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6-姜酚在不同环境中对人肝癌细胞株杀伤和化疗增敏作用的研究
目的 对比6-姜酚在正常和低氧、低糖模式下对于人肝癌细胞株(HepG-2)细胞的杀伤和化疗增敏作用. 方法 通过浓度为5、10、15、20、40、60 mg/L阿霉素(多柔比星,ADM)和25、50、100、200 μmol/L 6-姜酚刺激培养至对数期的HepG-2细胞,采用CCK-8试剂盒检测HepG-2细胞增殖反应.通过流式细胞术结合细胞凋亡检测试剂盒双标染色法检测药物作用后细胞的凋亡情况.采用实时聚合酶链式反应(real-time PCR)检测bel-2、bax及birc-5 mRNA的表达情况. 结果 6-姜酚、ADM作用于HepG-2细胞后,细胞生长受到抑制.两种模式下6-姜酚组、阿霉素组的抑制率随浓度的升高而增强,抑制率具有浓度依赖性.正常培养条件下对照组、6-姜酚组、ADM组及6-姜酚+ADM组HepG-2细胞凋亡百分比分别为(7.98±0.76)％、(9.63±1.00)％、(12.70±2.13)％、(19.92±1.41)％;低氧低糖条件下对照组、6-姜酚组、ADM组及6-姜酚+ADM组HepG-2细胞凋亡百分比分别为(13.92±2.02)％、(19.36±1.22)％、(27.87±0.99)％、(38.63±2.25)％,两种培养条件下各浓度组细胞凋亡百分比均较对照组增高,差异有统计学意义(t值分别为7.250、5.259、12.185、8.140、15.000、47.576,P值分别为0.019、0.034、0.007、0.015、0.004、0.000),两药联用组的凋亡数高,且低氧、低糖各浓度组的凋亡数高于正常培养各浓度组.real-time PCR检测结果表明,正常培养条件下与对照组比较,实验组bcl-2、birc-5表达降低,bax表达无变化.低氧低糖条件下与对照组比较实验组bcl-2、birc-5表达降低,bax表达增高.在低氧低糖环境下bcl-2的表达较正常培养条件下的表达增高,而bax、birc-5表达减少,bcl-2/bax高于正常培养组. 结论 6-姜酚可能通过下调birc-5的表达,降低Survivin蛋白抑制肿瘤细胞的凋亡的能力对HepG-2细胞产生杀伤和化疗增敏作用,在低氧低糖环境中这种作用表现地更为明显.
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高原慢性低氧环境慢性牙周炎与阿尔茨海默病的相关性
随着对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)发病机制的研究,许多学者认为,脑内慢性炎性反应可能是AD的重要病理特征之一[1-2].近些年牙周组织的健康已被世界卫生组织列为人类健康的10项标准之一,近些年慢性牙周炎对大脑的影响逐渐受到关注,牙周炎可能对AD的发生和发展具有潜在的影响.流行病学调查显示高原地区牙周炎的患病率显著高于平原地区[3],本文将介绍近些年国内外慢性牙周炎与认知功能相关性的研究现状,同时讨论高原地区慢性低氧环境牙周疾病与AD的相关性,旨在为该病的预防提供新思路.
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低氧环境下胃肠道微环境与帕金森病相关性的研究进展
近年来较多帕金森病患者在得到诊断之前均饱受胃肠道疾病的困扰,临床及神经病理学均表明肠道菌群失调与帕金森病存在密切的相关性.随着高原地区对胃肠道微环境研究的不断深入,发现低氧、低气压、低温、强辐射等低氧环境因素与健康人群的肠道菌群失调有密切的关系,其中低氧是主要的影响因素,低氧环境可能与胃肠道微环境改变有相关性.本文主要对近年来低氧环境下胃肠道微环境与帕金森病的相关性研究进展进行简要综述.
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高原低氧和认知功能障碍相关性的研究进展
近年来关于低氧环境与认知功能障碍的研究取得了长足的进展,青藏高原由于其独特的低气压、低氧环境,已成为世界上低氧与认知功能障碍的发病机理及药物开发研究的热点地区.本文主要从近年来高原低氧和认知功能障碍相关性的研究进行简要综述.
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SOCS 3基因对缺氧肺动脉平滑肌细胞增殖及原癌基因mRNA表达的影响
目的探讨细胞因子信号负调控因子(SOCS)3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)原癌基因c-fos、c-jun mRNA表达及细胞增殖的影响.方法实验分pEFSOCS3和pSV2neo共转染组(A组)、未转染组(B组)、pEF和pSV2neo共转染组(C组).以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo 共转染至体外培养的PASMCs中,用免疫细胞化学法测转染前后细胞中SOCS3蛋白表达;用半定量RT-PCR检测转染前后常氧、缺氧2、4、6、8、12 h细胞c-fos、c-jun mRNA表达水平;流式细胞仪测转染前后上述各时相点细胞周期的变化.结果免疫细胞化学法证实转染后细胞中有SOCS3稳定表达.半定量RT-PCR结果,B、C组缺氧2 h c-fos mRNA表达水平达高峰,4 h下降, 6 h降至正常,8 h再次达高峰,12 h 下降;与B组同时相点相比,A组缺氧2、8 h c-fos mRNA表达水平低(P<0.01).B、C组缺氧2 h c-jun mRNA表达水平升高,6 h达高峰;与B组同时相点相比,A组缺氧2、4、6、8 h c-jun表达水平低(P<0.01).B、C组缺氧6 h即出现G0/G1期细胞比例减少,S+G2/M期细胞比例增加(P<0.01);与B组同时相点相比,A组G0/G1期细胞比例增多,S+G2/M期细胞比例减少(P<0.01).结论缺氧可能通过诱导PASMCs c-fos、c-jun表达而促进PASMCs增殖;SOCS3蛋白可能通过下调c-fos、c-jun基因表达从而抑制缺氧诱导的PASMCs增殖.
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氯化钴诱导低氧环境对人肝癌HepG2细胞株的生长影响
目的 建立人肝癌HepG2细胞在氯化钴诱导的低氧环境下的生长模型,观察不同浓度氯化钴(CoCl2)诱导的低氧环境对人肝癌HepG2细胞的增殖、细胞的周期与凋亡即细胞的生长状况影响,探讨氯化钴诱导的低氧对人肝癌HepG2细胞生长的作用机制.方法 将对数期人肝癌细胞株HepG2细胞,分为加入不同浓度(50 μm/L、100 μm/L、150 μm/L、200 μm/L)氯化钴的实验组和加入等体积培养基的对照组,(1)通过MTT法检测HepG2细胞增殖情况计算细胞的抑制率并绘制HepG2细胞生长抑制曲线;(2)划痕实验观察HepG2细胞的迁移能力;(3)通过流式细胞仪的Annexin-VFITC/PI双染法和PI单染法检测细胞的凋亡和周期变化;(4)通过Western Blot法检测HepG2细胞的Bcl-2蛋白的表达.结果 (1)通过MTT法检测结果示在一定的时间和浓度范围内氯化钴抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,并呈时间-剂量依赖性关系.(2)划痕损伤实验说明:氯化钴抑制HepG2细胞的迁移及损伤修复能力,呈浓度依赖性关系.(3)流式细胞仪的检测结果显示:对照组、不同浓度(50 μm/L、100 μm/L、200 μm/L、300 μm/L、500 μm/L)的实验组的细胞凋亡率(％)分别是:3.42、7.74、13.07、20.56、28.53、44.45(P ＜0.05),与对照组相比实验组的凋亡率明显增加,并呈浓度依赖性.细胞的周期结果显示:随着浓度增加,氯化钴能明显抑制HepG2细胞周期的变化,阻滞细胞周期于G1期,从而抑制细胞的增殖.(4) Western Blot法检测:与对照组相比,经过不同浓度氯化钴处理后的实验组Bcl-2蛋白的表达明显减少.结论 在一定范围内,氯化钻诱导的低氧环境可以抑制人肝癌HepG2细胞的增殖以及愈合迁移的能力,诱导细胞凋亡并呈时间-剂量的依赖性关系,其作用机制可能与Bcl-2蛋白的表达减少有关.
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黄芪激活ERKl/2信号转导通路抗心肌细胞再灌注损伤作用
目的 研究黄苠注射液调节ERKl/2信号转导通路抗培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的作用.方法 采用培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型,实验分为五组:A组为正常对照组,B、C、D、E组均为缺氧/复氧组,其中各组培养液组成为:B组缺氧液,C组缺氧液加黄芪,D组缺氧液加PD98059,E组缺氧液加黄芪和PD98059.缺氧4h,复氧2h.比较缺氧/复氧前后培养液中心肌酶含量,并进行心肌细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达检测.结果 缺氧/复氧后对各组细胞培养液中心肌酶含量进行比较,结果显示各缺氧组与正常对照组比较,心肌谷草转氨酶(GOT),乳酸脱氢酶(LDH),肌酸激酶(CK)均有升高(P＜0.05).黄芪缺氧组与缺氧对照组比较,GOT升高减轻(P＜0.05).ERK抑制剂PD98059对黄芪的保护作用有一定削弱,但没有统计学意义.黄芪可使缺氧/复氧引起的心肌细胞ERK表达增加,PD98059对黄苠引起的ERK表达增加没有明显抑制作用.结论 黄芪能够减轻缺血再灌注损伤,其机制涉及了ERKI/2信号途径.
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黄芪注射液对培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的保护作用
目的 研究黄芪注射液抗培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的作用.方法 采用培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型,实验分为六组:A正常对照组,B缺氧组,C黄芪20组,D黄芪100组,E黄芪200组,F黄芪400组.黄芪各组缺氧过程中给予不同浓度黄芪,缺氧4 h,复氧2 h.比较缺氧复氧前后心肌细胞存活率,培养液中心肌酶含量.结果 各组缺氧前后谷草转氨酶(GOT)均有差异.复氧后2 h,B、C、D组培养液中心肌酶含量均有不同程度升高(P＜0.05).E、F组GOT值较基础值降低(P＜0.05).与正常组比较,各组细胞经过缺氧复氧后,存活数均有不同程度下降(P＜0.01).与缺氧复氧组比较,加入黄芪保护的黄芪20,黄芪100,黄芪200组均优于单纯缺氧复氧组.黄芪200组存活率高(P＜0.01).结论 黄芪能够减轻培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤.
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小鼠未成熟关节透明软骨细胞的培养与生物学特征研究
目的 建立小鼠未成熟关节透明软骨细胞分离、培养的方法,探讨低氧环境对软骨细胞活性及糖代谢的影响. 方法 机械分离与酶消化相结合,分离、纯化小鼠未成熟关节软骨细胞.分别于低氧( O2体积百分比为 2%)和常氧( O2体积百分比 21%)条件下培养,应用四甲基偶氮唑盐( MTT)法检测细胞活性; RT PCR检测细胞葡萄糖转运体 -1,3及磷酸果糖激酶 mRNA的表达;葡萄糖氧化酶方法测定细胞对葡萄糖的摄取量. 结果Ⅱ型胶原免疫组化和阿利辛蓝染色证实获得细胞为透明软骨细胞.低氧培养环境可提升细胞的增殖能力,诱导细胞表达低氧诱导因子 -1α;伴随低氧诱导因子 -1α的表达及其表达量的提高,葡萄糖转运体 -1,3和磷酸果糖激酶的表达水平升高,细胞对葡萄糖的摄取量增加. 结论 所建立的分离、培养方法可以获得高纯度的透明软骨细胞;软骨细胞可通过氧感应机制以适应低氧环境而调整其代谢和生存状态.
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低氧预适应对自体肝移植大鼠肝细胞EGR-1表达的影响
目的 探讨低氧预适应对大鼠肝移植术后早期生长反应因子1(early growth response factor-1,EGR-1)的影响.方法 采用门静脉灌注的大鼠自体肝移植模型:A组:低氧预适应大鼠自体肝移植组;B组:大鼠自体肝移植组;C组:正常大鼠对照组.比较大鼠自体肝移植术后肝脏组织病理学改变、肝组织中低氧诱导因子(hypoxic induce factor 1,HIF-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的mRNA表达变化和早期生长反应因子1(EGR-1)的WB结果.结果 A组大鼠因术前低氧诱导致HIF-1 ENA的表达比B组和C组更明显,术后6h明显高于B组(t=9.601,df=10,2-tailed Sig=0.000,P<0.05);A组和B组的Egr-1蛋白表达量术后都增多,但A组明显低于B组.而B组肿瘤坏死因子RNA的RT-PCR表达比A组和C组更明显,其中术后6 h明显高于A组(t=-12.067,df=10,2-tailed Sig=0.000,P<0.05),与Esgr-1蛋白表达呈正相关.肝细胞病理结果示A组肝小叶结构损伤较B组轻,肝细胞轻微肿胀,肝组织无明显改变.结论 低氧预适应后大鼠移植肝中EGR-1生成适度增加,与大鼠自体肝移植组相比明显减少,降低了TNF等炎性因子的产生从而减少肝脏的病理损害.
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Notch1信号途径参与低氧诱导的Jurkat细胞侵袭转移的作用机制研究
目的 研究Notch1信号途径在低氧诱导的Jurkat细胞侵袭转移过程中的作用.方法 分别在低氧和常氧环境下体外培养Jurkat细胞,观察细胞侵袭转移能力的变化,同时检测Notch1信号途径,基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达变化.采用RNA干扰的方法阻断Notch1信号途径后,观察Jurkat细胞侵袭转移能力的改变以及MMP-2和MMP-9的变化情况.结果 低氧能够促进Jurkat细胞的侵袭转移能力,同时在低氧环境下,Notch1信号途径能够被激活以及MMP-2和MMP-9的表达增加.阻断Notch1信号途径后,Jurkat细胞侵袭转移能力下降,而MMP-2和MMP-9的表达也下调.结论 在低氧条件下,Jurkat细胞侵袭转移能力增加,其机制可能通过激活Notch1信号途径促使MMP-2和MMP-9的表达增加来实现的.
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氧浓度与CagA+幽门螺杆菌对人胃癌SGC7901细胞系HIF-2α和Oct-4表达影响的研究
目的:通过观察常氧与低氧下CagA+幽门螺杆菌(Hp)对人胃癌SGC7901细胞系HIF-2α和Oct-4表达的影响,初步探讨Hp在胃癌发生发展中的干细胞机制,及其与肿瘤微环境低氧的协同作用.方法:内镜下采集胃黏膜标本后行Hp培养并鉴定,PCR方法鉴定CagA基因.CagA+ Hp与胃癌SGC7901细胞于常氧和低氧环境下共培养48 h(分常氧对照组、低氧对照组、常氧CagA+ Hp组、低氧CagA+ Hp组).免疫细胞化学法检测HIF-2α和Oct-4蛋白的表达,RT-PCR法检测Oct-4 mRNA的表达.结果:免疫细胞化学结果显示,常氧下胃癌SCC7901细胞HIF-2α和Oct-4蛋白呈低水平表达,表达量分别为0.263 9±0.008 0和0.317 9±0.001 3.低氧和CagA+ Hp均能显著诱导HIF-2α和Oct-4蛋白表达,与常氧对照组的相比,HIF-2α表达量为0.431 8±0.001 2和0.422 5±0.017 0,t值分别为46.410 3和18.875 6,P＜0.01；Oct-4为0.546 8±0.008 2和0.478 9±0.001 8,t值分别为61.649 1和162.139 0,P＜0.01.与低氧对照组和常氧CagA+ Hp组相比,低氧CagA+ Hp组蛋白表达量进一步升高,HIF-2α为0.507 7±0.007 0,t值分别为23.896 8和10.362 5,P＜0.01；Oct-4为0.698 7±0.005 1,t值分别为35.173 7和90.876 1,P＜0.01.相关分析显示,HIF-2α与Oct-4表达呈正相关,r=0.964 0,P＜0.05.RT-PCR检测各组Oct-4 mRNA表达结果显示与免疫细胞化学结果一致.结论:常氧下CagA+ Hp可刺激胃癌细胞HIF-2α和Oct-4表达,低氧环境下其表达进一步增加,表明CagA+ Hp和低氧对HIF-2α和Oct-4的表达有协同作用.提示CagA+ Hp和低氧可能是诱导胃癌细胞干细胞化的重要原因.
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PD98059和LY294002对乏氧放射胰腺癌ASPC-1细胞的影响
目的:观察MAPK、PI3K信号传导通路抑制剂PD98059 (PD)、LY294002 (LY)对乏氧照射胰腺癌细胞系ASPC-1细胞周期、VEGF和EGFR蛋白表达及细胞存活的影响.方法: ASPC-1细胞分成常氧组、乏氧组、PD乏氧组、LY乏氧组和PD+LY乏氧组及各自照射组;PD98059终浓度为25 μmol/L, LY294002终浓度为20 μmol/L.乏氧组乏氧时间为24 h,照射组接受4 Gy单次照射,乏氧照射组在乏氧情况下进行照射.用Western blot法、流式细胞术以及成克隆分析法对ASPC-1细胞进行检测.结果:常氧情况下ASPC-1细胞VEGF、EGFR蛋白均有表达,ASPC-1细胞乏氧培养后VEGF、EGFR蛋白表达量增加,应用PD98059或(和)LY294002后乏氧VEGF、EGFR蛋白的表达量较单纯乏氧组降低,LY乏氧组或PD+LY乏氧组VEGF表达蛋白量较PD乏氧组减少.乏氧组细胞克隆形成率较常氧组降低,LY乏氧组细胞克隆形成率较PD乏氧组降低,但差异无统计学意义,F=3.51, P=0.053.照射组间细胞克隆形成率差异均有统计学意义,F=123.21, P=0.000 5,LY乏氧照射组细胞克隆形成率低于PD乏氧照射组,PD+LY乏氧照射组的细胞克隆形成率低于单独应用组.结论: MAPK、PI3K传导通路抑制剂PD98059、LY294002可降低乏氧后ASPC-1细胞VEGF、EGFR蛋白表达及乏氧照射后细胞克隆形成率,ASPC-1细胞乏氧后PI3K传导通路的激活可能起主要作用.
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HIF-1α基因沉默对裸鼠人肺癌移植瘤放射敏感性影响的观察
目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因沉默对裸鼠肺癌移植瘤放射敏感性的影响.方法:采用A549和A549/HIF-1α(一)细胞株建立人肺癌移植瘤模型,分别给予5、10、15和20 Gy单次剂量X射线照射,观察放射治疗对肿瘤的抑制作用,根据肿瘤生长延缓和照射剂量分析肿瘤剂量效应及HIF-1α基因沉默对在体肿瘤放射敏感性的影响.结果:放射治疗能明显抑制肿瘤生长,并观察到随照射剂量的增加肿瘤生长延缓愈显著,接受等剂量照射HIF-1α基因沉默肿瘤生长延缓更明显,根据肿瘤剂量效应曲线计算放射增敏比分别为1.40、1.34和1.31.结论:放射治疗能显著抑制A549和A549/HIF-1α(一)肿瘤生长,A549/HIF-1α(-)肿瘤对放射治疗更敏感.
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Doranidazole对乏氧胰腺癌细胞放射增敏研究
目的研究新一代硝基咪唑衍生物-Doranidazole在低氧环境下对胰腺癌细胞的放射增敏效果.方法在低氧和加Doranidazole环境下对人胰腺癌细胞系施行单次大剂量γ线照射,通过微孔板荧光酶标仪检测细胞死亡率来研究放射增敏作用.细胞死亡的增敏效果从时间相关性及形态学方面进行评价.Doranidazole在低氧环境下的选择性增敏效果利用流式细胞技术进行验证.结果在7种胰腺癌细胞系中,5种细胞实行30 Gy大剂量照射5 d后的细胞死亡率在低氧环境下因Doranidazole的添加而显著增高;而常规环境下却无明显的增敏作用.同时提示Doranidazole在低氧环境下的选择性增敏作用有时间相关性.结论Doranidazole在低氧环境下对胰腺癌细胞大剂量γ线照射具有明确的增敏效果.
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短程低氧条件下乳腺癌BT549细胞表达beclin 1基因对上皮间质转化的影响
目的： beclin 1基因慢病毒表达载体稳定感染三阴性乳腺癌BT549细胞后,于短程低氧条件下探讨beclin 1基因对上皮间质转化( EMT)的影响。方法用带有pLenO-GTP Vector及pLenO-GTP-beclin 1 Vector的慢病毒以感染复数( MOI)为20分别感染BT549细胞,即实验对照组及实验组,未感染细胞作为空白对照。感染96 h后用倒置荧光显微镜观察荧光,估计感染效率；用Western blot法检测beclin 1基因是否在 BT549细胞中稳定表达；将各组细胞低氧培养12、24 h 后采用荧光定量 PCR、Western blot法及激光共聚焦显微镜检测EMT相关标志物；用Western blot法检测低氧培养24 h后的各组细胞Wnt/β-catenin信号通路的相关蛋白表达水平。用两样本t检验分析低氧时间对细胞EMT相关标志物的表达情况,余计量资料用方差分析进行统计。结果慢病毒感染BT549细胞96 h后,感染效率约为100%,实验组beclin 1蛋白高效稳定表达(F=107．200,P=0．000)；低氧条件下,相对于空白对照组、实验对照组,实验组细胞的上皮标志物E-cadherin mRNA和蛋白表达水平上调(12 h：F=122．451、P=0．000,F=29．651、P=0．001；24 h：F=108．783、P=0．000,F=41．232、P=0．000),而间皮标志物 N-cadherin、vimentin及 fibronectin表达水平下调(12 h：N-cadherin F=92．918、P=0．000、F=138．034、P=0．000,vimentin F=135．313、P=0．000、F=39．765、P=0．000,fibronectin F=144．275、P=0．000；24 h：N-cadherin F=76．064、P=0．000、F=40．614、P=0．000, vimentin F=206．576、P=0．000、F=46．658、P=0．000,fibronectin F=411．405、P=0．000)；相对于低氧培养12 h,各组细胞低氧培养24 h后E-cadherin表达水平下调(空白对照组：t=4．266、P=0．013,t=11．235、P=0．000；实验对照组：t=10．463、P=0．000,t=4．092、P=0．009；实验组：t=28．208、P=0．000,t=7．262、P=0．001),而 N-cadherin(实验组除外)、vimentin和fibronectin表达水平上调(空白对照组：N-cadherin t=3．072、P=0．037、t=7．146、P=0．002, vimentin t=6．384、P=0．003、t=7．476、P=0．002,fibronectin t=8．389、P=0．001；实验对照组：N-cadherin t=2．805、P=0．049、t=5．352、P=0．006,vimentin t=12．701、P=0．000、t=5．923、P=0．004,fibronectin t=7．318、P=0．002；实验组：N-cadherin t=7．849、P=0．001、t=1．987、P=0．184,vimentin t=11．097、P=0．000、t=13．626、P=0．000,fibronectin t=11．003、P=0．000)；beclin 1基因与低氧环境对 BT549细胞E-cadherin、N-cadherin的表达水平有交互效应( E-cadherin： F=19．175、P=0．000,F=5．588、P=0．015；N-cadherin：F=8．238、P=0．006,F=5．934、P=0．016)；低氧培养24 h后,实验组Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin、Snail蛋白水平下调(β-catenin： F=18．169, P=0．003；Snail： F=11．098, P=0．010),而p-GSK-3β的蛋白水平上调(F=36．096, P=0．000)。结论 beclin 1基因在短程低氧条件下抑制BT549细胞EMT,而随时间的增加低氧促进 EMT；beclin 1基因在短程低氧环境下抑制 EMT 的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。
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受缺氧反应元件调控的荧光素酶报告基因在缺氧肿瘤细胞内的表达活性研究
目的 研究缺氧反应元件调控的荧光素酶报告基因在肿瘤细胞内的缺氧反应性.方法 将pGL3-6HRE-TATA-luciferase-SV40pa报告载体以Lipofectamine 2000介导瞬时转染Hela S3和HepG2细胞,分别于缺氧(1% O2)和常氧(21% O2)培养后检测相对荧光素酶活性.结果 pGL3-6HRE-TATA-luciferase-SV40pa报告载体转染细胞后,缺氧培养条件下相对荧光素酶的活性较常氧培养条件下显著上调,差异具有统计学意义(P＜0.01),并且该缺氧诱导性具有一定的时间依赖性,即HelaS3细胞中,缺氧培养12～24 h,相对荧光素酶的活性上升到了高值;而HepG2细胞中,缺氧培养36 h,相对荧光素酶的活性上升到了高值.结论 6HRE人工启动子在肿瘤细胞内具有显著的缺氧诱导性;6HRE人工启动子缺氧诱导性具有一定的时间效应,并且在不同肿瘤细胞中其诱导效应和时间效应可存在着差异.研究结果为实体肿瘤基因治疗奠定了理论和实验基础.
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缺氧及复氧对去整合蛋白和金属蛋白水解酶10和淀粉样β分泌酶mRNA水平的影响
目的研究缺氧及复氧损伤对去整合蛋白和金属蛋白水解酶10 (ADAM10)和淀粉样β分泌酶 (BACE1) mRNA的影响.方法研究分为缺氧12 h组,缺氧24 h组及各自对照组.缺氧组在缺氧条件下(95%N2,5%CO2)分别培养SH-SY5Y细胞12 h和24 h后复氧,分别于0、12、24 h利用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测ADAM10、BACE1 mRNA水平;对照组在正常情况下培养,与缺氧组同一时间进行接种和处理.结果缺氧培养12 h后复氧各时间点ADAM10 mRNA表达下调(分别较对照组下降19.8%、41.4%、64.6%;P=0.005、0.038、0.001),缺氧培养24 h后复氧各时间点ADAM10 mRNA表达下调更明显(分别较对照组下降30.1%、75.9%、86.5%;P=0.009、0.005、0.043);BACE1 mRNA在缺氧24 h后复氧12 h 和24 h 表达上调(分别较对照组上调31.5%和35.1%;P=0.028、0.005).结论缺氧及复氧可以降低ADAM10转录水平和增加BACE1转录水平.
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大鼠缺氧神经元细胞中促红细胞生成素及其mRNA的表达
目的 观察大鼠大脑皮质神经元细胞缺氧时促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)及其mRNA表达的变化,探讨内源性EPO对缺氧神经元细胞的保护作用.方法 制备体外培养大鼠大脑皮质神经元细胞缺氧模型,分为正常对照组；缺氧12、24、48、72 h组.利用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应及蛋白质印迹观察细胞中EPO及其mRNA的表达,并在变化过程中观察培养液中乳酸脱氢酶来评估神经元细胞的活性.结果 免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应及蛋白印迹检测显示:缺氧组中EPO(20.79±2.98)及其mRNA(0.78±0.05)在12 h已有基本表达,与对照组(EPO:17.12±1.99；mRNA:0.39±0.05)比较,差异均有统计学意义(t=2.51,P＜0.05；t=13.51,P＜0.01)；且48 h达高峰(EPO:28.88±3.41,mRNA:1.45±0.07),与对照组比较,差异有统计学意义(t =7.29,P＜0.叭；=33.24,P＜0.01)；神经元细胞活性也强.乳酸脱氢酶活性72 h后表达明显下降,各时间组之间比较差异同样具有统计学意义.结论 神经元细胞缺氧后使细胞内EPO及EPO mRNA的表达增强,且可增强神经元细胞的活性.提示EPO参与了神经元细胞缺氧的发生发展过程,在神经元细胞缺氧的过程中起重要作用.
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神经胶质瘤干细胞向内皮细胞分化的差异基因表达谱的分析
目的 检测并分析胶质瘤干细胞(GSCs)低氧诱导分化为内皮细胞过程的差异基因表达谱的关键通路和基因,为恶性胶质瘤的治疗寻找新的靶基因.方法 从U87胶质瘤细胞株中提取GSCs细胞并进行免疫荧光鉴定;将GSCs在水凝胶上低氧诱导分化,并对分化后的内皮细胞进行免疫荧光鉴定;收集并提取细胞总RNA,用基因芯片检测分化前、后的细胞差异表达基因,进而分析差异基因的显著靶向性功能和差异基因参与的信号转导通路,从而筛选出关键调控信号通路和基因.结果 提取的GSCs表达CD133、Nestin、SOX2等干细胞标志物;低氧诱导5d后细胞表达CD31、CD34两种内皮细胞标志物;差异基因表达谱存在481个上调基因及245个下调基因(差异倍数＞2),筛选出转化生长因子β(TGF-β)信号通路、脂肪酸合酶(FASN)、脯氨酰-4-羟化酶亚基α1(P4HA1)等多个有意义的通路和基因(均P ＜0.01).结论 U87细胞中提取的GSCs可经体外低氧诱导分化为内皮细胞,TGF-β信号通路、FASN及P4HA1可能成为胶质母细胞瘤具有前景的治疗靶点.
