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PI3K/Akt信号通路在异丙酚后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用
目的 评价磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在异丙酚后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 体外培养SD乳鼠心肌细胞,接种于96孔板(细胞密度1×105/ml,200 μl/孔)或6孔板(细胞密度5×105/ml,2 ml/孔)中,采用随机数字表法,将细胞随机分为4组(n=24):常规培养组(C组)细胞常规培养6h；缺氧复氧组(H/R组)细胞行缺氧2h,复氧4h；缺氧复氧+异丙酚组(H/R+P组)于缺氧结束时行异丙酚(终浓度50 μmol/L)后处理；H/R+异丙酚+ PI3K抑制剂组(H/R+ P+W组)于缺氧结束时加入PI3K抑制剂渥曼青霉素(终浓度100nmol/L)和异丙酚(终浓度为50μmol/L).复氧结束时,采用MTT法测定细胞活力,应用生化自动分析仪测定培养液LDH活性；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Western blot法检测心肌细胞磷酸化Akt(p-Akt)、Bcl-2及Bax表达水平.结果 与C组相比,H/R组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,p-Akt和Bax表达上调,Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P＜0.05).与H/R组比较,H/R+P组细胞活力升高,LDH活性和细胞凋亡率降低,p-Akt和Bcl-2表达上调,Bax表达下调,Bcl-2/Bax升高(P＜0.05).与H/R+P组比较,H/R+ P+W组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,p-Akt和Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P＜0.05).结论 异丙酚后处理减轻心肌细胞缺氧复氧损伤的机制与激活PI3K/Akt信号通路有关.
关键词： 1-磷脂酰肌醇3-激酶 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 二异丙酚 细胞低氧 -
异丙酚不同时机给药对大鼠海马缺氧复氧损伤神经元胞浆细胞色素c的影响
目的 评价异丙酚不同时机给药对大鼠海马缺氧复氧损伤神经元胞浆细胞色素c浓度(Cty c)的影响.方法 原代培养大鼠海马神经元,采用随机数字表法,将其随机分为5组(n=5):对照组(C组)、缺氧复氧损伤模型组(M组)和异丙酚不同时机给药组(Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组).采用缺氧6h再复氧的方法制备海马神经元缺氧复氧损伤模型.Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别于缺氧前、复氧即刻和复氧2 h(T0～2)时加入异丙酚至终浓度20 μmol/L.各组分别于T1,2和复氧24 h(T3)时观察细胞凋亡情况,检测胞浆Cytc的浓度.结果 与C组相比,M组T1-3时、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组T1,2时细胞胞浆Cty c浓度升高(P＜0.05)；与M组相比,Ⅰ组T1-3时、Ⅱ组和Ⅲ组T1.2时细胞胞浆Cty c浓度降低(P＜0.05)；与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组T1,2时细胞胞浆Cty c浓度升高(P＜0.05)；与Ⅱ组相比,Ⅲ组T2时细胞胞浆Cty c浓度升高(P＜0.05).不同时机异丙酚给药组细胞凋亡数目较M组明显减少.结论 异丙酚不同时机给药可减少线粒体Cty c释放到胞浆,抑制海马神经元凋亡,减轻缺氧复氧损伤,缺氧前给药效果较好.
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异丙酚预先给药对BV-2细胞缺氧复氧时TLR4表达的影响
目的 评价异丙酚对BV-2细胞缺氧复氧时Toll样受体4(TLR4)表达的影响.方法 小鼠小胶质细胞(BV-2细胞)于6孔培养板中培养4～6 d后随机分为4组(n=4),正常对照组(C组)不给予任何处理;缺氧复氧组(A/R组)缺氧3 h、复氧12 h;缺氧复氧+25μmol/L异丙酚组(P25组)和缺氧复氧+100μmol/L异丙酚组(P100组)于缺氧前30 min加入异丙酚,终浓度分别为25、100μmol/L.于复氧12 h时收集细胞,测定TLR4 mRNA、NF-κB mRNA和TLR4蛋白水平;收集细胞上清液,测定TNF-α水平.结果 与C组比较,A/R组、P25组和P100组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、TLR4蛋白和TNF-α水平均升高(P<0.01);与MR组比较,P25组和P100组TLR4 mRNA、NF-κB mBNA、TLB4蛋白和TNF-α水平均下降(P<0.01);与P25组比较,P100组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、TLR4蛋白和TNF-α水平均降低(P<0.01).结论 异丙酚25、100 μmol/L预先给药可抑制BV-2细胞缺氧复氧时TLR4 mRNA表达上调.
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自噬在低氧预处理BMSC在大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织中存活的作用:离体和在体实验
目的 评价自噬在低氧预处理骨髓间充质干细胞(BMSC)在大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织中存活的作用.方法 离体实验 大鼠原代BMSC,以1×106个/ml密度接种于12孔板(1ml/孔),采用随机数字表法,将其分为6组(n=30):对照组(C组)、常氧培养组(N组)、低氧预处理组(H组)、低氧预处理+腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂复合物C组(HC组)、低氧预处理+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(HM组)和低氧预处理+哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂雷帕霉素组(HR组).低氧预处理前3h时HC组、HM组和HR组分别加入10 mmol/L复合物C、5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤和10 nmol/L雷帕霉素.每组取12个培养孔,测定磷酸化AMPK(p-AMPK)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、微管相关蛋白1轻链3Ⅰ (LC3Ⅰ)和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)表达.每组取18个培养孔,加入500μmmol/L H2O2孵育24 h,检测细胞存活率、凋亡率、caspase-9和caspase-3的活性.在体实验成年雄性SD大鼠,体重300～350 g,3月龄,脊髓缺血再灌注损伤模型制备成功的大鼠192只,采用随机数字表法,将其分为6组(n=32)C组、N组、H组、HC组、HM组和MR组,于再灌注30 min时,于L1-5脊髓节段分别注射离体实验中相应各组处理的1× 106个/ml BMSC悬液.分别于再灌注4、12、24和48 h时进行神经行为学评分,取脊髓组织,测定凋亡BMSC情况.结果 离体实验与N组比较,H组p-AMPK表达上调,p-mTOR表达下调,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ和存活率升高,凋亡率、caspase-9和caspase-3的活性降低(P＜0.05);与H组比较,HC组p-AMPK表达下调,p-mTOR表达上调,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ和存活率降低,凋亡率、caspase-9和caspase-3的活性升高,HM组LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ和存活率降低,凋亡率、caspase-9和caspase-3的活性升高,HR组p-mTOR表达下调,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ和存活率升高,凋亡率、caspase-9和caspase-3的活性降低(P＜0.05).在体实验 与N组比较,H组神经行为学评分升高,脊髓凋亡BMSC计数降低(P＜0.05);与H组比较,HC组和HM组神经行为学评分降低,脊髓凋亡BMSC计数升高,HR组神经行为学评分升高,脊髓凋亡BMSC计数降低(P＜0.05).结论 自噬增强参与了低氧预处理BMSC在大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织中存活,其机制与激活AMPK/mTOR通路有关.
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mAb2G4-ODN-lip对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响
目的 评价抗肌球蛋白单克隆抗体-NF-κB诱骗性寡核苷酸-阳离子脂质体复合物(mAb2G4-ODN-lip)对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 培养H9c2心肌细胞,接种于6孔板(细胞密度1×105/ml,2 ml/孔)中,采用随机数字表法分为3组(n=9):正常对照组(C组)细胞常规培养;单纯缺氧复氧组(H/R组)细胞进行缺氧2h,复氧1 h;mAb2G4-ODN-lip组(MOL组)缺氧前经mAb2G4-ODN-lip(2μg ODN)处理4h,更换普通培养基继续培养8h,余处理同H/R组.复氧结束时,采用甲基噻唑蓝比色法检测细胞增殖抑制率,2,4-二硝基苯肼显色法检测培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸比色法检测细胞丙二醛(MDA)含量,ELISA法检测培养液TNF-α和IL-6的浓度.结果 与C组比较,H/R组和MOL组细胞增殖抑制率、LDH活性、MDA含量、TNF-α和IL-6浓度升高(P＜0.05);与H/R组比较,MOL组细胞增殖抑制率、LDH活性、MDA含量、TNF-α和IL-6浓度降低(P＜0.05).结论 mAb2G4-ODN-lip(2μg ODN)可有效减轻心肌细胞缺氧复氧损伤.
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CXCR4-FAK信号通路在低氧预处理骨髓间充质干细胞向大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织迁移和粘附中的作用
目的 探讨CXC趋化因子受体4-粘着斑激酶(CXCR4-FAK)信号通路在低氧预处理骨髓间充质于细胞(BMSC)向大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织迁移和粘附中的作用.方法 第一部分重组腺病毒介导绿色荧光蛋白基因转染成功的大鼠原代BMSC,以1×106个/ml密度接种于24孔培养板(1 ml/孔),采用随机数字表法,将其分为5组(n=18):对照组(C组)、常氧培养组(N组)、低氧预处理组(H组)、低氧预处理+ CXCR4拮抗剂AMD3100组(HA组)和低氧预处理+FAK抑制剂粘着斑相关非激酶组(HF组).N组BMSC在常氧环境中培养36 h;H组BMSC在低氧环境中培养24h后在常氧环境中继续培养12 h;HA组和HF组于低氧预处理前分别加入5 μg/ml AMD3100和10 μg/ml粘着斑相关非激酶.测定BMSC中基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)、CXCR4和磷酸化FAK(p-FAK)表达、BM-SC向SDF-1α迁移能力和BMSC与纤维粘连蛋白(FN)粘附能力.第二部分 雄性SD大鼠216只,体重300 ～ 350 g,其中210只采用阻断胸主动脉合并体循环低血压的方法制备脊髓缺血再灌注损伤模型.取脊髓缺血再灌注大鼠36只,分别于模型制备前、再灌注12h、1、3、5、7 d(T0-5)时处死6只大鼠,取腰段脊髓组织,检测SDF-1α含量.其余脊髓缺血再灌注大鼠180只,采用随机数字表法,将其分为5组(n=36),于再灌注即刻分别鞘内注射C组DMEM培养液300μl和N组、H组、HA组、HF组1×106个/ml BMSC悬液300μl.分别于T0-5时取6只大鼠,进行神经行为学评分,然后取腰段脊髓组织,测定BMSC聚集度.结果 与C组比较,N组BMSC的SDF-1α、CXCR4、p-FAK表达及其向SDF-1α迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度差异无统计学意义(P＞0.05)；与N组比较,H组BMSC的SDF-1α、CXCR4和p-FAK表达上调,向SDF-1α迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度升高(P＜0.05),HA组和HF组BMSC的p-FAK表达及其向SDF-1α迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度差异无统计学意义(P＞0.05)；与H组比较,HA组和HF组BMSC的p-FAK表达下调,向SDF-1x迁移能力、与FN粘附能力、神经行为学评分和脊髓组织BMSC聚集度降低(P＜0.05).与T0时比较,T2.3时脊髓组织SDF-1α含量升高(P＜0.05).结论 低氧预处理通过CXCR4-FAK信号通路促进BMSC向大鼠脊髓缺血再灌注损伤组织迁移,并与之粘附,从而发挥脊髓保护作用.
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异丙酚预处理对缺氧复氧诱发HEPG2细胞内质网应激的影响
目的 评价异丙酚预处理对缺氧复氧诱发HEPG2细胞内质网应激的影响.方法 HEPG2细胞采用随机数字表法分为4组(n=6):对照组(C组)常规培养42 h;异丙酚组(P组)用含异丙酚(终浓度10 μmol/L)培养基孵育6h,更换正常培养基培养36 h;缺氧复氧组(H/R组):常规培养6h,缺氧24h复氧12 h;异丙酚预处理组(PP组)用含异丙酚(终浓度10 μmol/L)培养基孵育6h,更换正常培养基置入三气培养箱(1％O2、5％ CO2和94％N2)缺氧24h,随后放入正常培养箱培养12 h.采用MTT比色法检测细胞活力,采用Western blot法检测免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)和活化型caspase-3的蛋白表达,采用RT-PCR法检测BIP、CHOP和caspase-3的mRNA表达.结果 与C组比较,H/R组和PP组细胞活力降低,BIP、CHOP、活化型caspase-3的蛋白及其mRNA表达上调(P＜0.05),P组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与H/R组比较,PP组细胞活力升高,BIP、CHOP、活化型caspase-3的蛋白及其mRNA表达下调(P＜0.05).结论 异丙酚预处理可通过抑制内质网应激,促进细胞增殖,减轻HEPG2细胞缺氧复氧损伤.
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低氧/复氧后星形胶质细胞对永生化神经前体细胞增殖与分化的影响
目的 探讨低氧/复氧后星形胶质细胞对永生化神经前体细胞增殖与分化的影响.方法 24 h内新生SD大鼠,断头处死,分离、培养和传代星形胶质细胞,取本室构建的永生化神经前体细胞,根据培养条件的不同分为3组,每组24孔,对照组永生化神经前体细胞在正常培养条件下培养(O2 17%-CO2 5%-N2 78%);共培养组取第三代星形胶质细胞孵育24 h后接种永生化神经前体细胞,培养条件同对照组;低氧/复氧后共培养组取第三代星形胶质细胞,先置入低氧培养箱(O2 2%-CO25%-N2 93%)中孵育12 h后,恢复正常培养条件12 h,再接种永生化神经前体细胞.3组以相同密度接种永生化神经前体细胞(1×104/cm2),隔天半量置换培养基,培养时间为6 d.共培养6 d后每组取6孔,采用免疫荧光细胞化学法,观察共培养后永生化神经前体细胞的增殖与分化情况,计算其增殖倍数、神经元阳性率和星形胶质细胞阳性率.结果 与对照组和共培养组相比,低氧/复氧后共培养组永生化神经前体细胞增殖倍数升高(P＜0.05),神经元阳性率和星形胶质细胞阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 低氧/复氧后星形胶质细胞可促进永生化神经前体细胞增殖,但对其分化无影响.
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氢气对PC12细胞缺氧复氧时内质网应激的影响
目的 探讨氧气对PC1 2细胞缺氧复氧时内质网应激的影响.方法 PC12细胞采用随机数字表法,将其随机分为4组,正常对照组:细胞常规培养25 h；阳性对照组:细胞正常培养1h后,用氧气饱和的RPM1-1640培养基继续培养24 h；缺氧复氧组:细胞缺氧1h后复氧24 h；氢气组:细胞缺氧1 h后,州氧气饱和的RPM1,1640培氧基复氧24 h.PC12细胞加入含Na2S2O4终浓度为5.0mmol/L的RPMI-1640培养液,5％ CO2培养箱37 ℃孵育1h;更换正常RPMI-1640培养液,继续培养24h,制备PC12细胞缺氧复氧模型.采用WST-1法测定细胞相对增殖率,采用硫代巴比妥酸法测定MDA浓度,采用免疫组化法检测caspase-3表达,采用RT-PCR法检测活化转录因子4(ATF4)mRNA和C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA的表达.结果 与正常对照组和阳性对照组比较,缺氧复氧组细胞相对增殖率降低,MDA浓度升高,caspase-3、ATF4 mRNA和CHOP mRNA的表达七调,氧气组ATF4 mRNA和CHOP mRNA的表达上调(P＜0.05)；正常对照组和阳性对照组间细胞相对增殖率、MDA浓度、caspase-3 、ATF4nRNA和CHOP mRNA的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)；与缺氧复氧组比较,氢气组细胞相对增殖率升高,MDA浓度降低,caspase-3、ATF4 mRNA和CHOP mRNA的表达下调(P＜0.05).结论 氧气可能通过抑制内质网应激,降低细胞凋亡,减轻PC12细胞缺氧复氧损伤.
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二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响
目的 探讨二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响.方法培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml的密度接种于96孔培养板(100 μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=12),正常对照组(C组)不作任何处理,缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)和二氮嗪预先给药+5-羟葵酸组(DZ+5-HD组)均进行缺氧2 h复氧2 h,DZ组和DZ+5-HD组在缺氧前2 h分别加入100 μmol/L二氮嗪和100 μmol/L二氮嗪+100 μmol/L线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸.于复氧2 h时测定细胞活力和凋亡率.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高(P＜0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P＜0.05或0.01);5-羟葵酸可抑制二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05或0.01).结论 二氮嗪预先给药可抑制大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡,从而减轻缺氧复氧损伤,其机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关.
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氯胺酮预先给药对缺氧复氧诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响
目的 研究氯胺酮预先给药对缺氧复氧诱导大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的影响,及磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt通路在其中的作用.方法 出生7～8 d的清洁级SD大鼠,雌雄不拘,体重15～20g;制备CGNs,培养的8 d的CGNs随机分为5组,对照组(A组)、缺氧复氧组(B组)、氯胺酮预先给药组(C组)、PI3K/Akt通路的特异性抑制剂Ly294002-氯胺酮预先给药组(D组)、Ly294002组(E组).B组将CGNs放入特制缺氧盒中,缺氧3 h后复氧;C组缺氧前1 h加入200μmol/L氯胺酮;D组加入氯胺酮前30 min加入20μmol/L Ly294002;E组加入20μmol/L Ly294002.复氧16 h后进行下述指标的观察.二乙酸荧光素染色法测定CGNs存活率,Hoechst 33258核染色检测CGNs凋亡细胞核,琼脂糖凝胶电泳检测DNA片断化水平,蛋白免疫印迹法(Western blot法)检测CGNs磷酸化Akt、磷酸化GSK3β及总Akt水平.结果 缺氧复氧可诱导CGNs的凋亡,降低CGNs磷酸化Akt和磷酸化GSK3β水平(P＜0.05),氯胺酮预先给药可减轻缺氧复氧诱导的上述改变,氯胺酮对CGNs的这种保护作用可被Ly294002部分抑制.结论 氯胺酮预先给药可减轻缺氧复氧诱导大鼠CGNs凋亡,其机制与激活PI3K/Akt通路有关.
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吗啡预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时miR-133b-5p与Fas表达的影响
目的 评价吗啡预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时微小RNA-133b-5p(miR-133b-5p)与Fas表达的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠心室肌细胞,接种于24孔板或60 mm培养皿培养,采用随机数字表法分为3组(n=24):对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)和吗啡预处理组(MPC组).C组细胞正常培养,H/R和MPC组细胞缺氧90 min后复氧,MPC组于缺氧前采用含lμmol/L吗啡的无血清DMEM培养10 min,再换为无吗啡培养液培养30 min.于复氧120 min时采用MTT法测定心肌细胞活力,检测培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性,采用Hoechst 33234染色法检测心肌细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率;实时定量PCR法检测miR-133b-5p与Fas mRNA的表达,Western blot法检测Fas蛋白的表达.结果 与C组比较,H/R组心肌细胞活力降低,培养液LDH活性和细胞凋亡率升高,miR-133b-5p表达下调,Fas mRNA及蛋白表达上调(P＜0.05);与H/R组比较,MPC组心肌细胞活力升高,培养液LDH活性和细胞凋亡率降低,miR-133b-5p表达上调,Fas mRNA及蛋白表达下调(P＜0.05).结论 吗啡预处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的机制与上调miR-133b-5p表达,下调Fas表达有关.
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阿片受体、PI3K/Akt和ERK信号通路在瑞芬太尼预处理减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用
目的 评价阿片受体、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在瑞芬太尼预处理(RPC)减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用.方法 健康成年雄性SD大鼠,处死后取心室肌组织,原代培养心肌细胞,调整细胞浓度为2×104个/ml后接种于24孔细胞培养板(500 μl/孔)中,采用随机数字表法,将其中108个培养孔分为12组(n=9):正常对照组(C组)；H/R损伤组(H/R组)采用缺氧90 min/复氧120 min的方法制备心肌细胞H/R损伤模型；缺氧预处理组(HPC组)在H/R前,培养孔经缺氧10 min/复氧30 min；瑞芬太尼预处理组(RPC组)在H/R前,以终浓度1μmol/L瑞芬太尼孵育心肌细胞10 min,再常规培养30 min;δ受体拮抗剂纳曲吲哚+ RPC组(NTD+ RPC组)、κ受体拮抗剂nor-binahorphimine(nor-BNI)+ RPC组(BNI+RPC组)、PI3K/Akt信号通路阻断剂渥曼青霉素+RPC组(W+ RPC组)、ERK信号通路阻断剂PD98059+ RPC组(PD+ RPC组)在RPC前10 min分别维持培养孔终浓度5μmol/L纳曲吲哚和nor-BNI、0.1μmol/L渥曼青霉素和30 μmol/L PD98059,然后与瑞芬太尼共孵育10 min,再常规培养30 min,随后行H/R；试剂对照组分别为NTD组、BNI组、W组和PD组.于复氧结束时,测定心肌细胞活力、细胞凋亡率和培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性.结果 与C组比较,H/R组心肌细胞活力降低,细胞凋亡率和培养液LDH活性升高(P＜0.05)；与H/R组比较,HPC组、RPC组和BNI+ RPC组心肌细胞活力升高,细胞凋亡率和培养液LDH活性降低(P＜0.05),NTD+ RPC组、W+ RPC组、PD+ RPC组、NTD组、BNI组、W组和PD组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05)；与RPC组比较,NTD+ RPC组、BNI+ RPC组、W+ RPC组和PD+ RPC组心肌细胞活力降低,细胞凋亡率和培养液LDH活性升高(P＜0.05).结论 瑞芬太尼预处理可能通过激活δ受体,进而激活PI3K/Akt和ERK信号通路,从而减轻大鼠心肌细胞H/R损伤.
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硫化氢对大鼠海马神经元氧-糖缺失/恢复损伤的影响
目的 研究硫化氢(H2S)对大鼠海马神经元氧-糖缺失/恢复损伤的影响.方法 新生(24～48 h内)Wistar大鼠断头,迅速取出海马,应用0.125%胰酶消化,海马神经元在96孔和6孔培养板上培养10 d后随机分为5组:正常培养组(Ⅰ组)、氧-糖缺失/恢复组(Ⅱ组)、氧-糖缺失/恢复+50μmol/L NaHS组(Ⅲ组)、氧-糖缺失/恢复+100 μmol/L NaHS组(Ⅳ组)和氧-糖缺失/恢复+200 μmol/LNaHS组(Ⅴ组).Ⅱ组神经元进行氧-糖缺失45min后换回原来的培养液,然后放回原培养箱培养24h,Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组在氧-糖缺失时加入NaHS,使其终浓度分别为50、100、200 μmol/L,余处理同Ⅱ组,Ⅰ组按正常培养方法培养.检测96孔培养板神经元活力.鉴定6孔培养板的神经元纯度并进行细胞色素C水平、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)浓度和神经元凋亡的检测.结果 与Ⅰ组比较,Ⅱ组MDA浓度、细胞色素C水平和神经元凋亡率升高,GSH浓度和神经元活力降低(P＜0.05);与Ⅱ组比较,Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组MDA浓度、细胞色素C水平和神经元凋亡率降低,GSH浓度和神经元活力升高(P＜0.05);与Ⅲ组比较,Ⅳ组和Ⅴ组MDA浓度、细胞色素C水平和神经元凋亡率降低,GSH浓度和神经元活力升高(P＜0.05);与Ⅳ组比较,Ⅴ组MDA浓度、细胞色素C水平和神经元凋亡率降低,GSH浓度和神经元活力升高(P＜0.05).结论 外源性H2S可减轻大鼠海马神经元氧-糖缺失/恢复损伤,其机制可能与其提高机体的抗氧化能力、减少神经元的凋亡有关.
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SIRT1∕NF-κB信号通路在小鼠海马神经元氧糖剥夺-复氧复糖损伤中的作用
目的 评价沉默信号调节因子1(SIRT1)∕NF-κB信号通路在小鼠海马神经元氧糖剥夺-复氧复糖损伤中的作用.方法 培养HT22小鼠海马神经元,以5×104个∕ml的密度接种于培养板(96孔板,100μl∕孔;6孔板,2 ml∕孔)或培养皿(6 cm),采用随机数字表法分为4组(n=24):对照组(C组)、氧糖剥夺-复氧复糖组(OGD组)、SIRT1抑制剂EX-527预处理组(EX组)和SIRT1激动剂SRT1720预处理组(SRT组).C组在37℃常氧培养箱中培养,OGD组、EX组和SRT组将细胞培养基更换为缺氧液,置于37℃培养箱(5％CO2-95％N2)中培养12 h,随后将缺氧液更换为培养基,置于37℃常氧培养箱中继续培养24 h制备氧糖剥夺-复氧复糖损伤模型.EX组和SRT组于氧糖剥夺前12 h时分别加入SIRT1抑制剂EX-5271μmol∕L和SIRT1激动剂SRT172010μmol∕L孵育.采用CCK-8法测定细胞活力,采用化学比色法测定LDH活性,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blot法检测SIRT1、NF-κB、IκBα、Bcl-2和Bax的表达水平,计算Bcl-2∕Bax比值.结果 与C组相比,OGD组、EX组和SRT组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,SIRT1、IκBα及Bcl-2表达下调,NF-κB和Bax表达上调,Bcl-2∕Bax比值降低(P<0.05);与OGD组相比,SRT组细胞活力升高,LDH活性和细胞凋亡率降低,SIRT1、IκBα及Bcl-2表达上调,NF-κB和Bax表达下调,Bcl-2∕Bax比值升高,EX组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,SIRT1、IκBα及Bcl-2表达下调,NF-κB和Bax表达上调,Bcl-2∕Bax比值降低(P<0.05).结论 SIRT1∕NF-κB信号通路抑制参与了小鼠海马神经元氧糖剥夺-复氧复糖损伤的过程.
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PI3K/Akt信号转导通路在二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中的作用
目的 探讨PDK/Akt信号转导通路在二氮嗪预处理减轻大鼠海马缺氧复氧损伤中的作用.方法 新生SD大鼠,出生时间<24 h,体重5-6 g,断头取海马组织,胰蛋白酶消化后,将神经元接种于96孔板或直径35 mm培养皿中,培养12 d后,随机分为6组:对照组(C组)、缺氧复氧组(HR组)、二氮嗪100μmol/L预处理组(Dz组)、二氮嗪100 μmol/L预处理+5-羟癸酸100μmol/L预处理组(DZ+HD组)、5-羟癸酸100 μmol/L预处理组(HD组)和二氮嗪100 μmol/L预处理+LY294002 50μmol/L预处理组(Dz+LY组),每组48孔或12皿.C组不给予任何处理,其余5组每天给予相应药物预处理l h,连续3 d,然后缺氧4 h,复氧24 h,测定神经元活力、凋亡率、Akt、Bcl-2和Bax的表达水平.结果 与C组比较,其余各组海马神经元活力降低.凋亡率升高,Akt和Bcl-2和Bax表达上调(P<0.01);与HR组比较.DZ组海马神经元活力升高.凋亡率降低,Altt和Bel-2表达上调,Bax表达下调(P<0.01);与Dz组比较,DZ+HD组、HD组和Dz+LY组海马神经元活力降低,凋亡率升高.Akt和Bel-2表达下调,Bax表达上调(P<0.01).结论 二氮嗪预处理可能通过激活PDK/Akt信号转导通路,上调Bel-2表达,下调Bax表达,抑制神经元凋亡,从而减轻大鼠海马缺氧复氧损伤.
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异丙酚后处理对大鼠氧糖缺失-复氧复糖皮质神经元促凋亡蛋白活性的影响:与p38MAPK信号通路的关系
目的 评价异丙酚后处理对大鼠氧糖缺失-复糖复氧皮质神经元促凋亡蛋白Bid、Bim、Puma活性的影响及其与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路的关系.方法 出生24 h内的SD大鼠,体外培养其皮质神经元并按种于6孔板(2 ml/孔),采用随机数字表法将皮质神经元分为4组(n=42):对照组(C组)、氧糖缺失-复糖复氧组(OGD/R组)、异丙酚后处理组(P组)和异丙酚后处理+p38MAPK抑制剂组(PS组).采用氧糖缺失90 min,复氧复糖24 h的方法制备皮质神经元氧糖缺失-复糖复氧损伤模型.P组和PS组于复氧复糖即刻于培养基中加入异丙酚孵育2h,终浓度50 μmol/L;PS组于氧糖缺失前1h时于培养基中加入SB202190,终浓度50 μmol/L.采用Annexin V-FITC/PI双染色法测定神经元凋亡率,采用MTT法测定神经元存活情况,采用比色法测定LDH漏出情况;采用JC-1荧光法测定线粒体膜电位(MMP)水平,采用Western blot法测定Bid、Bim和Puma 的表达.结果 与C组比较,OGD/R组、P组和PS组神经元凋亡率和LDH漏出率升高,神经元存活率和MMP水平降低,Bid、Bim和Puma的表达上调(P＜0.05);与OGD/R组比较,P组和PS组神经元凋亡率和LDH漏出率降低,神经元存活率和MMP水平升高,Bid、Bim和Puma的表达下调(P＜0.05);与P组比较,PS组神经元凋亡率和LDH漏出率升高,神经元存活率和MMP水平降低,Bid、Bim和Puma的表达上调(P＜0.05).结论 异丙酚后处理可通过激活p38MAPK信号通路,抑制促凋亡蛋白Bid、Bim和Puma的活性,减轻大鼠皮质神经元氧糖缺失-复糖复氧损伤.
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血红素加氧酶-1在七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用
目的 探讨血红素加氧酶-1(HO-1)在七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 新生健康清洁级SD大鼠15只,日龄1～3d,处死后取心室肌组织,原代培养心肌细胞,以1×106个/ml接种于6孔培养板或以2× 105个/ml接种于24孔培养板,采用随机数字表法,将其随机分为4组(n＝25):对照组(C组)常规培养；缺氧复氧组(H/R组)采用缺氧2h,复氧1h的方法制备心肌细胞缺氧复氧损伤模型；七氟醚预处理组(S+ H/R组)细胞经2.5％七氟醚预处理20min后行药物洗脱10 min,再行缺氧复氧处理；锌原卟啉+七氟醚预处理组(ZnPP+ S+ H/R组)细胞经HO-1抑制剂锌原卟啉3 μmol/L孵育1h后,行七氟醚预处理及缺氧复氧处理.于复氧结束后测定心肌细胞HO-1表达、细胞凋亡率、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)、线粒体膜通透性转运孔(PTP)开放程度、细胞色素C(Cyto C)表达及培养液LDH和CK活性.结果 与C组比较,H/R组心肌细胞HO-1和胞浆Cyto C表达上调,线粒体Cyto C表达下调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PTP开放度升高(P<0.01).与H/R组比较,S+H/R组心肌细胞HO-1和线粒体Cyto C表达上调,胞浆Cyto C 表达下调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PIP开放度降低(P<0.01).与S+H/R组比较,ZnPP+ S+ H/R组心肌细胞HO-1和线粒体Cyto C表达下调,胞浆CytoC表达上调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PTP开放度升高(P<0.01).结论 HO-1表达上调参与了七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.
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缺氧预处理骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓缺血再灌注时血红素氧合酶-1表达的影响
目的 评价缺氧预处理骨髓间充质干细胞(BMSC)对大鼠脊髓缺血再灌注时血红素氧合酶-1(HO-1)表达的影响.方法 健康清洁级SD雄性大鼠30只,6～8周龄,体重200～ 250 g,采用随机数字表法,将其分为5组(n=6):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、PBS组、BMSC移植组(BMSC组)和缺氧预处理组(HP).HP组BMSC置于3％O2-5％ CO2-92％N2的培养箱中培养24 h,进行缺氧预处理.PBS组、BMSC组和HP组分别鞘内注射PBS、BMSC和缺氧预处理的BMSC,60 min后采用主动脉阻断法建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型.分别于再灌注6、12、24、48 h和7d时行神经功能评分.于再灌注7d时,处死大鼠,取脊髓组织,采用Western blot法测定HO-1蛋白表达水平,采用RT-PCR法测定HO-1 mRNA表达水平.结果 与S组比较,其余各组再灌注各时点神经功能评分降低,脊髓组织HO-1 mRNA及其蛋白表达上调(P＜0.05);与I/R组比较,BMSC组和HP组再灌注各时点神经功能评分升高,脊髓组织HO-1 mRNA及其蛋白表达上调(P＜0.05),PBS组再灌注各时点神经功能评分、脊髓组织HO-1 mRNA及其蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05);与BMSC组比较,HP组再灌注各时点神经功能评分升高,脊髓组织HO-1 mRNA及其蛋白表达上调(P＜0.05).结论 缺氧预处理增强BMSC移植减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤作用的机制可能与HO-1表达进一步上调有关.
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HIF-1α在七氟醚预处理减轻大鼠皮质神经元凋亡中的作用:与Bid、Bim和Puma的关系
目的 评价缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在七氟醚预处理减轻大鼠皮质神经元凋亡中的作用.方法 新生SD大鼠,培养原代皮质神经元,以1×106个/ml的密度接种于6孔板(2 ml/孔),采用随机数字表法,分为4组(n=15):正常对照组(C组)、缺氧复氧组(A/R组)、七氟醚预处理组(SP组)和HIF-1α抑制剂2-甲氧基雌二醇组(H组).采用氧糖缺失90 min,复氧复糖24 h的方法制备皮质神经元缺氧复氧损伤模型;SP组通人2.0％七氟醚2h,随后采用PBS洗涤3次,每次5 min,结束后立即制备缺氧复氧损伤模型;H组加入5 μmol/L2-甲氧基雌二醇孵育72 h时进行七氟醚预处理.采用膜联蛋白V/碘化丙啶双染流式细胞术检测神经元凋亡情况,采用免疫蛋白印迹法测定神经元Bid、Bim、Puma和活化的caspase-3的表达水平.结果 与C组比较,A/R组神经元凋亡率升高,Bid、Bim、Puma和活化的caspase-3表达上调(P＜0.05);与A/R组比较,SP组和H组神经元凋亡率降低,SP组Bid、Bim、Puma和活化的caspase-3表达下调(P＜0.05);与SP组比较,H组神经元凋亡率升高,Bid、Bim、Puma和活化的caspase-3表达上调(P＜0.05).结论 HIF-1α介导了七氟醚预处理减轻大鼠神经元凋亡的过程,其机制与下调Bid、Bim和Puma表达有关.
