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P19细胞移植对急性心肌梗死后心功能的影响
目的 观察P19细胞经冠脉移植对急性心肌梗死后心功能的影响.方法 P19细胞体外诱导分化为心肌细胞,RT-PCR法检测GA-TA-4基因相对表达量.22只日本大耳白兔,随机分为P19细胞移植组(n=11)和培养液对照组(n=11).通过结扎左冠前降支建立急性心肌梗死模型.冠脉结扎后7d,细胞移植组和对照组直接经冠脉注入P19细胞和培养液.分别于心梗前、细胞移植前、细胞移植后1 w和4 w对兔进行超声心动图检查.结果 移植后4w,P19细胞移植组在射血分数(LVEF)、左室收缩末直径(LVESD)和舒张末直径(LVEDD)方面与移植前及对照组相比均有显著改善(P＜0.05).结论 经冠脉移植的P19细胞可显著改善心功能.
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p19细胞神经分化研究进展
神经细胞的分化、发育及成熟是现代生命科学研究的热点之一,目前认为p19胚胎癌细胞系是一个研究神经发机制的理想细胞模型,本文对p19细胞、其所分化来的神经元以及参与该细胞神经分化的相关因素作一综述.
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外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化
目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用.方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确.将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d.以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达.结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化.
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多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响
目的 探讨多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响.方法 在P19细胞向心肌细胞分化的培养液中加入多氯联苯(Aroclor 1254)2.5 μmol/L,同时设立阴性对照组.显微镜下连续观察P19细胞形态的变化,并采用实时荧光定量RT-PCR技术对分化过程的第0、4、10天中GATA4及Nkx2.5基因mRNA的表达水平进行检测.结果 在分化全程(0 ～ 10天),实验组与对照组无细胞形态上的差别;而GATA4、Nkx2.5基因的表达量除在分化开始前(第0天)差异无统计学意义外,在分化中期(第4天)及末期(第10天),实验组中GATA4、Nkx2.5基因的相对表达量均显著低于对照组.结论 多氯联苯可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程.
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苯丙氨酸及其代谢物对P19细胞神经分化的影响
探讨苯丙氨酸及其代谢物对P19细胞分化的影响及机制.实验各组从P19细胞神经分化诱导期开始分别加入苯丙氨酸、苯乙酸和苯乳酸,观察神经分化期细胞形态,MTT法检测神经分化期细胞存活率和LDH漏出量的变化,并通过流式细胞仪检测诱导后细胞周期有无变化.结果显示:苯丙氨酸及其代谢物可使P19神经元肿胀、崩解,神经突起纤细且突起数少,可降低P19细胞存活率,但对LDH漏出量并无影响,对诱导后的P19细胞周期也无影响.以上结果提示,苯丙氨酸及其代谢物可干扰P19细胞的神经诱导过程,母源性苯丙酮尿症中枢神经系统损伤可能与其在脑发育早期阶段神经诱导及分化过程中受到高苯丙氨酸及其代谢物影响有关.
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同源盒基因Nkx2-5促进5-氮胞苷诱导的单层P19细胞表达心肌标志物
目的:探讨同源盒基因Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层生长的P19细胞向心肌细胞分化中的作用.方法:以稳定表达Nkx2-5的P19细胞为实验组,P19细胞为对照组.两组细胞均单层培养并以5-aza(1μmol/L)诱导,倒置显微镜下观察细胞的生长状态;在诱导后4、8、12、16 d,以RT-PCR检测转录因子GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和心房利钠多肽(ANP)基因的表达.结果:对照组经5-aza诱导后ANP没有表达;GATA-4在8、12、16 d有表达;α-MHC在12、16 d有表达.实验组5-aza诱导后,GATA-4在诱导4、8、12、16 d有表达;α-MHC和ANP都是在5-aza诱导后的8、12和16 d表达.两组结果比较显示实验组GATA-4和α-MHC基因的表达时间提前;两组除α-MHC在12 d的表达无差异外,其他取材时间点实验组两个基因的表达量与对照组相比均增高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).结论:Nkx2-5促进5-aza诱导的单层生长的P19细胞向心肌分化.
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过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化
Wnt-1基因在小鼠神经发育过程中起着重要作用.该基因在胚胎性癌细胞P19向神经分化过程中存在瞬时性表达.利用克隆到的Wnt-1基因转染P19细胞(Wnt-1/P19),可使细胞不经视黄酸(RA)诱导,自发向神经细胞方向分化.早期神经分化关键基因MASH-1在Wnt-1/P19细胞的神经分化过程中的表达,晚于RA诱导引起的P19细胞的分化过程.
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miR-19b 沉默对 P19细胞分化及线粒体功能的影响
目的：通过沉默微小RNA-19b（ miR-19b）研究miR-19b对P19细胞分化及线粒体功能的影响。方法：转染miR-19 b沉默质粒与空载质粒进入P19细胞建立起稳定的细胞系；线粒体功能分析用以检测细胞凋亡；诱导分化 P19细胞，实时定量荧光 PCR 检测 miR-19 b 沉默后细胞分化关键基因表达水平。结果：TargetScan 5.1软件及双荧光素酶报告基因系统共同证实，Wnt1为miR-19b在P19细胞中发挥作用的靶点（ P＜0.05）；测定第0、4、6、8、10、12天cTnT、NKX2.5、GATA4等基因的核酸表达量显示，心肌分化相关标志基因逐渐增高，miR-19 b沉默组明显低于对照组（ P＜0.05）；于分化第10天检测线粒体功能，发现miR-19 b沉默组线粒体DNA拷贝数的相对含量高于对照组，其活性氧水平显著低于对照组，ATP水平也高于对照组（均P＜0.05）。结论：miR-19b沉默可抑制细胞凋亡，抑制心肌细胞分化。
关键词： 微小RNA-19b沉默 P19细胞 线粒体 分化 -
P19 细胞向心肌细胞分化过程中FHL1基因的表达变化
目的:观察FHL1(Four and a half LIM domains protein 1)基因在P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨FHL1基因与心肌细胞分化之间的关系.方法:P19细胞经1%二甲基亚砜(DMSO)诱导悬浮培养4天形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至14天,观察细胞跳动情况,用肌钙蛋白I(cTnI)抗体行Western Blot以鉴定心肌细胞分化,并采用RT-PCR、Western Blot技术在细胞分化成熟的不同时段检测P19细胞中 FHL1 基因mRNA和蛋白的表达水平.结果:DMSO 诱导4天后,用生长培养基黏附培养至第8天,P19细胞出现自发性节律跳动的细胞团片,Western Blot检测cTnI蛋白呈阳性.FHL1基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,Western Blot检测结果与RT-PCR检测结果基本一致.FHL1基因在分化第0～8天表达显著增高,各时间点之间差异显著(P<0.05);第8～14天表达趋于稳定,各时间点之间差异无显著性(P>0.05).结论:FHL1基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能参与心肌细胞的分化和发育.
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类糖尿病环境对P19细胞分化为心肌细胞的影响
目的:探讨在类糖尿病环境下诱导P19细胞向心肌细胞分化过程中心肌转录因子GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)和心肌特异标志物心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表达水平.方法:体外类糖尿病环境下,诱导P19细胞向心肌细胞分化,通过Real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测其cTnT和GATA4在不同时间点的mRNA以及蛋白表达水平.结果:在分化过程中,类糖尿病组P19细胞分化形成的胚胎样小体较正常组增殖缓慢,形成的生长晕松散零乱.类糖尿病环境下GATA4 mRNA的表达量在分化第6、8、10天(0.05±0.06、0.11 ±0.04、0.45±0.12)均明显低于同时间点的对照组(1.00±0.04、0.44±0.06、0.78±0.20),cTnT mRNA的表达量(0.12±0.03、0.07±0.04、0.46±0.11)均明显低于同时间点的对照组(1.02±0.25、0.25±0.02、0.71±0.21).蛋白质印迹法结果用积分光密度值量化数据,类糖尿病环境下分化第6、8、10天GATA4蛋白表达(0.40±0.06、0.25±0.03、0.92±0.13)均明显低于同时间点的对照组(0.69±0.09、0.75±0.08、1.05±0.07).类糖尿病环境下分化第6、8天cTnT蛋白表达(0.39±0.08、0.37±0.05)均明显低于同时间点的对照组(0.79±0.05、0.54±0.07).统计结果表明在分化第6、8天时,类糖尿病环境下GATA4和cTnT mRNA和蛋白的表达量与对照组相比,差异均有统计学意义.结论:类糖尿病环境培养降低了P19细胞向心肌细胞的分化.
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FCCP对P19细胞向心肌细胞诱导分化的影响
目的:探讨羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone,FCCP)对P19细胞向心肌细胞诱导分化的影响.方法:在P19细胞向心肌细胞诱导分化的过程中加入5μmol/L的FCCP,同时设立阴性对照组,显微镜观察分化过程中不同时间点P19细胞形态的变化,并采用real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测GATA4、NKX2.5及cTnT在分化过程中的mRNA和蛋白表达水平.结果:FCCP处理组P19细胞形成的胚胎样小体较对照组体积小,结构较松散,形态不均一.在整个分化过程中,FCCP处理组GATA4、NKX2.5及cTnT基因均有表达,但整个动态表达过程较对照组延迟;Westernblot结果显示,FCCP处理组GATA4、NKX2.5蛋白在第5、7、9天的表达量均较对照组低;在第11天,两组间GATA4蛋白的表达量差异无统计学意义;而NKX2.5在FCCP处理组的表达量仍低于对照组.FCCP处理组和对照组cTnT蛋白在分化第5、7天的表达量差异无统计学意义,而在第9、11天cTnT蛋白表达量FCCP组均较对照组低.结论:FCCP可抑制P19细胞向心肌细胞诱导分化的进程.
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小鼠NOMO1基因RNA干扰载体的构建及其功能的初步研究
目的:构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,比较其对P19细胞NOMO1基因的抑制效率,以研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系.方法:利用Designer3.0软件设计小鼠NOMO1基因干扰片段,合成shRNA序列,再行寡核苷酸双链的合成,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pGPU6/Hygro载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒扩增,质粒DNA抽提,使用Pst Ⅰ、BamH Ⅰ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆.将小鼠NOMO1基因RNA干扰载体转染P19细胞,以RT-PCR技术验证NOMO1基因在P19细胞中的mRNA表达.以DMSO诱导分化方案诱导P19细胞向心肌细胞分化,采用定量RT-PCR技术检测P19细胞中α-MHC等基因mRNA的表达,评估NOMO1与P19于细胞向心肌细胞方向分化的关系.结果:双酶切证实shRNA正确插入质粒,测序结果表明插入的序列正确.载体转染的P19细胞筛选稳定表达株,经RTPCR和Western blot验证4个位点设计的干扰质粒对NOMO1在P19细胞中的mRNA表达均具有较高的抑制效率.转染后P19细胞的α-MHC基因mRNA表达则显著下调(P＜0.05).结论:成功构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,为研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系提供了稳定的转染细胞工具,NOMO1可能通过诱导α-MHC等基因表达,促进P19干细胞向中胚层的分化.
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miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响
目的:探讨microRNA-29c(miR-29c)过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响及机制.方法:体外传代培养P19细胞,利用细胞转染技术构建miR-29c过表达细胞(mimic组).CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞周期;Hoechst染色结合流式细胞技术检测细胞凋亡情况,定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测凋亡相关因子Bax/Bcl-2表达情况;二甲亚砜(DMSO)诱导P19细胞分化,定量PCR检测心肌特异性标志基因肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain, αMHC),转录因子GATA4和心肌增强因子2c(myocyte enhancer factor 2c,Mef2c)表达情况,明确miR-29c过表达对P19细胞分化的影响;生物信息学分析结合荧光素酶报告实验和Western blot明确miR-29c的靶基因.结果:与对照组相比,miR-29c过表达组细胞增殖速率较慢,细胞周期S期比例降低;miR-29c过表达组细胞凋亡率增高,Bax表达水平增高,而Bcl-2表达无明显差异;P19细胞分化第6天和第8天miR-29c过表达组αMHC、GATA4和Mef2c的表达水平显著高于对照组;Akt3被证实为miR-29c的靶基因.结论:miR-29c过表达可能是通过调控Akt3来抑制P19细胞增殖、促进P19细胞的凋亡和分化.
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P19细胞向心肌细胞分化过程中ZNF207基因的表达变化
目的:观察锌指蛋白207基因(ZNF207)在P19细胞向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨ZNF207基因与心肌细胞分化之间可能的关系.方法:体外培养P19细胞,应用0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导其向心肌细胞分化,采用RT-PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测P19细胞中ZNF207基因mRNA表达水平.结果:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化的过程中均有表达,随细胞分化成熟.该基因表达水平逐渐升高.经统计学分析发现,在分化第0～2天该基因表达无差异;第2～10天表达持续性增高,各时间点之间均有差异,差异均有统计学意义(P＜0.05);第10～17天该基因稳定高表达,各时间点之间无差异.结论:ZNF207基因在P19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能有利于心肌细胞的分化和发育.
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P19细胞向心肌细胞分化过程中miRNA表达谱的变化
目的：探讨P19细胞向心肌细胞分化过程中微小RNA（miRNA）差异表达谱。方法采用miRNA芯片技术获得P19细胞分化前和分化后第8天的miRNA差异表达谱，定量PCR技术进行芯片结果验证，并采用生物信息学方法进行靶基因预测。结果共获得31条miRNAs差异表达谱。与未分化的P19细胞相比，分化第8天的细胞中16条miRNAs下调，15条上调。其中，miRNA‐32、miRNA‐25、miRNA‐21、miRNA‐363和miRNA‐367经定量PCR验证结果与芯片结果中的变化趋势一致。靶基因预测结果显示，GATA6、Notch1和 Wnt5a为miRNA‐32可能的靶基因。结论本研究获得了P19细胞向心肌细胞分化过程中miRNA差异表达谱，为先天性心脏病的研究提供了线索。
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miR-20b慢病毒表达载体的构建及表达
目的 构建鼠miR-20b慢病毒表达载体,检测其在P19细胞中的过表达效果.方法 设计并合成含有miR-20b成熟序列的编码短发卡状RNA(shRNA)的双链DNA.将shRNA克隆入慢病毒载体,与Pcgvp、Rev和Vsvg包装质粒共转染HEK-293T细胞包装病毒,收取病毒上清液,纯化后感染P19细胞.荧光倒置显微镜下观察感染效率,实时定量PCR检测慢病毒感染后miR-20b的相对表达量.结果 经双酶切分析及测序验证,成功构建了miR-20b的过表达载体.慢病毒感染P19细胞的效率可达到70％以上,miR-20b表达水平明显升高.结论 成功构建了鼠miR-20b的慢病毒表达载体,包被的病毒可以在P19细胞中实现过表达效果.
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FCCP对FABP3基因表达沉默的P19细胞线粒体功能的影响
目的 探讨羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(FCCP)对脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因表达沉默的P19细胞线粒体功能的影响.方法 构建FABP3表达沉默载体(A组)及相应的空载体(B组),包装病毒后感染P19细胞,建立稳定转染FABP3沉默的P19细胞株,采用实时定量PCR检测干扰效率.给予FCCP 2.5μmol/L(C组)、5μmol/L(D组)干预FABP3沉默的P19细胞,采用荧光素酶化学发光法检测细胞ATP含量,流式细胞术观察线粒体膜电位的变化.结果 B组FABP3基因表达量较A组下调(0.50±0.08 vs.2.23±0.42) (P＜0.05).与A、B组相比,C、D组细胞ATP生成减少(2.47±0.58、1.05±0.13 vs.0.09±0.03、0.12±0.02) (P＜0.05),而细胞线粒体膜电位升高(358.36±12.23、389.66±12.13 vs.437.35±9.27、473.21±19.65) (P＜0.05).结论 FABP3基因在维持P19细胞线粒体功能中发挥重要作用.
关键词： 脂肪酸结合蛋白3 P19细胞 线粒体功能 羰基-氰-对三氟甲氧基本腙 -
FABP3基因荧光载体构建及其蛋白的亚细胞定位
目的 构建脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的荧光表达载体FABP3-pEGFP-N2,并应用绿荧光融合蛋白技术检测FABP3蛋白的亚细胞定位.方法 RT-PCR法获得FABP3基因编码框,克隆到pEGFP-N2载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染P19细胞后,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞内FABP3蛋白定位.结果 成功克隆FABP3基因片段,并将其重组到pEGFP-N2载体中.荧光显微镜和激光共聚焦显微镜显示,FABP3蛋白主要分布于P19细胞的胞浆和胞核中.结论 成功构建了FABP3-pEGFP-N2真核表达载体,FABP3在P19细胞的胞浆和胞核中呈弥漫分布特点.
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FABP3对P19细胞增殖的影响及其生物信息学分析
目的 探讨脂肪酸结合蛋白(FABP)3基因过表达对P19细胞分化、增殖的影响及FABP3基因的生物信息学特征.方法 构建FABP3过表达载体及相应的空载体,转染P19细胞,经0.9%二甲基亚砜(DMSO)诱导分化为心肌细胞,定量PCR检测肌钙蛋白T(cTnT)和转录调控因子GATA4基因的表达,MTT法检测P19细胞增殖,应用在线数据库软件分析FABP3的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亚细胞定位等.结果 与空载体相比,FABP3基因过表达能抑制cTnT、GATA4 mRNA表达及P19细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01).生物信息学分析显示,FABP3基因mRNA全长1097 bp,开放阅读框长402 bp,编码133个氨基酸,相对分子质量为14 858 Da,蛋白主要位于胞浆.结论 FABP3基因过表达显著抑制心肌细胞分化、增殖,生物信息学分析为进一步研究该基因奠定了基础.
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LYRM1基因过表达对P19细胞凋亡的影响
目的 观察LYRM1基因过表达对P19细胞凋亡的影响.方法 将人LYRM1基因的真核表达载体(pcDNATM 3.1/myc-HisB-LYRM1)和空载体pcDNATM 3.1/myc-HisB,分别转染P19细胞,通过G418筛选2周,建立稳定过表达人LLYPM1基因的P19细胞系.用Western blot技术验证稳定表达细胞株.将稳定转染pcDNATM3.1/myc-HisB-LYRM1载体质粒和空载质粒的P19细胞以无血清培养基37℃孵育24 h以诱导细胞凋亡,收获细胞用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 建立了稳定转染LYRM1的P19细胞系,成功地表达了目的 基因.流式细胞术检测结果发现过表达LYRM1基因的P19细胞凋亡率显著降低.结论 LYRM1基因具有抑制P19细胞凋亡的作用.
