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数字PCR技术及其应用进展
数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数.相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广.本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述.
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基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用
数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立.本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7～8.22×104拷贝/μL,检测的检出限为3.77拷贝/反应.微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为e2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度.用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量.因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术.
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基于AMARES和QUEST的31P MRS绝对定量及比较
目的 利用AMARES和QUEST两种不同算法对大脑31P MRS进行绝对定量并比较.方法 与传统的基于奇异值(SVD)分析方法相比,AMARES利用先验知识在时域内对原始数据进行非线性小二乘拟合,使波谱参数的估计更加准确.QUEST是一种基于代谢物基础集的时域半参数化模型函数分析方法,采用模型函数逼近基线,极大地提高了该算法的可靠性.本研究采用水模溶液作为外部校正参考进行绝对定量,比相对定量更能提供有价值的生物医学信息.结果 通过对正常人大脑磷谱的定量结果表明,两种方法均能够得到满意的结果,AMARES比QUEST更接近文献值.结论 AMARES能够准确有效地定量MRS.
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数字PCR在产前诊断中的应用研究
数字PCR是20世纪初发展起来的新型核酸定量技术,可对微量模板进行绝对定量分析,与传统定量PCR相比具有更高的准确性和敏感性.目前数字PCR已广泛应用于临床各个领域.而在产前诊断中,因数字PCR可从高背景母体DNA中识别少量胎儿DNA分子,故其在介入性产前诊断及无创产前基因诊断胎儿非整倍体疾病、单基因病等方面具有重要作用.本文就数字PCR发展、原理及其在产前诊断的应用进行综述.
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实时定量PCR技术研究DNA疫苗在小鼠体内的生物分布
目的:建立并确证实时定量PCR(RT-PCR)定量检测生物基质中质粒DNA的方法,并应用于治疗性核酸疫苗HIV-PV的体内生物分布研究.方法:建立SYBR Green荧光定量PCR绝对定量方法(Q-PCR),考察方法的特异性、灵敏度、精密度、准确度以及生物基质对PCR的抑制效应.小鼠尾静脉注射裸质粒DNA、小鼠尾静脉注射和灌胃2种途径免疫HIV-PV DNA疫苗,考察建立的Q-PCR方法对于不同形式的质粒DNA疫苗以及不同免疫方式的适用性.结果:Q-PCR方法可特异检测目标DNA,定量检测范围为10～107拷贝/100 ng基因组DNA(gDNA),定量下限(LLOQ)为10拷贝/100 ng gDNA.批内和批间精密度分别<11%和8%;由高至低4种浓度(107,104,100,10拷贝/100 ng gDNA)QC样品准确度分别为(1.57±0.02)%,(1.60±0.01)%,(2.20±0.02)%和(2.28±0.02)%.用Q-PCR方法成功得到不同形式DNA疫苗和不同免疫途径(尾静脉注射和灌胃HIV-PV疫苗)下该质粒DNA的生物分布模式.结论:利用RT-PCR技术,建立了符合DNA疫苗生物分布研究要求的定量检测生物基质中质粒DNA的方法学,并成功应用于不同质粒DNA疫苗形式和不同免疫途径下的DNA疫苗的生物分布研究.
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磁共振波谱定量颅内肿瘤代谢物的方法及技术
氢质子磁共振波谱(1H-MRS)分析是一种检测体内组织、细胞生化代谢水平的无创性方法,它在颅内肿瘤的早期诊断、准确分期中有着重要价值.尤其是当一些因素(如合并有放射治疗后改变等)使常规磁共振成像诊断的准确性降低时,1H-MRS提供的代谢信息能提高对肿瘤残存和复发的诊断准确性,有待逐渐成为颅内占位性病变常规检查的一部分.该文对1H-MRS定量颅内肿瘤代谢物的方法及技术予以综述.
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多体素1H磁共振频谱绝对定量脑内代谢物的方法
磁共振频谱(MRS)是一种利用磁共振原理和化学位移作用对一系列特定原子核及其化合物进行分析的方法.目前MRS的应用以1H谱为广泛,其频谱技术已由单体素发展为三维多体素(3DCSI)扫描,为临床研究提供了许多重要的信息.就应用多体素磁共振频谱技术定量检测脑代谢物绝对浓度的方法进行综述.
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应用1H-MRS和LCModel研究鼻喷酒石酸布托啡诺对猪脑代谢物的影响及谷氨酸复合物的绝对定量
目的 通过氢质子磁共振波谱(1H-MRS)技术,研究鼻喷给药途径下中枢性镇痛药物对脑代谢物的影响.探讨鼻腔给药途径下1H-MRS及LCModel的应用价值.方法 本实验选取9头健康2周龄乳猪(3.612±0.371)kg,行单体素PRESS序列扫描,获得鼻喷给药前后脑代谢物的波谱分析数据,用LCModel软件自动、客观地对波谱图进行线性拟合和基线校正.结果 鼻喷酒石酸布托啡诺前1H-MRS测定动物脑谷氨酸复合物(Glx)浓度为(9.276±0.542)mmol/kg,鼻喷给药后Glx浓度为(7.283±0.540)mmol/kg.给药前后Glx浓度差异有统计学意义(t=2.826,P=0.022),而氮-乙酰天门冬氨酸(NAA)、胆碱(Cho)浓度改变无统计学意义,鼻喷给药前后NAA、Cho浓度分别为(6.094±0.384)mmol/kg:(5.530±0.346)mmol/kg(t=1.270,P=0.240)和(1.547±0.114)mmol/kg:(1.255+0.079)mmol/kg(t=1.800,P=0.110).结论 用1H-MRs技术及LCModel软件证明了Glx可能是中枢性止痛剂作用的重要神经递质.
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数字PCR技术概述
数字PCR(digital PCR,dPCR)是一种对核酸分子绝对定量及扩增的新技术.与传统的PCR相比,数字PCR具有更好的结果重现性而且对核酸分子的定量更为精确.该技术通过对核酸模板进行一定的稀释后,将其随机分配到大量的反应单元中进行扩增反应,当反应结束时依次对每个反应单元的阳性信号进行统计从而实现对核酸分子的定量分析.鉴于数字PCR技术具有其独特的优势,故在许多领域中都表现出巨大的潜能与应用前景,包括临床诊断、单细胞基因表达分析、拷贝数变异(copy number variation,CNV)分析等.本文主要对数字PCR的基本原理、分类及其应用等进行简要综述.
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实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究
目的探讨优化实验反应条件,使实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果.方法建立质粒标准品作为外参照;以管家基因GAPDH作为内参照,并对Mg2+、引物与探针比例、Buffer等进行优化.结果优化条件后,RT-PCR反应的扩增效率接近了理论佳值,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致,保证了方法的稳定性和可靠性.结论为了获得可靠、重复性好的实时RT-PCR绝对定量结果,应对实验方法进行优化.
关键词： 实时逆转录-聚合酶链反应 绝对定量 优化 -
荧光实时定量PCR的研究进展
生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定.基因表达差异终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡.定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容.
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STEAM和PRESS序列对磁共振频谱绝对定量的影响
目的:比较PRESS和STEAM序列对大脑中央前回的代谢物绝对定量的差异.方法:8例健康成年人,平均年龄26.1岁.使用PRESS序列及STEAM序列进行定量检测,实验参数为TE=30ms,TR=3000ms.扫描时间每次约30min.结果:PRESS和STEAM序列使用LCModel软件分析得出Cr的浓度存在显著的差异性,并认为实验结果与序列的特征以及受邻近代谢物峰值影响有关,而对NAA、Cho、Glx、MI、NAA/Cr、Cho/Cr、MI/Cr、Glx/Cr没有显著差异.结论:在短TE条件下,STEAM序列对绝对定量的准确性较PRESS序列稍高.在短TE情况下,Cr物质受到邻近物质峰值影响,使基线不平稳.
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数字PCR在肿瘤诊疗中的应用进展
数字PCR是一种新兴的核酸检测技术,具有灵敏度高、可定量分析的特点.基于数字PCR的液态活检,可用于极微量核酸样本及稀有突变位点的检测,尤其适用于肿瘤治疗过程中需多次反复取样的情况,实现动态监测,为肿瘤诊断、复发提供及时的基因信息.
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基于芯片式数字PCR技术的乙型肝炎病毒绝对定量检测方法的建立及应用
目的 建立芯片式数字PCR技术用于乙型肝炎病毒的绝对定量检测,并对此方法的灵敏度、检出限、检测范围开展评估.方法 本研究设计了芯片式数字PCR用于乙型肝炎病毒绝对定量检测的引物探针,并对扩增条件、反应的体系进行了优化,采用阴性对照法和稀释法对检出限、检测范围和检测方法的重复性进行评估.同时与实时荧光定量PCR的结果作了平行比较.结果 芯片式数字PCR检出限为3.94×104 copies/ml,检测范围是3.94×104 copies/ml～2.82 ×107copies/ml,重复性的相对标准偏差(RSD)为2.89％～13.37％.相比较实时荧光定量PCR,对样本的浓度要求苛刻,高稀释倍数与阴性对照均出现阳性.结论 本研究建立了芯片式数字PCR技术用于乙型肝炎病毒的绝对定量方法,不必依赖对照品或标准品,可高度耐受PCR反应抑制剂,为乙型肝炎病毒载量的测定提供了一种新的检测手段.
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Survivin基因mRNA分子信标定量检测方法建立及在肠癌中的应用
目的建立分子信标定量检测Survivin基因mRNA表达的方法,对方法进行评估,并应用于临床.方法设计Survivin基因特异性分子信标探针和引物,以cDNA克隆重组质粒为标准品,建立Survivin基因分子信标定量检测方法;用该方法检测结直肠癌样本中Survivin基因mR-NA的表达量,分析mRNA表达量与临床资料之间的关系.结果所建立的分子信标定量检测方法,线性范围为1×103～1×1010拷贝数,批间变异为28.16%,批内变异为13.34%,灵敏度为42个拷贝数,平均回收率为109.83%;肠癌组织、癌旁组织和正常组织以及肠良性病变组织间比较,mR-NA表达量差异有统计学意义(P＜0.05),肠癌样本中mRNA表达量与病理分型和淋巴结转移有关(P＜0.05).结论成功建立Survivin基因分子信标定量检测方法,为基因诊断提供新的定量检测方法.
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荧光定量PCR法用于转染CHO细胞中人凝血因子Ⅶ基因拷贝数检测的研究
目的 采用荧光定量PCR法检测转染后可分泌表达人凝血因子ⅦCHO细胞株CHO-FⅦ中FⅦ基因的拷贝数.方法 提取CHO-FⅦ和CHO-pcDNA3.1(空载体转染得到的细胞株)基因组DNA,分别以含有β-actin基因片段的质粒pMDT-actin和含有FⅦ全长cDNA序列的质粒pcDNA-FⅦ制作标准曲线,以CHO-FⅦ和CHO-pcDNA3.1的DNA为模板进行qPCR反应,计算出模板中细胞总数以及目的基因的拷贝数,得到每个细胞中目的基因的拷贝数,反应均在ABI Stepone Plus荧光定量PCR仪上进行.结果 经检测模板中的细胞数为24 421±7 414,FⅦ基因的拷贝数49 455±3 502,每个细胞含有2个FⅦ基因拷贝,空载体转染得到的细胞株中并没有检测到FⅦ基因的存在.结论 FⅦ基因是以2个拷贝的比例整合到宿主染色体上的.
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急性肝损伤模型鼠血清中microRNAs绝对定量与肝损伤程度的相关性研究
目的 观察四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠急性肝损伤模型和对乙酰氨基酚(APAP)诱导的小鼠急性肝损伤模型血清中microRNAs(miR-122、miR-451、miR-92a、miR-192)的绝对定量随时间的变化情况,并分析血清中microRNAs绝对定量与对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤组织病理评分之间的相关性.方法 建立CCl4(1.5 mL/kg)诱导的大鼠急性肝损伤模型和APAP(160 mg/kg)诱导的小鼠急性肝损伤模型,收集建模过程中各时间点的血清,通过MiRbayTM SV miRNA检测试剂盒对血清中microRNAs的含量进行绝对定量,探究血清中microRNAs的变化情况.同时收集APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型中各时间点的肝损伤组织,进行组织病理染色、组织病理评分;随后对小鼠血清中microRNAs的绝对定量与肝损伤组织病理评分进行相关性分析.结果 在两种急性肝损伤模型中,均发现血清中miR-122和miR-192的绝对定量在肝损伤8h或2h就出现明显的升高,在24 h左右维持在高的水平,72 h逐渐下降至正常水平.miR-92a在CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型中,出现波动性的变化,无明显的变化规律,miR 451则出现了轻微下降的趋势.miR-92a和miR-451在APAP诱导的小鼠肝损伤进展中,均有逐渐下降的趋势,在48 h到达低点,随后开始恢复.相关性分析发现,小鼠血清中miR-122和miR-192的绝对定量与APAP诱导的小鼠肝损伤组织病理评分(DILI-PSS)呈现良好的正相关(分别为r=0.741 3,P＜0.05;r=0.788 3,P＜0.01).结论 血清中microR-122和microR-192的绝对定量在大鼠或小鼠急性肝损伤后24 h左右达峰,72 h降低,并且与APAP诱导的小鼠急性肝损伤组织病理评分具有良好的相关性.
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sysmex XT-1800i全自动血细胞分析仪几例疑难故障分析与排除
日本东亚sysmex公司生产的XT-1800i全自动五分类血细胞分析仪,采用了高精度的SRV旋转阀分血技术和半导体流式细胞分析系统结合核酸荧光染色技术,采用了碳精浮球体积绝对定量和时间监测系统,使该仪器准确度高、精密度好,加之中文操作系统,操作简便.我院自2005年12月使用该款仪器,两年来该仪器一直运行状况良好,但近两个月来连续出现了几起棘手故障,在此就这几起故障的原因分析及排除介绍如下,以期同行借鉴.
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F-820血细胞分析仪废液收集瓶的改制
日本希森美康株式会社生产的F-820血细胞分析仪因该仪器具有的技术优势--如15项检测参数和3个细胞分布直方图,高稀释倍率,碳精浮球绝对定量加时间的双重定量技术,自动浮动界标功能;且为我国卫生部临床检验中心进行室间质评定标仪器;再加之仪器的价格性能比,优质的售后服务,使其在国内占较大的市场分额.我科于1999年购置该仪器,因该仪器所带的废液收集瓶容量小,加之我们工作量较大;每天要开启废液瓶1～2次,给工作带来较多不便,因经常开启,瓶口磨损,密封不紧,在2001年底仪器不能进行标本检测处理;购置新废液瓶需花费一定的资金且要等6～8 d时间,为了不影响日常标本的检测工作,我们与医院设备科维修室同志一道,用20 L龙口瓶代替仪器所带废液瓶,恢复仪器工作可以达到每周倒一次废液的效果,经过3年多的实际应用,现报道如下,供同道参考.
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微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量
目的 运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量.方法 选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释.使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性.结果 人重组质粒FAM (ND4)可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA.结论 微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验.
