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补气类中草药对缺氧性肝细胞生长作用的影响
目的观察补气类中草药对缺氧性肝细胞生长作用的影响,为进一步研究其促细胞生长机制奠定基础.方法用四甲基偶氮唑蓝(MTr)法、活细胞观察法分析细胞生长情况,并进行统计学处理.结果 4种补气药(人参、党参、黄芪、西洋参)对正常肝细胞均有明显促生长作用(P＜0.05),尤以人参效果好.而对于缺氧性肝细胞则西洋参促生长效果好(P＜0.05);人参、党参效果虽优于黄芪,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同补气药对正常肝细胞与缺氧性肝细胞的促生长作用不同:人参对正常肝细胞效果好,西洋参对缺氧性肝细胞效果好.
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中介素对大鼠肾小球内皮细胞缺氧损伤的保护作用
目的：研究中介素（IMD）对大鼠肾小球内皮细胞（rRGEC）缺氧损伤的作用。方法 rRGEC传代培养后，随机分为正常组（N组），缺氧组（H组）及IMD组，根据培养液中IMD的终浓度将缺氧处理组分为10-8 mol/L（IMD1）、10-7 mol/L（IMD2）、10-6 mol/L（IMD3）组。流式细胞仪分析细胞凋亡；检测内皮单层底顶室异硫氰酸荧光素（FITC）-BSA荧光强度，以底顶室荧光强度比值的变化来表示细胞通透性的变化；酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞上清液中4-羟壬烯醛（4-HNE）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）变化；实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测细胞细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达；免疫细胞化学法检测HIF-1α及VEGF蛋白表达并进行半定量分析。结果与N组相比，IMD1、IMD2、IMD3组细胞凋亡率均降低（P＜0．05）；H、IMD1、IMD2、IMD3组细胞通透性均增加（P＜0．05），H组上清中4-HNE、ROS升高，SOD降低（P＜0．05）；IMD2组HIF-1αmRNA相对表达量及蛋白含量增高（P＜0．05），VEGFmRNA相对表达量及蛋白含量增高（P＜0．05）；与H组相比，IMD1、IMD2、IMD3组细胞凋亡率均降低（P＜0．05），细胞通透性降低（P＜0．05），4-HNE、ROS降低，SOD升高（P＜0．05），IMD2组HIF-1αmRNA相对表达量及蛋白含量增高（P＜0．05），VEGF mRNA相对表达量及蛋白含量增高（P＜0．05）。相关分析发现HIF-1αmRNA、VEGF mRNA相对表达量与细胞凋亡率呈较强负相关（r=-0．919、-0．911，P＜0．05）。结论 IMD可减轻肾小球内皮细胞缺氧损伤，保护肾小球内皮细胞，与其上调VEGF与HIF-1α生成有关。
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与白血病骨髓间充质干细胞低氧共培养后K 562细胞凋亡的变化
目的：采用血清饥饿法诱导 K562细胞凋亡，比较 K562细胞与人白血病骨髓间充质干细胞（LMSC）共培养前后，K562细胞凋亡的变化，并比较在常氧和低氧条件下，K562细胞凋亡情况的变化。方法通过在细胞培养体系中加入150μmol/L氯化钴（CoCl2）模拟低氧环境。采用Annexin V/碘化丙啶（PI）荧光标记法检测不同氧条件下，血清饥饿后及与 LMSC共培养后K562细胞的凋亡情况。结果在单独悬浮培养组，10％胎牛血清（FBS）培养条件时，K562细胞凋亡率为（5.00±0.04）％，FBS饥饿培养（无FBS）24 h后，K562细胞凋亡率为（11.40±0.63）％，较10％ FBS培养明显升高（P＜0.05）。常氧条件下与LMSC共培养后，K562细胞凋亡率为（7.43±0.86）％，细胞凋亡率较血清饥饿培养下降（P＜0.05），在150μmol/L CoCl2存在时，细胞凋亡率下降更明显（5.91±0.35）％（P＜0.05）。结论① LMSC能够抑制血清饥饿诱导的 K562细胞凋亡。②在CoCl2模拟的低氧条件下，LMSC抵抗血清饥饿诱导的K562细胞凋亡的能力增强。
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低氧诱导因子-1研究进展
低氧诱导因子-1(HIF-1)是在低氧及模拟低氧条件下细胞产生的一种蛋白转录调控因子,由α和β两种亚基组成,HIF-1α的磷酸化和非磷酸化状态作用不同.HIF-1涉及的信号转导通路复杂,广泛参与哺乳动物细胞低氧诱导性应答,在低氧诱导的基因表达调节中起着关键作用.本文就HIF-1的结构、作用、活性调节及在低氧信号转导中的作用等方面的研究进展作一综述.
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低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖及重金属钴的作用
目的:观察低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞增殖的作用,并分析CoCl2对成肌细胞增殖的影响.方法:实验于2005-05/2006-07在解放军军事医学科学院基础医学研究所神经肌肉发育研究室完成.①低氧CO2温箱(Forma Scientific,美国);CoCl2(北京化工厂).②选取4～5周龄Wistar雄性大鼠5只,脱颈处死无菌切取后腿肌群,剪除脂肪和筋膜,制备单细胞悬液.以连续贴壁法筛选大鼠骨骼肌成肌细胞,接种于96孔板进行单克隆培养.采用成肌细胞特异性标志抗原desmin免疫化学染色,鉴定成肌细胞标志蛋白--结蛋白的表达,弃去desmin阴性的细胞克隆,继续培养desmin阳性的细胞克隆,隔天换液1次,7 d进行酶消化传代,获得大量扩增的细胞,并可冻存复苏,用于实验.③以1×107 L-1接种于20个35 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为5组:常氧对照组、轻度低氧组、中度低氧组、CoCl2组、轻度低氧+CoCl2组,4皿/组.常氧对照组置于体积分数为0.2的O2常规氧气环境中;轻、中度低氧组分别于低氧温箱中维持体积分数为0.1与0.03的O2低氧环境中;CoCl2组向培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2;轻度低氧+CoCl2组向细胞培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2后,放入体积分数为0.1的O2低氧温箱.低氧培养24,48,72 h时,各组取出培养皿进行细胞消化离心,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,血球计数板计数法进行细胞计数.④以1×108 L-1接种于8个60 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为2组:常氧对照组、轻度低氧组,4皿/组.两组干预措施同细胞计数过程.低氧培养48 h时,两组取出培养皿进行细胞消化离心,流式细胞仪检测细胞周期.结果:①骨骼肌成肌细胞的单克隆培养结果:成肌细胞可在体外存活6个月,增殖旺盛期约为3个月,可传代15次以上.单克隆培养2周后,可以由单个细胞长满96孔板中的1个孔,并不断扩增,终可以得到细胞类型专一单克隆化的成肌细胞.②成肌细胞特异性标志抗原desmin鉴定结果:镜下不同视野desmin阳性率达100%,即培养的成肌细胞单克隆纯度达100%.③细胞计数结果:与常氧对照组比较,低氧培养24,48,72 h时轻、中度低氧组均可明显促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖,且轻度低氧组作用尤为明显(t=4.98,P＜0.001);CoCl2组无明显变化,但轻度低氧+CoCl2组细胞数量显著增加(t=4.62,P＜0.001).④细胞周期分布:与常氧对照组比较,低氧48 h时轻度低氧组处于S期的细胞明显增多[(26.67±0.89)%,(65.43±0.23)%,t=2.36,P＜0.01],且增殖指数亦显著上升(33.4%,67.1%,t=2.15,P＜0.01).结论:①轻中度低氧可以促进大鼠骨骼肌成肌细胞的增殖,为体外大量扩增细胞提供了新思路.②CoCl2对骨骼肌成肌细胞没有促增殖作用.
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油茶皂苷C对脐静脉内皮细胞缺氧及复氧损伤时的影响
目的:研究脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧/复氧损伤(A/R)时,单核细胞与内皮细胞黏附及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达并观察油茶皂苷C(SQS-C)对此的影响.方法:内皮细胞A/R前3 h,分别加入终浓度为0.1,1.0和10.0 μmol/LSQS-C,再A/R 5 h,比色法测定内皮细胞与单核细胞的黏附率,RT-PCR法检测内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达.结果:A/R时,单核细胞与内皮细胞的黏附显著增加(P＜0.01);SQS-C能明显降低细胞黏附率,减少内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达(P＜0.05),并呈剂量依赖性.结论:SQS-C能抑制缺氧/复氧损伤的内皮细胞与单核细胞的黏附,减少内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达.
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运动对低氧状态下大鼠骨骼肌中低氧诱导因子表达的影响
目的:观察低氧及低氧复合运动对大鼠腓肠肌中的低氧诱导因子-1α表达的影响,探讨运动在骨骼肌低氧适应中的意义.方法:实验于2003-12在广州体育学院完成,实验动物选择雄性SD 2月龄大鼠80只,按照抽签法随机分为4组,常氧安静组、常氧运动组、低氧安静组、低氧运动组,每组20只.建立大鼠低氧及低氧复合运动模型,低氧安静组、低氧运动组每天置减压帐篷内23 h,并在减压帐篷内进行跑台训练1 h,跑台速度设定为25 m/min.常氧运动组大鼠训练同前两组.低氧安静组不运动,其余条件与低氧运动组一致.所有实验动物分批(每次4只)于实验开始后第3,7,10,14天用30g/L戊巴比妥钠麻醉,迅速完整切除左侧腓肠肌,称重后取1 g肌肉组织制作成肌肉悬浆以备用.运用表面加强激光解析电离化芯片技术检测法测定大鼠腓肠肌中的低氧诱导因子含量的变化.结果:在实验过程中,有3只动物因不能完成实验而被淘汰,77只大鼠数据有效,进入后统计的数据每组为4只.①低氧诱导因子-1α蛋白的分子量Mr为120 167,表明其存在源后修饰.常氧安静组及低氧安静组实验后第3天未检测到低氧诱导因子-1α的表达.常氧运动组表达量低于低氧运动组,差异有显著性[(6.27±1.58),(14.69±1.34),P＜0.001 ].②常氧安静组实验后第7天仍未检测到低氧诱导因子-1α蛋白表达,常氧运动组表达量有一定程度降低,低氧安静组可以检测到表达,低氧运动组表达量增加,低氧运动组与常氧运动组及低氧安静组有明显差异[(20.13±0.85),(4.81±0.69),(2.27±0.61),P＜0.001].③常氧安静组实验后第10天仍未检测到低氧诱导因子-1α蛋白表达,常氧运动组表达量有一定程度降低,低氧安静组可以检测到表达,低氧运动组表达量增加,低氧运动组与正常氧运动组及低氧安静组有明显差异[(26.23±0.84),(3.76±0.63),(3.65±0.73),P＜0.001].④正常氧安静组实验后第14天仍未检测到低氧诱导因子-1α蛋白表达,正常氧运动组表达量有一定程度降低,低氧安静组可以检测到表达,低氧运动组表达量增加,低氧运动组与常氧运动组及低氧安静组有明显差异[(29.54±0.61),(1.29±0.35),(13.47±0.62),P＜0.001].⑤低氧诱导因子的含量与低氧程度、时间以及运动均有交互作用,在本实验设计的低氧条件下,低氧时间越长,同时给予适当的运动训练的大鼠骨骼肌中含量高.结论:低氧条件下适当运动可以通过增加低氧诱导因子的表达诱导相关基因的表达,提高骨骼肌的低氧适应能力,起到保护骨骼肌的作用.
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离体海马脑片CA1区锥体细胞缺氧期间电生理指标变化与N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801干预后的变化
背景:海马CA1区锥体细胞是对缺血缺氧性损伤为敏感的神经元,缺血缺氧后海马CA1区锥体细胞膜电位表现为缺氧早期细胞膜的超极化,随着缺氧时间的延长,细胞膜发生缓慢去极化及快速去极化,引起神经元不可逆性损伤.目的:应用细胞内记录技术,观察N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801对离体海马脑片CA1区锥体细胞缺氧期间电生理指标的变化.设计:观察对比实验.单位:解放军第九七医院,徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,Healthy-Science Center,State University of New York.材料:实验于2002-09/2003-02在美国纽约州立大学医学中心完成.选择成年雄性SD大鼠5只,预吸纯氧3 min后以体积分数为0.02的异氟醚麻醉,快速断头取脑,制备离体海马脑片.方法:大鼠海马脑片随机分为单纯缺氧组和MK801组,每组10个.单纯缺氧组海马脑片给予10 min缺氧;而MK801组的海马脑片在缺氧前10 min及10 min的缺氧期间分别应用100 μmol/L的MK801.所有脑片均给予60 min的复氧.应用细胞内记录技术记录海马CA1区神经元缓慢去极化及快速去极化的时间、快速去极化的幅度.在复氧末,应用细胞内注入电流及经Schaffer通路刺激,观察神经元对刺激的反应.主要观察指标:①两组海马CA1区锥体神经元缓慢去极化速率.②两组海马CA1区神经元的快速去极化时间.③两组海马CA1区神经元的快速去极化幅度.④MK801对海马CA1区神经元功能恢复的影响.结果:①海马CA1区锥体神经元缓慢去极化速率:单纯缺氧组显著高于MK801组[(0.20±0.05)mV/s,(0.08±0.03)mV/s,(P＜0.05)].②海马CA1区神经元的快速去极化时间:MK801组显著高于单纯缺氧组[(537±139)s,(261±26)s,(P＜0.05)].③海马CA1区神经元的快速去极化的幅度:MK801组显著小于单纯缺氧组[(4±13)mV,(53±7)mV,(P＜0.05).④在复氧末期,MK801组的10个神经元中,9个神经元恢复对刺激的反应.结论:N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂MK801可以显著降低缺氧引起的神经元缓慢去极化速率,延缓神经元快速去极化的发生及降低快速去极化的幅度,说明N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂可显著减轻神经元的缺氧性损伤,促进复氧后神经元功能的恢复.
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纳洛酮对缺氧大鼠皮质神经元的保护作用
背景:纳洛酮对脑缺血再灌注损伤细胞的保护作用机制尚不明确.选择体外培养皮质神经元研究纳洛酮疗效可排除多重因素干扰.目的:观察缺氧对体外培养大鼠皮质神经元的影响及纳洛酮的保护机制.设计:重复测量设计.地点和对象:实验地点:军事医学科学院神经生物学研究室.研究对象:体外培养12 d的Wistar大鼠皮质神经元.干预:取体外培养12 d的Wistar大鼠皮质神经元,随机分为正常对照组、缺氧组、纳洛酮组(缺氧前24 h加纳洛酮预处理);缺氧6 h后在常氧下继续培养24 h.主要观察指标:观察各种条件下神经元的存活率和形态学的改变,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量.结果:缺氧后可见神经元胞体肿胀、细胞死亡,LDH渗出量增多[6 h:正常对照组为(78.68±7.34)%,缺氧组为(194.38 ±22.32)%;12 h:正常对照组为(77.98±8.85)%,缺氧组为(331.66±36.12)%],细胞存活率减少[6 h:正常对照组为(91.82±2.89)%,缺氧组为(66.96±4.98)%;12 h:正常对照组为(90.84±2.61)%,缺氧组为(32.02±6.34)%],差异有显著性意义(P＜0.01).经纳洛酮预处理的神经元,缺氧后神经元胞体肿胀、细胞死亡程度轻于缺氧组,LDH渗出[6 h:(159.86±34.03)%;12 h:(256.28±28.29)%]显著低于缺氧组(P＜0.01),而存活率[6 h:(78.08±4.15)%;12 h:(53.68±4.32)%]明显高于缺氧组,差异有显著性意义(P＜0.01).结论:对缺氧诱导的皮质神经元的损伤,纳洛酮具有明显的保护作用.
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低氧状态下缺氧诱导因子信号转导途径对糖酵解的作用
目的:总结并分析缺氧诱导因子代谢途径及对糖酵解酶的调节,探讨长时间大强度的运动或者高原训练的可能机制,以消除大强度运动对机体的伤害.资料来源:应用计算机检索Medline 1993-01/2004-12关于缺氧诱导因子的文章.检索词"Hypoxia-inducible factor 1".同时利用计算机检索中国期刊全文数据库1993-01/2004-12的相关文章,限定文章语言种类为中文,检索词"缺氧诱导因子".资料选择:对资料进行初审,纳入标准:①缺氧诱导因子介绍.②缺氧诱导因子对糖酵解的影响.资料提炼:共收集到符合上述要求的文献23篇,排除8篇重复性研究,15篇符合纳入标准.资料综合:缺氧诱导因子是一个基本的循环转录因子,当哺乳动物细胞在缺氧、促红细胞生成素和血管内皮生长因子或一些蛋白基因转录激活时被表达.它在维持氧稳态时起着非常重要的作用.当前的研究也为缺氧诱导因子在调节一些糖酵解酶的基因编码提供了证据,缺氧诱导因子作为一个重要的信号转导途径,糖酵解酶的基因启动子作为低氧反应元件和缺氧诱导因子结合并受缺氧诱导因子激活.结论:缺氧诱导因子在机体处于低氧状态时对糖酵解的激活起着非常重要的作用.
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低氧暴露对运动性贫血大鼠抗氧化能力的影响
目的:观察低氧暴露对运动性贫血大鼠某些抗氧化酶的影响,探讨低氧条件下抗氧化系统的反应是否有利于改善运动性贫血.方法:实验于2005-07/09在广东省高等学校运动生物化学教学重点实验室完成.选择6周龄健康雄性SD大鼠40只,均为运动性贫血动物模型,大鼠适应环境1周后采用6周递增负荷跑台运动方式建立.按随机数字表法分为1 h低氧暴露组、2 h低氧暴露组和间歇性低氧暴露组、常氧恢复组,每组10只.采用人工常压低氧环境,低氧浓度控制在14.5%左右,按分组每天在常压低氧舱进行1,2 h和间歇性低氧暴露(低氧暴露1 h,中间间歇3 h,再低氧暴露1 h),其余时间在舱外常氧中自由活动,每周6 d,持续3周.常氧恢复组大鼠在常氧中自由活动.3周后测试运动性贫血大鼠血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和血浆过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶活性.结果:纳入动物40只,均进入结果分析.①低氧暴露3周后1 h低氧暴露组、2 h低氧暴露组、间歇性低氧暴露组血清丙二醛含量均显著低于常氧恢复组[分别为(2.62±0.16),(2.60±0.22),(2.55±0.06),(3.36±0.34)μmol/L,P＜0.05].②低氧暴露3周后血清超氧化物歧化酶和血浆谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢酶活性均高于常氧恢复组,2 h低氧暴露组与常氧恢复组比较差异有显著性意义[分别为(4 239.68±169.53),(3 190.30±339.40)μkat/L;(20 622.46±2 002.07),(15 556.44±607.79)μkat/L;(50.01±6.67),(35.17±4.50)μkat/L,P＜0.05].③各低氧暴露组间除2 h低氧暴露组血清超氧化物歧化酶活性显著高于1 h低氧暴露组外[分别为(4 239.68±169.53),(2 126.41±161.20)μkat/L,P＜0.05],其他指标组间差异无显著性意义(P＞0.05).结论:低氧暴露可提高运动性贫血大鼠机体的抗氧化能力,有利于促进运动性贫血的恢复.
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缺氧复氧后小鼠缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子表达的变化
目的:观察缺氧复氧对小鼠肺组织中缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子表达的影响,探讨缺氧与血管新生的关系及复氧的作用.方法:实验于2005-05/06在哈尔滨医科大学附属第二医院动物室进行.实验用雄性昆明小鼠48只,随机分为4组,缺氧3 d组、缺氧6 d组、缺氧复氧组和对照组,每组12只.在3个体积分数为0.1的低氧舱内分别放入缺氧3 d组小鼠、缺氧6 d组小鼠、缺氧复氧组(缺氧3 d复氧3 d)小鼠.对照组小鼠在常温常氧环境下饲养6 d.各组小鼠实验结束后麻醉状态下取材.用免疫组织化学技术检测小鼠在肺组织中的缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达的变化.缺氧诱导因子1α表达的阳性及血管内皮生长因子根据阳性细胞判断标准分为(-)、(+)、(++)、(+++).结果: ①缺氧时间与缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子表达的关系:小鼠肺组织中的缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子在缺氧3 d,6 d时的表达呈现递增趋势,随缺氧时间的延长而表达增强(缺氧诱导因子1α阳性率:缺氧3 d组为67%,缺氧6 d组为75%;血管内皮生长因子阳性率:缺氧3 d和6 d组均为83%).②缺氧与缺氧复氧对缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子的表达的影响:缺氧复氧组与缺氧组比较缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达有显著下降(缺氧诱导因子1α阳性率:缺氧3 d组为67%,缺氧复氧组为58%;血管内皮生长因子阳性率:缺氧3 d组为83%,缺氧复氧组为75%)③缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子的关系:缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子表达呈正相关(r=0.730,P=0.007).结论:缺氧可以上调小鼠肺组织中的血管内皮生长因子,引起血管新生,但它可能是可逆的.
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Na+/H+交换抑制剂HMA抑制低氧刺激的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖
目的:观察低氧培养对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响,以及Na+/H+交换抑制剂HMA对此增殖效应的抑制作用.方法:实验于2004-12/2005-06在第四军医大学病理生理学教研室完成.健康SD大鼠2只,分离培养肺动脉平滑肌细胞,选择3～6代生长良好的细胞在常氧(O2的体积分数为0.21)或低氧(O2的体积分数为0.02)条件下培养,并分别给予0.3,1,3和10 μmol/L等不同浓度的HMA(n=8),采用噻唑蓝比色实验和测定细胞总蛋白含量的方法观察细胞增殖情况,同时光镜观察细胞形态并测定培养液上清乳酸脱氢酶活力以反映药物的非特异性细胞毒作用.结果:实验所用细胞样本均进入结果分析.①体积分数为0.02氧浓度较体积分数为0.05氧浓度下培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞生长曲线抬高,低氧刺激24 h增殖达到高峰.②体积分数为0.05血清培养使此增殖效应更为显著[噻唑蓝光吸收值无血清常氧组(0.238±0.011),无血清低氧组(0.280±0.009),体积分数为0.05血清常氧组(0.313±0.013),体积分数为0.05血清低氧组(0.389±0.011)].③HMA可以抑制增殖,显著降低噻唑蓝吸光度值[对照组(0.391±0.011),0.3 μmol/L组(0.377±0.010),1 μmol/L组(0.328±0.012),3 μmol/L组(0.289±0.006),10μmol/L组(0.246±0.007)].④细胞总蛋白含量也显著降低[对照组、0.3 μmol/L组、1μmol/L组、3 μmol/L组、10μmol/L组分别为(193.30±8.51),(177.63±8.71),(166.84±9.48),(155.72±10.46)和(135.13±10.30)μmol/L].⑤各浓度处理组细胞形态无改变,培养液上清乳酸脱氢酶活力也无明显变化[对照组、0.3 μmol/L组、1 μmol/L组、3 μmol/L组、10 μmol/L组分别为(212.23±8.44),(208.80±6.37),(209.79±7.12),(208.77±7.33),(215.42±7.81)U/L],细胞无明显损伤.结论:0.3～10μmol/L浓度的Na+/H+交换抑制剂HMA可以有效抑制低氧刺激的大鼠肺动脉平滑肌增殖,此作用不是非特异的细胞毒作用所致.
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低氧诱导小鼠胎肝间质细胞表达红细胞生成素
目的:观察低氧培养条件下小鼠胎肝间质细胞中红细胞生成素的表达.方法:实验于2004-10/2005-01在暨南大学医学院血液病研究所完成.取孕14.5 d小鼠胚胎肝细胞进行贴壁培养及传代,生长至次融合状态的第5代细胞在体积分数为0.95的N2和体积分数为0.05的CO2混合气条件下培养,分为培养0(对照组),2,4,8,16,32 h组,在相应时间下应用半定量反转录-聚合酶链反应和Western blot技术检测其红细胞生成素基因表达.结果:①在常氧压下培养的胎肝间质细胞中,红细胞生成素mRNA及其蛋白水平均较低.②低氧培养则可显著提高胎肝间质细胞红细胞生成素基因的mRNA及其蛋白水平.红细胞生成素mRNA在低氧培养4 h时即显著增高,8 h时达到高峰水平,聚合酶链反应产物红细胞生成素与β-actin信号比从对照组(4.92±2.31)%增加到(26.69±7.94)%,差异有显著性意义(P＜0.01).红细胞生成素蛋白在低氧培养4 h时显著增高,16 h时达到高峰水平,Western检测红细胞生成素与β-actin信号从对照组(3.57±2.34)%增加到(19.81±6.56)%,差异有显著性意义(P＜0.01).结论:低氧预处理可诱导胎肝间质细胞表达红细胞生成素,提示低氧预处理小鼠胎肝间质细胞在组织缺血损伤中的潜在治疗作用,如治疗脑缺血和心肌缺血等疾病.
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党参皂苷L1对抗缺氧缺糖再给氧诱导大鼠星形胶质细胞损伤的作用
目的:观察扶正固本、益气类中药党参皂苷L1对缺氧缺糖再给氧所致大鼠大脑星形胶质细胞损伤是否有保护作用.方法:实验于2004-08/2005-05在北京中医药大学东直门医院中医脑病研究室完成.①选用出生1 d的Wistar大鼠40只,雌雄不拘.②分离大脑星形胶质细胞进行原代培养.加入含连二亚硫酸钠10 mmol/L的无糖Earle液,置37℃体积分数0.05 CO2孵箱中孵育90min进行缺氧缺糖处理.然后吸弃Earle液,加入不含连二亚硫酸钠的无血清DMEM培养液,继续置37℃体积分数0.05 CO2孵箱中孵育90min进行再给氧处理.③将在相同或不同细胞培养板中的不同培养孔中细胞按随机抽签法分为6组(每10孔或8孔细胞为1组):正常对照组(正常细胞培养),模型组(进行缺氧缺糖再给氧处理),尼莫地平组[在无糖Earle液和无血清DMEM培养液加入终浓度0.5 mg/L尼莫地平[购自山东新华制药股份有限公司,生产批号:0211048,10 mL(2 mg)/支],其余处理同模型组],缺氧缺糖再给氧+党参皂苷L1高、中、低浓度组[在无糖Earle液和无血清DMEM培养液分别加入质量浓度1.3,0.13和0.013 mg/L党参皂苷L1(由北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室采用高效液相色谱法制备法分离得到,含量为96.2%),其余处理同模型组].测定乳酸脱氢酶漏出率时缺氧缺糖处理后直接测定,而不做再给氧处理.④四唑盐比色法测定细胞存活率,Hoechst33342和碘化丙啶原位双染法荧光显微镜观察细胞形态学变化和细胞坏死率、细胞凋亡率,比色法测定乳酸脱氢酶漏出率.结果:①荧光显微镜观察细胞形态:尼莫地平组和党参皂苷L1各浓度组与模型组比较均可见红染的坏死细胞数量明显减少,尼莫地平、党参皂苷L1各浓度组与模型组比较凋亡细胞数量无明显变化.②星形胶质细胞存活率:模型组明显低于正常组、尼莫地平组和党参皂甙L1中、低浓度组(F=42.464,P＜0.01).③细胞坏死率和乳酸脱氢酶漏出率:模型组明显高于其他5组(F=69.344,24.994,P＜0.01).④细胞凋亡率:模型组明显高于正常组(F=3.311,P＜0.05),与尼莫地平组和党参皂苷L1各浓度组比较,差异不明显(P＞0.05).结论:中药党参皂苷L1对缺糖缺氧再给氧造成的星形胶质细胞损伤具有保护作用,可抑制细胞坏死,但对凋亡过程无保护作用.
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低氧条件小鼠胎肝间质细胞血管内皮生长因子的表达对侧支和新血管生成的促进作用
目的:观察低氧培养条件下小鼠胎肝间质细胞中血管内皮生长因子的表达情况.方法:实验于2004-08/12在暨南大学医学院血液病研究所完成.取孕14.5 d小鼠胚胎肝细胞进行贴壁培养及传代.生长至次融合状态的第5代细胞分别在体积分数0.95氮气和体积分数0 05二氧化碳混合气和常规条件下培养.在低氧和常氧培养后2,8,16,32 h应用半定量反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹技术检测其血管内皮生长因子基因mRNA和蛋白表达.结果:低氧培养2 h时聚合酶链反应产物血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养[(9.83±3.41)%,(5.47±2.78)%,F=12.33,P＜0.01];低氧培养8 h时血管内皮生长因子mRNA水平达到高峰,为常氧培养的6.17倍;16 h后血管内皮生长因子mRNA表达水平开始下降;32 h时血管内皮生长因子mRNA表达水平进一步下降,血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养组[(18.95±6 23)%,F=22.76,P＜0.01].低氧培养4 h时血管内皮生长因子蛋白已显著增加,血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比明显高于常氧培养组[(8.38±3.24)%,F=10.87,P＜0.01];16 h时达到高峰水平,β-肌动;32 h时血管内皮生长因子水平显著下降,血管内皮生长因子与β-肌动蛋白信号比仍明显高于常氧培养组[(17.27±6 35)%,F=19.38,P＜0.01].结论:低氧可诱导血管内皮生长因子在小鼠胎肝间质细胞中表达,提示低氧预处理间质细胞在组织缺血损伤如心肌缺血等疾病可能产生治疗作用.
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缺血缺氧再灌注不同损伤程度人脐静脉内皮细胞变化与清开灵的干预效应
背景:"毒损脑络"是急性脑血管病的主要病机,以脑微血管损伤为主要表现.目的:建立不同缺氧缺血再灌注时间的细胞模型及施加药物干预,观察清开灵注射液对不同损伤程度人脐静脉内皮细胞ECV304的保护作用.设计:以培养的细胞为观察对象的随机对照实验.单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科.材料:实验于2002-02/04在北京中医药大学附属东直门医院中心实验室完成.实验用人脐静脉内皮细胞ECV304随机分为7组,即正常组、缺氧6 h再灌注12 h对照组、缺氧234h再灌注12 h对照组、缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组、缺氧6 h再灌注12 h中浓度清开灵组.清开灵注射液主要成分为牛胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子总苷等.方法:缺血再灌注模型的制作:①从培养箱中取出培养的细胞,缺氧6 h再灌注12 h对照组、缺氧24 h再灌注12 h对照组分别吸除原培养液,换入无糖Earle's液,细胞放入缺氧槽中37℃缺血缺氧培养.缺氧6 h再灌注12 h对照组培养6 h,缺氧24 h再灌注12 h对照组培养24 h后,分别吸去无糖Earle's液,换入无血清1 640液后置于37℃CO2培养箱中再灌注培养12 h.②缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组分别在缺氧24 h再灌注12 h对照组造模的基础上,向各自培养液中加入质量浓度为5,10,20mg/L的清开灵对细胞进行培养.③缺氧6 h再灌注12 h中浓度清开灵组在缺氧6 h再灌注12 h对照组造模的基础上,向培养液中加入质量浓度为10 mg/L的清开灵.④细胞存活率以四唑盐比色试验测定,乳酸脱氢酶漏出率用乳酸脱氢酶试剂盒测定,细胞凋亡率行碘化吡啶染色后用流式细胞仪检测,Cellquest软件进行分析.主要观察指标:①细胞形态学观察结果.②各组细胞存活率、乳酸脱氢酶漏出率及细胞凋亡率.结果:①细胞形态学观察:正常组细胞密集,贴壁良好,伸展充分,细胞表面光滑,有较多的分裂期细胞,细胞长满底面,呈典型的"铺路石征";缺氧6 h再灌注12 h对照组及缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组细胞形态改变不明显;缺氧24 h再灌注12 h对照组细胞较稀疏,脱壁较多,可见大量肿胀变圆的损伤细胞及破碎细胞的碎片,贴壁细胞皱缩明显,可见伪足,分裂期细胞少;缺氧24h再灌注12 h中浓度清开灵组细胞贴壁良好,表面光滑,未发生皱缩,可见分裂期细胞.②各组ECV304细胞存活率:与缺氧24 h再灌注12 h对照组比较,缺氧24 h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组均显著升高[(42.5±2.8),(72.9±8.0),(80.3±12.7)%,P均＜0.01],而缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组则显著下降至(10.1±0.4)%,P＜0.01.正常组为100%.③各组ECV304细胞乳酸脱氢酶漏出率:与缺氧24 h再灌注12 h对照组比较,缺氧24h再灌注12 h低浓度清开灵组、缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组均显著升高[(6.6±1.4),(2.4±1.4),(2.4±0.5)%,P均＜0.01],而缺氧24 h再灌注12 h高浓度清开灵组则显著升高至(16.1±2.2)%,P＜0.01.正常组为(2.2±1.0)%.④各组ECV304细胞凋亡率:与缺氧6 h再灌注12 h对照组比较,缺氧6 h再灌注12 h中浓度清开灵组明显升高[(2.2±0.5),(1.5±0.4)%,P＜0.05];与正常组比较,缺氧24 h再灌注12 h对照组、缺氧24 h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高[(0.9±0.2),(5.5±2.5),(9.9±4.3)%,P均＜0.01];并且缺氧24 h再灌注12 h中浓度清开灵组比与缺氧24 h再灌注12 h对照组升高更明显(P＜0.01).结论:①清开灵注射液对不同程度缺血再灌注损伤的ECV304细胞均有保护作用,但随着损伤程度的不同而表现为两种相反的保护形式.②对于缺血6 h再灌注12 h此类受损伤较轻的ECV304细胞,主要表现为降低细胞的凋亡率;而对于缺血24 h再灌注12 h此类缺血再灌注损伤较重的ECV304细胞,则增加细胞的凋亡率,使坏死的细胞减少.③与坏死细胞相比,凋亡细胞不发生溶酶体、线粒体及胞膜的破裂,没有内涵物的外泄,故不引起周围细胞的次级损伤,从而提高了细胞存活率,起到保护大多数细胞的作用.
关键词： 细胞 培养的 再灌注 细胞低氧 清开灵注射液/治疗应用 -
缺氧缺血与线粒体DNA损伤
线粒体DNA(mitochondral DNA,mtDNA)是唯一的核外遗传物质,为编码线粒体呼吸链复合物的重要组成部分,在细胞能量代谢中起重要作用.缺氧缺血情况下mtDNA易发生损伤,自由基、一氧化氮产生增多是mtDNA损伤的主要因素.缺氧缺血时mtDNA损伤可致细胞凋亡、线粒体呼吸链复合物活性下降,并且不同的组织mtDNA损伤有不同的表现形式.
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缺氧诱导因子-1与心血管疾病
缺氧诱导因子(HIF)是一种在体内广泛存在的由缺氧、钴、镁、镍等诱导细胞产生的具有转录活性的核蛋白,由α和β亚基组成,两者属碱性螺旋-环-螺旋-PAS家族蛋白.近年研究发现,HIF-1参与心血管发育的调控,与缺血性心脏病、肺动脉高压、先天性心血管疾病等关系密切.进一步探讨HIF-1在机体缺氧、缺血稳态中的作用,对研究缺氧、缺血性心血管疾病的治疗有指导意义.
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荷肝癌小鼠的99Tcm-HL91乏氧显像的实验研究
[目的] 探讨99Tcm-HL91(4,9-二氮-3,3,10,10-四甲基十二烷-2,11-二酮二肟)在荷肝癌H22的高淋巴道转移亚系(Hca-F)瘤细胞的BALB/c小鼠中的显像价值.[方法] 用1110MBq/2mL的99TcmO4淋洗液溶解HL91(1 mg),另用10 mL生理盐水溶解1 mg DTPA后,迅速取出50 μL注入上述HL91瓶中,室温下放置10 min后,标记率＞95%. 13只荷肝癌BALB/c小鼠麻醉后,经尾静脉注射37 MBq 99Tcm-HL91后,2 h 3只、4 h 5只、6 h 5只行SPECT平面显像,利用感兴趣区技术(ROI),分别计算不同时相的靶与非靶T/NT(肿瘤与头部、肿瘤与对侧、肿瘤与腹部)的比值. [结果] 99Tcm-HL91在各时相所有荷瘤小鼠的肿瘤均有摄取.注射后4 h放射性高,随时间推移,6 h略有下降,其放射性下降较其他组织缓慢.HL91在肿瘤乏氧区域高于除腹部外的其他组织.注射后4 h肿瘤/头部、肿瘤/对侧和肿瘤/腹部的比值分别为4.26±2.29、3.40±0.91和0.41±0.19.肿瘤/头部和肿瘤/对侧比值在4、6 h均高于2 h(P＜0.01).随时间推移,T/NT逐渐增高.99Tcm-HL91在肝、肾中滞留多.[结论] 99Tcm-HL91在荷肝癌BALB/c小鼠的肿瘤中摄取良好、清除缓慢.99Tcm-HL91注射后4 h进行显像可以得到较理想的T/NT比值.乏氧显像中T/NT比值是一个非常重要的指标.
