能够上调Bax、p53,下调Bcl-2的mRNA的表达;大鼠含药血清能显著抑制细胞生长.结论 黄连素能够抑制A549细胞生长 ,诱导凋亡.
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Plk1在肝癌组织中表达及意义
目的:探讨Plk1在原发性肝细胞性肝癌中的表达及其意义.方法:用半定量RT-PCR、Western blot的方法检测21例原发性肝细胞性肝癌中Plk1的表达情况,并分析其与肝癌临床病理因素的关系.同时取肝硬化及正常肝组织各7例做对照.结果:肝癌组织中Plk1mRNA表达比值(Plk1/β-actin)为0.572±0.144,明显高于肝硬化组织中的0.250±0.057和正常肝组织的0.218±0.073(P＜0.01).Plk1 mRNA表达水平在肿瘤直径大于5 cm组中为0.641±0.110,而在肿瘤直径小于5 cm组中为0.458±0.120,两组之间比较有统计学差异(P＜0.01).其在有门静脉癌栓患者中的表达为0.652±0.107,明显高于无门静脉癌栓者中的表达0.522±0.144 (P＜0.05).而与有无包膜,肿瘤病理分级和AFP阳性与否无明显相关.肝癌组织Plk1蛋白表达明显高于肝硬化及正常肝组织中的Plk1蛋白表达量.结论:原发性肝癌组织中Plk1mRNA及蛋白表达均明显增加；Plk1的表达高低与原发性肝癌的肿瘤直径大小及脉管侵犯有明显相关,提示其在肝癌生长及侵袭中发挥重要作用,为进一步研究肝癌的生长侵袭机制提供了思路.
关键词： 原发性肝癌 PLK1 半定量RT-PCR Western blot -
TNF-α对人滑膜细胞RANKL、OPG mRNA表达的影响
目的 观察TNF-α(rumor necrosis factor-α)作用下人滑膜细胞RANKL(receptor activator na-clear factor kappa B hgand)及OPG(osteoprotegerin)mRNA表达的改变.方法 体外原代培养获得人滑膜细胞,借助半定量RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)检测细胞分别在不同浓度的TNF-α及其不同作用时段RANKL、OPG mRNA水平表达的变化.结果 TNF-α能刺激人滑膜细胞RANKL和OPG mRNA的表达.同时,TNF-α浓度在10ng/mL时RANKL/OPG比值较对照组升高(P<0.01),并且TNF-α作用12 h和24 h时,KANKL/OPG比值均明显高于对照组(P<0.01).结论 TNF-α能够通过调节人滑膜细胞的RANKL/OPG的比值,从而可能参与影响病变关节周围骨破坏.
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miR-1、miR-16和miR-208前体在乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达
目的 检测心肌特异的miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中的表达.方法 利用出生1～3 d的Sprague-Dawley (SD)大鼠和C57BL/6小鼠,采用2.5％胰酶消牝和差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞.提取原代的乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及P1代的心肌成纤维细胞总RNA,以β-actin为内参照,逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测miR-1、miR-16和miR-208的前体表达水平.用FluorChem8900软件分析琼脂糖凝胶电泳后PCR产物条带的灰度值,计算出表达的目的miRNA前体与β-actin的比值.结果 有效分离并培养了乳C57BL/6小鼠、乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞.RT-PCR结果显示,在乳SD大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中miR-1和miR-16均有相近水平的表达；心肌细胞中miR-208的表达显著低于miR-208b(P＜0.01),miR-208b在心肌细胞中的表达显著高于其在心肌成纤维细胞中的表达(P＜0.05).乳C57BL/6小鼠心肌细胞中miR-1a-1的表达显著低于miR-1a-2(P＜0.01),而miR-1a-2在心肌细胞和心肌成纤维细胞中的表达水平一致；miR-16-1在心肌细胞和心肌成纤维细胞中表达水平相近,而miR-16-2在两种细胞中均不表达；心肌细胞中miR-208a和miR-208b表达水平差别不明显,心肌成纤维细胞中只有miR-208a表达,并且在水平上低于其在心肌细胞中的表达(P＜0.05).结论 miR-1、miR-16和miR-208前体在乳小鼠、乳大鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞中呈细胞特异性的表达.
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湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲分布及与LDC表达的关系
目的:测定湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲含量,分析石杉碱甲分布与赖氨酸脱羧酶基因(LDC)表达的关系.方法:采用HPLC测定蛇足石杉根、茎、叶中石杉碱甲含量,HPLC条件:Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-0.08 mol/L醋酸铵(32:68,V/V),流速为1.0 mL/min,柱温为25℃,检测波长为308nm.以肌动蛋白基因为内参物,通过半定量RT-PCR比较LDC在根、茎、叶中的表达量.结果:石杉碱甲在0.5～10.0 μg/mL线性关系良好,平均加样回收率为102％,RSD为0.32％;湘西蛇足石杉根、茎、叶中石杉碱甲含量分别为(118.35 ±0.77) μg/g、(411.09±2.47) μg/g、(562.15±2.86) μg/g;半定量RT-PCR分析表明LDC在根、茎、叶中表达量无明显差异.结论:湘西蛇足石杉不同部位石杉碱甲含量差异显著;推测赖氨酸脱羧酶不是石杉碱甲生物合成中的关键酶.
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肺癌耐药相关基因在肺癌组织和肺癌细胞株中的表达
背景与目的:我们已经通过抑制消减杂交技术发现了一条新的长494bp的肺癌耐药相关基因片段,并克隆了它的全长cDNA序列.本研究旨在研究该肺癌耐药相关基因(lung cancer drug resistance-related gene,LCDRG)在肺癌组织、癌旁组织及5种肺癌细胞株中的表达.方法:应用半定量RT-PCR检测38例肺癌组织、12例癌旁组织和5种肺癌细胞株中该基因的表达.结果:肺癌组织中LCDRG mRNA的表达明显高于癌旁组织(P<0.001),但在肺腺癌和鳞癌之间差异无统计学意义.该基因在肺腺癌细胞株SPC-A-1和A549、大细胞肺癌细胞株H460、小细胞肺癌细胞株H446和SH77中的表达依次递减.结论:LCDRG是一条肺癌相关基因,该基因可能与肺癌的发生、发展密切相关.
关键词： 肺肿瘤 半定量RT-PCR BC006151基因 -
OCT4在肝细胞癌中的表达及其临床意义
背景与目的:近年关于肝癌干细胞问题备受关注,已发现部分干细胞标志物在肝细胞癌中表达并与预后有关,其中OCT4基因是POU转录因子的重要组员,是维持胚胎干细胞自我更新能力和分化潜能的关键因子.本研究旨在检测OCT4A在肝细胞癌中的表达情况,并探讨其与病理因素和预后的关系.方法:用半定量RT-PCR检测5株人肝癌细胞系和1株永生化肝细胞系,以及107例肝细胞癌组织、相应的癌旁肝组织和20例正常无肝硬化肝组织中OCT4A mRNA的表达,并结合肝癌临床病理因素及预后进行分析.结果:OCT4A mRNA在人肝癌细胞系SMMC-7721、BEL-7402、Hep-G2、MHCC-97L、MHCC-97H中均表达,而在永生化肝细胞系L-02中无表达.OCT4A mRNA在肝癌组织中表达率为72.0%,明显高于癌旁肝组织的30.8%(P<0.001),在正常无肝硬化肝组织中无表达.肝癌组织中OCT4A mRNA的表达与肿瘤大小、血管侵犯及TNM分期有关(P<0.05).OCT4AmRNA阳性肝癌患者及阴性患者的3年总生存率分别为48.0%和83.7%,3年无瘤生存率分别为34.1%和58.0%,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:OCT4A mRNA在肝癌细胞及肝癌组织中高表达,可能在肝癌发生发展中发挥重要作用,可以作为肝癌临床预后的一个重要参考指标.
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垂体瘤发病相关基因的大规模筛选及鉴定
目的：探讨垂体瘤与垂体组织差异表达基因的大规模筛选及鉴定。方法：垂体无功能腺瘤及正常垂体组织cDNA文库构建，大规模表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)测序、表达谱差异的生物信息学处理及半定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)鉴定。结果：从无功能腺瘤和正常垂体组织中分别获得1253和7222个质量满意的ESTs；垂体瘤中已知基因的品种数200个，经组织表达谱差异比较的统计学软件处理，在这些已知基因中，差异的可靠性≥0.99者38个，≥0.95者130个；其中与细胞生长、分化相关的G2类基因共17个；6个经半定量RT-PCR证实4个基因的表达在垂体瘤中明显高于正常垂体。结论：与细胞生长、分化相关的G2类基因MEIS2、SMT3C、C1D、BUB3在垂体瘤中表达高于正常垂体，推测可能与垂体瘤的发生有关。
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18srRNA作为内参在肺癌相关基因LSCC-3研究中的应用
目的:利用以18srRNA为内参照系统的半定量RT-PCR方法对肺癌相关基因LSCC-3在肺癌组织和正常肺组织中的差异表达进行研究并探讨18srRNA作为内参照系统的可行性及其系统优化.方法:分别提取肺癌组织和癌旁正常肺组织共计50对标本的总RNA,根据人肺癌相关基因LSCC-3和人18srRNA序列分别设计引物,以18srRNA作为内参照物进行双扩增RT-PCR反应,对反应体系及过程进行优化并分别进行三次反应,三次反应产物经琼脂糖凝胶电泳后以凝胶成像分析系统行半定量分析,并对结果进行统计学处理.结果:经优化反应系统,以18srRNA作为内参照物的半定量RT-PCR反应结果稳定、三次反应结果经t检验显示差异无统计学意义(P>0.05);经配对t检验,人肺癌相关基因LSCC-3在肺癌组织中表达上调,与癌旁正常组织间存在明显的差异表达(P<0.005),与同期进行的Northern blot实验结果完全符合.结论:由于18srRNA在各种不同功能状态的不同细胞内的量的相对稳定,经过优化条件,以18srRNA作为内参照物的半定量RT-PCR系统的结果是稳定、可信的.
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BIRC5表达上调在鼻咽癌发病过程的研究
目的 寻找在鼻咽癌发病过程中起着重要作用的关键癌基因或抑癌基因. 方法 利用基因芯片比较混合的鼻咽癌细胞株与非鼻咽癌组织之间的差异表达基因,并以生物信息学的方法,寻找癌基因和抑癌基因,以半定量RT-PCR和免疫组化分析鉴定重要癌基因或抑癌基因表达结果的可靠性. 结果 鼻咽癌细胞中表达上调比较明显的BIRC5基因在凋亡抑制信号通路中起着重要的作用,参与鼻咽癌的发病过程.半定量RT-PCR分析显示BIRC5 mRNA在肿瘤组中表达明显上调;免疫组化检测78个非癌鼻咽组织和82个鼻咽癌组织,Mann-Whitney test统计分析发现,与非癌鼻咽组织相比,BIRC5蛋白在鼻咽癌组织中表达明显上调(P<0.001). 结论 BIRC5参与了鼻咽癌发病过程,其表达上调可能促进鼻咽癌的发病,但是否与转移、预后及复发等临床参数相关还有待进一步研究.
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家蝇Attacin基因在家蝇三龄幼虫中的时间表达模式研究
目的 探讨家蝇Attacin mRNA在幼虫各个时期的表达,为进一步研究家蝇的免疫防御打下基础.方法 对家蝇三龄幼虫进行诱导,分别取诱导前0 h和诱导后2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、36 h、48 h的家蝇mRNA,进行RT-PCR,分析attacin基因在家蝇体内的时间表达模式.结果 家蝇三龄幼虫体内的attacin基因在诱导前后均有表达,诱导后表达增强16 h达到相对高水平,维持约24 h,而后开始下降.结论 Attacin基因在家蝇三龄幼虫中是组成性表达,对进一步了解其在家蝇免疫系统,丰富对昆虫天然免疫的认识具有积极作用.
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TLR4/MyD88信号通路在树突状细胞-肾癌786-0细胞株融合瘤苗中的作用
目的 探讨TOLL样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信号通路在树突状细胞(dentric cell,DC)-肾癌786-0细胞融合瘤苗中的变化及作用.方法 用正常人外周血诱导不成熟的树突状细胞(immature dentric cell,imDC),利用聚乙二醇法(PEG)制成imDC-肾癌-786-0细胞融合瘤苗；用透射电镜观察imDC融合前后变化情况；RT-PCR检测单纯imDC组,肾癌786-0细胞组,imDC-肾癌-786-0融合瘤苗组在6、12、24、48 h中TLR4及MyD88 mRNA变化情况；用激光共聚焦检测imDC中核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)在融合前后转位情况；流式细胞仪检测imDC在融合前后CD86、HLA-DR变化；噻唑盐(MTT)法检测各组体外刺激T淋巴细胞的增殖能力及刺激的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的杀瘤活性.结果 透射电镜显示融合细胞中imDC转变为mDC;TLR4及MyD88 mRNA在肾癌中不表达,在单纯imDC中呈低表达(TLR4/β-actin灰度比值0.40±0.03,MyD88/GAPDH灰度比值0.33±0.03),在融合瘤苗组中6h表达强(TLR4/β-a1ctin灰度比值0.73±0.18,MyD88/GAPDH灰度比值为0.45±0.18),明显强于各组(P＜0.05),此后在融合细胞中逐渐减弱,48 h基本不表达；激光共聚焦显示NF-κB在融合前位于imDC细胞质,融合后转移至细胞核；流式细胞仪提示融合瘤苗HLA-DR、CD86表达分别为81%、80%,明显高于imDC组(63%、59%)及肾癌细胞组(P ＜0.05)；MTT法示融合疫苗在体外刺激T淋巴细胞增殖能力[D(570)值(1.95±0.22)]强于imDC组(1.31±0.35)及肾癌786-0组(1.28±0.33) (P＜0.05),并且其诱导产生的CTLs对自体肾癌细胞具有显著的杀伤活性.结论TLR4/MyD88-NF-κB信号通路在imDC与肾癌786-0细胞融合过程中促使树突状细胞成熟发挥了非常重要的作用,并且此信号通路能促使树突状细胞功能发生转变.
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阿拉瑞林对GnRH受体阳性肝癌细胞Fas/FasL基因表达的影响
目的探讨Fas/Fasl系统在LHRH类似物抑制肝癌细胞增殖过程中的作用.方法用免疫组织化学方法检测SMMC7721肝癌细胞中GnRH受体的表达;用半定量RT-PCR方法(QRT-PCR)观察LHRH类似物对SMMC7721肝癌细胞中Fas/FasL系统mRNA表达的变化.结果 SMMC7721肝癌细胞呈GnRH及其受体免疫反应阳性.PCR反应产物均与预期长度相符合.Fas/FasL-mRNA水平随LHRH类似物浓度增加而增大,经方差分析各组间有显著性差异(Fas,F=16.518 FasL,F=111.583, P<0.01).结论 SMMC7721肝癌细胞具有自分泌GnRH的功能;Fas/FasL系统可能参与了LHRH类似物对肝癌细胞增殖的抑制作用.
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大劣按蚊AdS7基因的克隆及分析
目的克隆AdS7基因cDNA序列,为大劣按蚊基因定量研究提供内参照.方法采用RT-PCR扩增、TA克隆技术获得AdS7 cDNA部分序列,标记地高辛AdS7探针,从大劣按蚊cDNA文库中筛选得到AdS7全长克隆,以半定量RT-PCR方法研究血餐和约氏疟原虫感染对其表达水平的影响.结果从大劣按蚊cDNA克隆得到长464 bp的AdS7基因cDNA部分序列,从大劣按蚊cDNA文库筛选获得了长871 bp的AdS7基因全长克隆,大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫后24 h,AdS7表达水平没有显著变化.结论 AdS7基因可作为大劣按蚊基因定量研究的内参照.
