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温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L表达的影响
目的 观察温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤的小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L (Cathepsin L,CatL)表达的影响.方法 体外培养小鼠永生系足细胞,将其分为正常对照组、模型组、地塞米松组、10％温阳活血利水方血清组(简称10％中药血清组)、20％中药血清组及中药血清空白对照组.正常对照组以培养液孵育足细胞24 h,模型组应用嘌呤霉素45 mg/L作用于足细胞24 h;在模型组干预基础上,地塞米松组加用地塞米松1 μmol/L共孵育24 h;10％及20％中药血清组分别加用10％及20％的中药血清共孵育24 h,并设中药血清空白对照组(单用中药血清孵育24 h).采用细胞免疫荧光染色观察各组足细胞CatL 及其底物Synaptopodin荧光表达改变;异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔毒环肽(phalloidin)染色标记足细胞纤维肌动蛋白(F-actin),并采用F-actin外周环评分(cortical F-actin score,CFS)半定量分析足细胞F-actin 分布.结果 与正常对照组比较,模型组足细胞Synaptopodin表达水平明显降低,CatL表达水平升高,Factin排列紊乱,逐渐向细胞外周分布形成F-actin环,CFS评分明显升高(P＜0.01).与模型组比较,地塞米松组、10％、20％中药血清组足细胞Synaptopodin蛋白表达升高,CatL表达水平降低,CFS评分亦降低(P ＜0.05,P＜0.01).与地塞米松组比较,10％中药血清组Synaptopodin表达降低(P＜0.05),20％中药血清组CFS评分明显降低(P＜0.05).结论 温阳活血利水方能上调嘌呤霉素损伤的足细胞Synaptopodin表达,下调CatL表达水平,减少骨架蛋白F-actin的重构,有助于稳定足细胞actin骨架,改善足细胞融合.
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温阳活血利水方含药血清对足细胞组织蛋白酶L、发动蛋白以及微丝、微管的影响
目的 探讨温阳活血利水方治疗原发性肾病综合征蛋白尿的可能作用机制.方法 将足细胞分为正常对照组、模型组、地塞米松组、10％中药血清组、20％中药血清组、空白对照组.除正常对照组、空白对照组外,其余各组用氨基核苷嘌呤霉素粉剂制备足细胞损伤模型.正常对照组和模型组加入完全培养基5 ml,地塞米松组加入392 μg/L地塞米松5ml,10％中药血清组、20％中药血清组、空白对照组分别加入10％中药血清、20％中药血清、空白对照血清各5ml.RT-PCR法与Western blot分别检测各组足细胞胞浆组织蛋白酶L (CatL)、发动蛋白mRNA和蛋白表达含量,并用激光共聚焦观察各组中足细胞骨架微丝、微管的形态结构变化.结果 与正常组比较,模型组CatL mRNA与蛋白含量升高,发动蛋白表达含量降低(P＜0.01);与模型组比较,各中药血清组与地塞米松组CatL mRNA与蛋白表达含量降低,足细胞发动蛋白蛋白表达含量升高(P＜0.01);与10％中药血清组比较,20％中药血清组CatL mRNA与蛋白表达含量降低,发动蛋白表达含量升高(P＜0.01).各组间足细胞发动蛋白mRNA表达含量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 温阳活血利水方可能通过下调足细胞CatL的表达,减少CatL对发动蛋白的酶解,从而稳定细胞骨架中的微丝、微管等结构,减少足突融合,改善蛋白尿.
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组织蛋白酶L/G 对创伤性深静脉血栓模型大鼠静脉壁的影响
背景:目前,深静脉血栓的分子病因学机制及其形成的核心调控网络仍未完全阐明,对于深静脉血栓的早期诊断预测也无理想的方法.目的:研究组织蛋白酶L/G 与创伤性深静脉血栓的预测.方法:采用蚊式钳夹闭50 只SD 大鼠双侧股静脉的3 个不同部位3 s 随后予以模具制动制备大鼠创伤性深静脉血栓模型,根据股静脉血栓形成的不同阶段和生物学特征,将模型大鼠分为血栓形成前组、血栓形成组和无血栓形成组,另取10 只正常大鼠作为对照组.在相应时间点取大鼠创伤静脉,提取总RNA,经过基因芯片技术筛选差异表达基因,并进一步应用real-time PCR 进行验证.结果与结论:基因芯片杂交结果发现组织蛋白酶L/G 基因在各组间差异表达明显,其中血栓形成组高,无血栓形成组和血栓形成前组次之,均明显高于对照组(P < 0.05);real-time PCR 分析结果与基因芯片杂交分析结果相一致.说明局部静脉血管壁中组织蛋白酶L/G 表达水平升高与创伤性深静脉血栓形成有关,可作为深静脉血栓形成早期诊断、预测的候选分子标志.
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Egr-1对Cathepsin L的调控在鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡中的作用
目的:研究Egr-1对Cathepsin L的调控在鱼藤酮(Rotenone)诱导的多巴胺能神经元PC12凋亡的作用,初步探讨Egr-1与CathepsinL的关系及机制.方法:常规培养PC12细胞,分别取1μM,2μM的Rotenone处理,用倒置显微镜观察细胞的形态变化;确定敏感性强的浓度后再在不同的时间点下用Western blotting检测Egr-1、CathepsinL蛋白表达情况;采用Egr-l siRNA转染PC12细胞,空载体siVector转染PC12细胞,Hoechst染色法检测细胞凋亡,Western blotting检测各处理组中Egr-1、Cathepsin L蛋白的表达情况.结果:Western blotting结果显示,经Rotenone刺激过的PC12细胞在2μM的浓度下敏感,其Egr-1和CathepsinL蛋白的表达量显著增加,且Egr-1在15 min就有明显的增加,而Cathepsin L在30 min才明显增加,说明Egr-1的确是出现在Cathepsin L蛋白的上游;Egr-lsiRNA转染的PC12细胞的Cathepsin L表达量明显低于于空载体转染PC12细胞.结论:多巴胺能神经元PC12在Rotenone刺激下,细胞内Cathepsin L的表达与细胞内Egr-1蛋白水平有关,并且在抑制Egr-1的表达后,细胞内CathepsinL的表达也相应的降低.所以我们得出Egr-1对CathepsinL可能有调控作用,从而来调控多巴胺能神经元的凋亡.
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溶酶体组织蛋白酶L对凋亡与自噬的调控
对神经细胞死亡方式的研究，以线粒体介导的凋亡研究较为清楚。近年来大量的研究显示，溶酶体也参与了神经元死亡方式的调控，其中以组织蛋白酶B、D介导细胞凋亡的研究较多，但对溶酶体组织蛋白酶L（Cathepsin L ，CTSL）参与凋亡及自噬的机制尚不十分明确。现就溶酶体CTSL对凋亡与自噬的调控作一综述。
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组织蛋白酶L及其抑制剂Cystatin C在曲张大隐静脉平滑肌细胞中的表达
目的:组织蛋白酶L(Cat L)及其抑制剂Cystatin C在曲张大隐静脉平滑肌细胞(SMC)中的表达.方法:术中收集曲张及正常大隐静脉标本,采用免疫组织化学、荧光免疫组织化学染色方法及计算机图像分析技术观察检测.结果:免疫组化染色可见Cat L、Cystatin C分别在曲张、正常大隐静脉中免疫反应阳性,阳性细胞主要位于SMC胞质;曲张组SMC中Cat L阳性细胞平均光密度值明显增高,Cystatin C明显降低,与正常组间差异显著;荧光免疫组织化学染色可见Cat L与曲张大隐静脉SMC共定位,Cystatin C与正常大隐静脉SMC共定位.结论:在曲张大隐静脉的SMC中Cat L表达增强,Cystatin C表达下降.这一改变可能作为大隐静脉曲张的生物学标志.
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扩张型心肌病心肌组织中组织蛋白酶L与心功能的关系
目的:探讨溶酶体组织蛋白酶L(cathepsin L)与扩张型心肌病发病的关系.方法:收集因终末期扩张型心肌病行心脏移植术的受体标本20例为心肌病组及脑死亡3h内排除心脏疾患的心脏标本5例为正常对照组,通过免疫组化及RT-PCR等方法半定量分析心肌组织中cathepsin L蛋白阳性颗粒及mRNA表达水平,并对cathepsin L mRNA表达水平的动态变化与心功能(EF值)的相关性进行分析.结果:心肌病组心肌组织中cathepsinL蛋白阳性颗粒及mRNA表达水平均明显高于对照组,均有极显著差异(P＜0.01);心肌组织cathepsin L mRNA表达水平的变化与EF值的变化呈显著负相关(r=-0.544,P＜0.05).结论:cathepsin L参与了扩张型心肌病的发生发展.
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肝片形吸虫重组组织蛋白酶L的免疫反应性和免疫原性分析
目的 分析肝片形吸虫(Fasciola hepatica)重组组织蛋白酶L(CatL)的免疫反应性,以及对SD大鼠的免疫原性. 方法 诱导含重组原核表达质粒pET30a-FhCatL的大肠埃希菌BL21 (DE3)宿主菌表达,SDS-PAGE分析表达产物,以感染肝片形吸虫山羊血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性.20只SD大鼠随机均分为重组蛋白免疫组和佐剂对照组,免疫组大鼠皮下注射纯化的重组FhCatL,200μg/(只·次),共免疫3次,每次间隔3周;对照组用等量PBS与佐剂混合后注射.于第2次和末次免疫前,以及末次免疫后3、6和9周尾静脉采血,分离血清.利用间接ELISA法检测免疫大鼠血清IgG抗体水平,噻唑蓝比色法(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖情况.结果 经纯化获得重组FhCatL蛋白,相对分子质量(Mr)约42 000.Western blotting分析结果表明,纯化重组蛋白能被感染肝片形吸虫的山羊血清识别.重组FhCatL蛋白免疫SD大鼠后可诱导产生特异性IgG抗体,随着免疫时间的延长抗体水平逐渐升高,于末次免疫后3周抗体效价达到峰值(1∶102400),明显高于对照组(1∶1 000).免疫组脾淋巴细胞刺激指数为2.176±0.047,显著高于对照组(1.171±0.032)(P＜0.05). 结论 重组FhCatL蛋白具有较好的免疫反应性和免疫原性.
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日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的编码区全序列分析及克隆
目的分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因编码区的完整序列,并定向克隆到真核表达质粒pcD-NA3中.方法从日本血吸虫成虫提取总RNA,进行反向巢式RT-PCR,T载体克隆后测序.PCR扩增SjCL1基因的编码区序列,并将扩增产物克隆到pcDNA3质粒的BamHI和XhoI位点上.结果通过反向巢式RT-PCR扩增出332bp SjCL1基因5′端序列,测序后与报道的SjCL1基因部分序列拼接,可得到一个编码317个氨基酸的完整编码区序列.PCR特异性扩增出SjCL1编码区基因序列,其大小约为1kb.经酶切、PCR鉴定和测序表明所构建的质粒pcDNA-SjCL1中含有所扩增的基因序列.结论构建了含SjCL1基因的编码区序列的真核表达质粒pcDNA-SjCL1.
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黄芪甲甙对病毒性心肌炎小鼠心肌组织蛋白酶L表达的作用
目的探讨黄芪活性成分黄芪甲甙对病毒性心肌炎(VMC)小鼠心肌中组织蛋白酶L(cathepsin L,CL)表达的作用.方法BALB/C小鼠100只,随机分成6组.非感染小鼠腹腔无菌注射病毒培养液,分为正常对照组(A组10只,以羧甲基纤维素钠0.1 ml灌胃7 d)、9%黄芪甲甙对照组(B组10只,9%黄芪甲甙0.1 m1灌胃7d);余80只小鼠以柯萨奇病毒(CVB3)腹腔无菌注射制作VMC模型,VMC小鼠随机分为心肌炎对照组和1%、3%、9%黄芪甲甙干预心肌炎组,分别以羧甲基纤维素钠及1%、3%、9%黄芪甲甙0.1 ml灌胃7 d(分别为C、D、E、F组,每组20只).14 d后处死全部小鼠并取其心脏.采用RT-PCR和免疫组化半定量检测心肌CL mRNA及蛋白表达水平.结果F组小鼠较C组死亡率明显降低[10%(2/20例)vs 45%(9/20例),x2=6.14,P＜0.05],B组无小鼠死亡;与C组相比,CLmRNA、蛋白表达水平以及心肌病变积分在F组均显著下降,而1%、3%黄芪甲甙对心肌炎小鼠CL mRNA、蛋白表达及心肌病变积分无明显影响.结论黄芪甲甙可能通过抑制cathepsin L表达,对BALB/C小鼠CVB3心肌炎具有良好的治疗作用.
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溶酶体组织蛋白酶 L在小鼠病毒性心肌炎心肌组织中表达及意义
目的观察 Balb/c小鼠病毒性心肌炎心肌组织组织蛋白酶 L( cathepsin L)的表达及意义.方 法 CVB3m( Nancy株)病毒感染 Balb/c小鼠建立病毒性心肌炎实验模型,采用免疫组化和 RT- PCR技术,检测小鼠心肌组织中不同时点(正常和感染后第 3、 7、 15、 30 天) cathepsin L 的表达.结果免疫组化与 RT- PCR结果显示,感染 CVB3m后小鼠心肌组织中 cathepsin L的表达随感染时间的延长,呈上升趋势,至 30 d表达高,各时点 cathepsin L的表达水平与正常小鼠比较差异有显著性( P<0.05).结论 cathepsin L在 Balb/c小鼠 CVB3病毒性心肌炎的发生发展起一定作用.
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2型糖尿病相关基因的研究进展
随着分子生物新技术新方法的不断发展,近年来,人们发现了一些与2型糖尿病发病有关的基因,如:组织蛋白酶L基因(Cathepsin L 基因),胰岛素能上调该基因的表达,从而降低血糖,所以该基因可能是参与血糖调节的中间环节.CAPN10基因,该基因存在很多多态性位点,如:该基因SNP-43、SNP-19、SNP-64等,都与糖尿病发病有一定关联.青少年起病的成人型糖尿病(MODY)是2型糖尿病的一种,其特点是早期发病(通常25岁以下),伴有胰岛素分泌功能障碍.肝细胞核因子4α(HNF-4α)、葡萄糖激酶(GCK)、肝细胞因子1α(HNF-1α)、胰岛素启动因子(IPF-1)、肝细胞因子1β(HNF-1β)和神经元分化因子/β细胞E框反式激活物2(NeuroD1/BETA2)是分别引起6种MODY的因素.这些基因的突变可导致代谢功能障碍,从而引发对β细胞的毒性作用,还可以引起胰腺发育不良.还有一些细胞因子基因,如:IL-6基因,该基因的启动子的多态性也与2型糖尿病发病有很大关联.
关键词： 2型糖尿病 组织蛋白酶L CAPN10 青少年起病的成人型糖尿病 细胞因子 -
血浆组织蛋白酶L与伴脑动脉狭窄的急性缺血性卒中患者侧支循环的相关性
目的 探讨伴有脑动脉狭窄的急性缺血性卒中患者血浆组织蛋白酶L(cathepsinL,CatL)水平与脑侧支循环建立的相关性.方法 纳入全脑血管造影检查确诊至少有1条颅内外大动脉(包括颈内动脉、大脑中动脉、椎动脉、基底动脉)狭窄＞70％的急性缺血性卒中患者,应用ASITN/SIR血流分级系统评价脑侧支循环建立情况,0～2级定义为侧支不良,3～4级定义为侧支良好.应用酶联免疫吸附法检测血浆CatL水平.结果 研究共纳入79例伴有脑动脉狭窄的急性缺血性卒中患者,男性63例,女性16例,平均年龄(58.76±12.24)岁;侧支不良组51例(64.56％),侧支良好组28例(35.44％).侧支良好组血浆CatL水平与侧支不良组无显著性差异[(7.09±2.27) mg/L对(8.79 ±3.53) mg/L;t =2.751,P=0.069].多变量logistic回归分析发现,只有美国国立卫生研究院卒中量表评分高为侧支循环不良的独立危险因素(优势比0.935,95％可信区间0.823～0.963;P =0.046),而血浆CatL水平与侧支循环状况无显著独立相关性(优势比0.910,95％可信区间0.766～1.081;P=0.285).结论 伴有脑动脉狭窄的急性缺血性卒中患者血浆CatL水平与脑侧支循环的建立无显著相关性.
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脂溢性角化病皮损组织蛋白酶L2表达及活性对黑素小体降解的影响
目的 检测脂溢性角化病(SK)皮损中组织蛋白酶L2(CTSL2)表达及活性,观察SK皮损中黑素小体超微结构的变化,研究CTSL2对黑素小体降解的影响.方法 2016年1-8月招募武汉大学人民医院皮肤科门诊SK患者20例,取患者皮损和周围正常皮肤组织,其中15例用HE染色、Fontana-Masson嗜银染色观察黑素颗粒分布,透射电镜(TEM)观察黑素小体超微结构变化,Ki67免疫组化染色检测细胞增殖状态.5例用RT-PCR和荧光底物裂解法分别检测CTSL2 mRNA表达水平及酶活性;用蔗糖梯度离心法从废弃人眼球视网膜色素上皮组织分离纯化黑素小体,并与SK皮损表皮裂解物共孵育,TEM观察孵育后黑素小体膜结构的变化.两组间均数比较采用配对t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 SK皮损中可见大量黑素颗粒沉积,而正常皮肤仅在基底层见线形黑素颗粒沉积.TEM观察显示,SK皮损中黑素小体破损率为24.33％±3.06％,正常皮肤为49.00％±4.00％,两组比较,t=8.49,P＜0.05.RT-PCR显示,5例SK皮损中CTSL2 mRNA相对表达水平为0.35±0.09,正常皮肤组织为0.43±0.08,两组比较,t=3.17,P＜0.05.SK皮损中CTSL2酶活性(17.46±0.45)也低于正常皮肤组织(28.78±0.58),t=34.29,P＜0.05.TEM还观察到,SK皮损裂解物处理的黑素小体破损率为32.33％±4.93％,低于正常皮肤43.00％±2.65％,两组比较,t=3.30,P＜0.05.结论 SK皮损中CTSL2表达水平减低影响角质形成细胞对黑素小体的降解,是否直接参与SK皮损的病理发生有待进一步证实.
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组织蛋白酶B、L在非小细胞肺癌中的表达及意义
目的 探讨组织蛋白酶B、L在非小细胞肺癌中的表达及意义.方法 收集44例非小细胞肺癌标本,石蜡包埋切片,通过免疫组化的方法检测组织蛋白酶B、L的表达.结果 组织蛋白酶B、L随着肿瘤分期的进展其表达阳性率明显升高,Ⅲ期～Ⅳ期的病人组织蛋白酶B、L的表达与Ⅰ期～Ⅱ期的病人有显著差异(P<0.05).组织蛋白酶B和L的表达高度相似.结论 组织蛋白酶B、L的表达与非小细胞肺癌的进展和预后有关.
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组织蛋白酶L反义基因转染对高转移人骨肉瘤细胞生物学行为的影响
目的 构建人组织蛋白酶L(CATL)基因的正、反义真核表达载体.观察反义CATL核酸转染后对高转移人骨肉瘤细胞体内、外侵袭特性的抑制效应.方法 采用RT-PCR的方法,从人骨肉瘤组织中扩增出1001 bp的CATL全长cDNA片段,以BamHⅠ及XbaⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA 3.0中.对重组质粒进行限制性内切酶酶切分析及DNA序列测定.应用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒导入高转移人骨肉瘤细胞中,观察转染后细胞的生长、体外侵袭能力及裸鼠体内成瘤及自发转移能力等指标的变化.结果 正、反义真核表达载体成功构建并转染入高转移人骨肉瘤细胞中.基因转染对细胞的体外生长无明显影响.反义载体转染后细胞的体外侵袭能力和裸鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制.结论 反义CATL基因可显著抑制骨肉瘤细胞的体内、外侵袭力.
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阳离子脂质体介导日本血吸虫组织蛋白酶L1基因的真核表达
目的 真核表达日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)以研究其生物学功能.方法 采用阳离子脂质体复合质粒SjCL1/ AD1-1 DNA并转染HeLa细胞,通过RT-PCR检测SjCL1基因在HeLa细胞中的转录,SDS-PAGE电泳法分析目的 基因的蛋白表达产物,并进一步通过Western Blot法证实.结果 RT-PCR检测到转染的细胞中有与目的 基因相符大小约1000bp转录条带,SDS-PAGE电泳发现表达质粒SjCL1/AD1-1DNA转染的细胞上清液中存在大小约为31kDa的表达蛋白带,Western Blot法证实该表达蛋白产物可和日本血吸虫兔血清发生特异的反应.结论 阳离子脂质体将SjCL1/ AD1-1转染入HeLa细胞后可特异地表达一个大小约为31kDa的可分泌的日本血吸虫蛋白产物.
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日本血吸虫(中国大陆株)Cathepsin L基因的克隆、表达及其免疫保护功能的研究
目的 开展日本血吸虫组织蛋白酶L(SjCL)功能研究,为研发血吸虫病抗病疫苗提供基础.方法 应用RTPCR技术分离、克隆日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L保守功能域编码基因,并在大肠杆菌系统中表达,应用免疫亲和层析法纯化组织蛋白酶L重组抗原,用该基因纯化重组表达产物进行小鼠免疫保护实验.结果 获得了672 bp的血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA序列,成功构建了原核表达载体pET28a(+)-SjCL,并在大肠杆菌中进行了表达,经免疫亲和层析获得了高纯度的SjCL融合蛋白,以该纯化物免疫小鼠,结果实验组减虫率为36.04%,肝组织减卵率为34%,粪卵减少率达49%,与对照组进行方差分析,差异均显著.结论 获得日本血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA克隆,其原核表达产物免疫小鼠对抗血吸虫感染具有-定的保护性.
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巢式RT-PCR分析日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)的基因5'末端序列
目的测定日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因的5'端序列.方法从日本血吸虫成虫中提取总RNA,以该RNA为模板,进行巢式RT-PCR,扩增SjCL1基因5'端序列.将其与pMD18-T载体连接得到含SjCL1基因5'端序列的重组质粒,并测定上述DNA插入片段的序列.结果通过巢式RT-PCR扩增出332bp SjCL1基因5'端序列,测序后,与报道的SjCL1基因部分序列拼接后,可得到一个编码317个氨基酸的完整开放阅读框.结论使用巢式RT-PCR技术,扩增得到SjCL1基因的5'端序列.为进一步对其进行功能研究奠定了基础.
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鼻咽癌组织中组织蛋白酶L的表达及意义
目的 探讨鼻咽癌组织中CATL的表达及其临床意义.方法 应用免疫组织化学方法,对45例鼻咽癌和7例正常鼻咽部组织进行CATL检测,并结合临床病理资料进行分析.结果 CATL在鼻咽癌组织中阳性表达率为51.1%,明显高于正常鼻咽部组织(14.3%),恶性程度高及伴有颈部淋巴结转移患者CATL的阳性表达率也较高(70.0%).结论 CATL可作为鼻咽癌恶性表型的标志之一,并可作为鼻咽癌诊断的辅助指标之一.
