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尿CD80在微小病变型肾病中的作用研究进展
慢性肾脏病( chronic kidney disease, CKD)作为终末期肾脏病,严重威胁着人们生命健康. 流行病学调查显示,我国成年人CKD患病率达10. 8％ [1].原发性肾病综合征是导致肾小球疾病常见的病因之一,是一种由肾小球滤过膜受损,导致血浆蛋白通透性增大,产生大量尿蛋白,从而引起一系列病理、生理改变的临床综合征.
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共刺激分子CD80和CD86表达对鼻咽癌进展及预后的影响研究
背景 CD80和CD86是T淋巴细胞活化的重要共刺激分子，肿瘤细胞可通过低表达或缺失共刺激分子发生免疫逃逸。目的探讨共刺激分子CD80和CD86表达对鼻咽癌进展和预后的影响。方法选取2001年1月—2003年12月经中山大学肿瘤防治中心病理科诊断为鼻咽癌并有相应临床随访资料的鼻咽癌组织标本557例。患者均初次诊断且未进行任何治疗，随访时间2~114个月，随访过程中发生转移113例，死亡235例。采用免疫组织化学法检测CD80和CD86表达，采用Kaplan-Meier生存曲线、Log-rank检验及单因素Cox比例风险回归分析探讨CD80和CD86表达与鼻咽癌患者进展及预后的关系。结果免疫组织化学法发现，CD80和CD86主要定位在细胞膜上，在肿瘤间质很少表达。557例患者中CD80低表达组309例，CD80高表达组248例；CD86低表达组470例，CD86高表达组87例。Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验结果显示，CD80低表达组与CD80高表达组鼻咽癌患者无瘤生存时间比较，差异无统计学意义（χ2＝3.551，P＝0.060）；CD80低表达组与 CD80高表达组鼻咽癌患者总生存时间比较，差异有统计学意义（χ2＝5.521，P＝0.019）。CD86低表达组与CD86高表达组鼻咽癌患者无瘤生存时间及总生存时间比较，差异无统计学意义（χ2＝0.948，P＝0.330；χ2＝0.662，P＝0.416）。单因素Cox比例风险回归分析结果显示，CD80高表达组鼻咽癌患者发生转移复发及死亡的风险高于CD80低表达组（P﹤0.05）；CD86低表达组与CD86高表达组鼻咽癌患者发生转移复发及死亡的风险比较，差异无统计学意义（ P﹥0.05）。Spearman秩相关分析结果显示，鼻咽癌组织中CD86表达与间质中CD68＋巨噬细胞数量呈正相关（rs ＝0.103，P＝0.015）。结论鼻咽癌组织中CD80高表达与鼻咽癌患者预后差有关，增加局部复发和远处转移风险；未发现CD86表达与鼻咽癌患者进展及预后相关。
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过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪的体外干预
背景:树突状细胞在过敏性紫癜发病机制中可能具有重要的地位.已有报道黄芪在体内可以纠正过敏性紫癜患儿的Th1/Th2失衡,但目前关于黄芪在树突状细胞水平对过敏性紫癜病免疫功能调节的影响尚不清楚.目的:观察过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪对其的影响.设计、时间及地点:病例对照分析,于2005-10/2007-12在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成.材料:急性期过敏性紫癜患儿外周静脉血28份作为过敏性紫癜组,以门诊体检的健康同龄儿童外周静脉血18份作为正常对照组.黄芪水提剂由四川百利药业有限公司提供.方法:采用密度梯度离心法获取过敏性紫癜患儿及健康儿童外周血单个核细胞,获取的外周血单个核细胞体外经重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α以诱生树突状细胞,并培养8 d,其中过敏性紫癜组又分成2组:对照组和黄芪干预组.主要观察指标:ELISA法检测过敏性紫癜患儿及健康儿童血浆γ-干扰素和白细胞介素4水平及培养上清液中白细胞介素10,12,18水平,流式细胞仪检测树突状细胞表面CD83、CD86(B7-2)和CD80(B7-1)的表达率.结果:过敏性紫癜患儿急性期外周血中Th1型细胞因子γ-干扰素水平减少,Th2型细胞因子白细胞介素4水平增加,γ-干扰素/白细胞介素4比值明显降低.过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞经诱导培养的树突状细胞表面CD86表达率较正常对照组明显升高,且两组CD86表达率与血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关,与γ-干扰素,白细胞介素4比值皆呈显著负相关;CD80表达率明显低于正常对照组,且两组CD80表达率与血浆γ-干扰素水平及γ-干扰素/白细胞介素4比值均呈显著正相关.过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌白细胞介素12水平低于正常对照组(P<0.05),而白细胞介素10,18水平均高于正常对照组(P<0.05),两组树突状细胞分泌白细胞介素12水平与血浆γ-干扰素水平皆呈显著正相关(P<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈正相关(P<0.01,P<0.05);白细胞介素10分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05):白细胞介素18分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05).黄芪干预组树突状细胞表面CD83、CD86和CD80的表达率与对照组差异不显著,树突状细胞分泌白细胞介素12水平高于对照组(P<0.01),白细胞介素10,18水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01).结论:①过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞存在明显功能紊乱,表现为CD86表达率升高、CD80降低,白细胞介素12分泌减少、白细胞介素10和白细胞介素18增加,上述变化与Th1/Th2失衡关系密切.②黄芪主要是通过改变过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌细胞因子的水平来调节其功能.
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小干扰RNA抑制成熟树突细胞表面抗原CD80/CD86的表达
背景：成熟树突细胞可通过其表面抗原CD80/CD86来启动Th细胞活化，促使Th细胞向Th1细胞分化减少、向Th2细胞方向分化增多。
目的：探讨小干扰RNA抑制哮喘小鼠成熟树突细胞表面抗原CD80/CD86表达后对Th1及Th2型细胞因子干扰素γ、白细胞介素4分泌的影响。
方法：建立哮喘小鼠模型，分离哮喘小鼠骨髓成熟树突细胞，流式细胞术检测表面标记物 CD11c、CD80、CD86的阳性表达率；设计合成CD80/CD86相关小干扰RNA转染哮喘小鼠成熟树突细胞，荧光定量PCR、流式细胞术检测干扰前后成熟树突细胞中CD80/CD86 mRNA和相应蛋白的表达，将干扰组、未干扰组、转染试剂对照组的成熟树突细胞分别与小鼠T淋巴细胞共培养，ELISA检测上清液中Th1及Th2型细胞因子干扰素γ、白细胞介素4分泌水平。
结果与结论：①正常组成熟树突细胞的CD80/CD86的表达与哮喘组相比均明显降低(均P<0.05)。②小干扰RNA转染哮喘小鼠成熟树突细胞后，干扰组CD80/CD86 mRNA及其蛋白表达水平较其他组均明显降低(均P<0.05)。③小干扰RNA转染后干扰组共培养体系中干扰素γ水平明显高于其他组(均P<0.05)，白细胞介素4水平则明显低于其他组(均P <0.05)。提示哮喘小鼠成熟树突细胞高表达CD80/CD86，小干扰RNA特异性抑制哮喘小鼠成熟树突细胞中CD80/CD86的表达，能增加干扰素γ并减少白细胞介素4的分泌，从而纠正Th1/Th2失衡。 -
多重基因转染对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖和免疫原性的影响
目的 观察多重基因转染对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、凋亡及免疫原性的影响.方法 以空病毒质粒(SH/Ad组)、携带肿瘤抑制基因人野生型p53(wt-p53)的腺病毒质粒(SH/p53组)及携带wt-D53、免疫相关基因B7-1和粒-巨噬细胞集落刺激因子(CM-CSF)基因的腺病毒质粒(SH/BB-102组)转染SH-SY5Y细胞,并以未转染的肿瘤细胞为空白对照(SH组).分别采用免疫印迹法、流式细胞术和酶联免疫吸附法检测p53蛋白、B-1分子和GM-CSF的表达.观察转染前后细胞生长及凋亡情况.用混合淋巴细胞培养法检测瘤苗对T细胞增殖和细胞因子分泌的诱导作用.结果 腺病毒转染SH-SY5Y细胞后,目的基因得到了高效表达.与SH和SH/Ad组相比,SH/p63和SH/BB-102组细胞生长速度减慢,凋亡增加(P<0.05).SH/BB-102组与其他组比较,能够促进T细胞增殖,增加γ干扰素和白细胞介素-2的分泌(P<0.05).结论 wt-p53、E7-1和GM-CSF基因联合转染可以抑制SH-SY5Y细胞的生长、诱导细胞凋亡,并且可以增强肿瘤细胞的免疫原性.
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温热疗法对孢子丝菌病模型小鼠皮损局部免疫微环境影响
目的 探讨温热疗法对孢子丝菌病模型小鼠皮损局部免疫微环境的影响.方法 选取50只BALB/C雌性小鼠,建立孢子丝菌病小鼠模型.将小鼠随机分入A组和B组,每组25只.B组在接种2周后应用恒温水浴箱对小鼠尾部皮损局部进行水浴温热治疗,温度为43℃,每次15 min,每周3次,共治疗4周;A组不予任何处置.比较两组疗效差异,免疫组化法检测皮损病变组织中干扰素-γ的表达水平,聚合酶链式反应法检测皮损病变组织中CD80、CD86的表达水平.结果 B组小鼠皮损消退快于A组.B组小鼠皮损消退率高于A组,差异有统计学意义(P<0.05).治疗2周后,B组小鼠皮损病变部位干扰素-γ、CD80、CD86的表达水平均高于A组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 温热疗法治疗孢子丝菌病效果显著,其作用机制可能与皮损病变组织中干扰素-γ、CD80、CD86的表达水平上升有关.
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B7-1和B7-2协同刺激通道在复发性生殖器疱疹患者中的表达
目的 研究外周血B7-CD28/CTLA-4(CD152)T淋巴细胞活化协同刺激分子在复发性生殖器疱疹(recurrent genital herpes,RGH)患者发病机制中的作用.方法 用流式细胞仪检测50例RGH患者和20例健康体检者外周血淋巴细胞CD80(B7-1)/86(B7-2)及CD4+/CD8+T淋巴细胞中B7-CD28/CTLA-4的表达.结果 RGH患者组与对照组比较,CD80、CD86的阳性表达较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),对照组CD8+/CD28阳性表达显著高于患者组,差异有统计学意义(P<0.05),患者组的CD4+/CD152、CD8+/CD152的阳性表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 单纯疱疹病毒感染可诱导CD80、CD86、CD28和CD152活化增殖,高表达负性共刺激分子和分泌抑制性细胞因子,通过多种机制抑制机体的抗病毒免疫应答.
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人乳头瘤病毒11型E7与共刺激分子CD80嵌合DNA疫苗质粒的构建及鉴定
目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPVll)E7与共刺激分子CDSO嵌合DNA疫苗质粒.方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPVll-E7基因,经双酶切后定向克隆到pcDNA3.1(+)中,获得pcDNA3.1(+)/HPVllE7,测序鉴定后,再用PCR方法扩增去除终止密码子的E7基因片段,按上述方法插入质粒pcD-NA3.1(+)/CD80中CD80上游,构建pcDNA3.1(+)/HPVIlE7-CD80融合基因真核表达质粒.结果:去除终止子的E7基因片段成功正向插入CD80上游,双向测序分析显示序列无误,pcDNA3.1(+)/HPVIlE7-CD80嵌合真核表达质粒构建成功.结论:HPVll-E7/CD80嵌合DNA疫苗质粒构建成功,为研究该疫苗在尖锐湿疣防治中的作用奠定了基础.
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共刺激分子CTLA-4与B7在自身免疫性心肌炎中的作用
目的:研究共刺激分子CTLA-4、B7-1和B7-2在实验性自身免疫性心肌炎(EAM)组织中的表达及变化,探讨EAM的发病机制.方法:注射猪心肌球蛋白免疫Lewis大鼠建立EAM模型(实验组,n=30),按不同时间段随机分成14、28、56天3个亚组,取各组心脏组织行HE染色观察心肌的病理变化,免疫组化与实时荧光定量PCR技术检测心脏组织CTLA-4、CD80、CD86及其mRNA的表达.结果:实验组大鼠均出现不同程度的心肌炎改变；免疫组化染色示CD80、CD86蛋白主要见于实验组心脏组织的炎性细胞中.于初次免疫的第14至28天表达增强,56天时表达减弱.Real Time-PCR检测结果表明实验组心脏组织CD80、CD86的mRNA表达水平比正常对照组明显增加(P＜0.05).结论:共刺激分子CTLA4、CD80、CD86的表达增加促进了心脏组织的炎症反应,与EAM的发生发展密切相关.
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阻断共刺激通路诱导产生的无能细胞的抗原特异性免疫调节作用
目的:了解联合阻断B7-CD28和CD40-CD154通路诱导产生的小鼠免疫无能细胞的免疫调节特性和表型,以及是否具有抗原特异性.方法:Anti-CD154和anti-CD80单克隆抗体加入BALB/C(反应细胞)和C3H(刺激细胞)的混合淋巴细胞培养(MLR)体系中诱导产生无能细胞.将无能细胞或对照细胞分别加入新的BALB/C和C3H的MLR体系中观察抑制效果.在反应细胞和刺激细胞/第三方刺激细胞(C57BL/6J)之间的MLR体系中加入无能细胞观察抗原特异性.无能细胞中加入刺激细胞或rmIL-2,观察无能细胞的逆转情况.通过流式细胞仪检测无能细胞的表型.结果:无能细胞对反应细胞和刺激细胞之间的MLR具有抑制作用,且呈剂量依赖关系.无能细胞对于反应细胞和第三方刺激细胞之间的MLR无抑制作用.C3H刺激细胞和rmIL-2共同刺激才能逆转无能细胞的无能状态.无能细胞中CD25+CD4+T细胞含量上升,而CD45RBlowCD4+和CD28-CD8+T细胞含量无改变.结论:联合阻断B7-CD28和CD40-CD154通路诱导产生的小鼠免疫无能细胞具有抗原特异性的免疫调节功能,可以通过感染性耐受的方式抑制淋巴细胞的增殖.
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CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究
目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能.方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;Protein G亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用.结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56 mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖.结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性.
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IL-18对9 L胶质瘤细胞表面分子表达影响的体内外研究
目的：探讨IL-18转染大鼠胶质瘤细胞9L后，对其表面MHCⅠ、Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86表达的影响，以明确IL-18对胶质瘤细胞免疫原性及抗原递呈能力的影响。方法：以逆转录病毒为载体将外源性IL-18基因转染至9L细胞内，建立能够稳定表达IL-18的细胞（9L/IL-18），同时建立只转空病毒载体的对照细胞9L/LXSN。用流式细胞分析技术检测9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞表面MHCⅠ、Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的表达；用立体定向仪将9L/IL-18、9L/LXSN及9L细胞分别接种到F344大鼠颅内，建立大鼠胶质瘤模型，建模14天后处死大鼠，用流式细胞分析技术检测肿瘤组织细胞表面MHCⅠ、Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达。结果：在体外，IL-18转染后（9L/IL-18）细胞表面MHCⅠ、Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达分别为（10.9±1.44）％、（0.61±0.14）％、（1.01±0.14）％、（0.57±0.11）％与其他两组（9L/LXSN及9L）相比无显著差异（P＞0.05）；在体内，接种9L/IL-18细胞组大鼠肿瘤组织细胞表面MHCⅠ类分子及CD80、CD86的表达分别为（67.51±1.40）％、（12.51±1.57）％、（6.95±0.56）％，均高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05），MHCⅡ类分子表达（3.76±0.26）％与其他两组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：在体外，IL-18不影响9L细胞免疫原性；在体内，IL-18可提高9L细胞免疫原性及抗原递呈能力，增强机体对胶质瘤的免疫反应性。
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非特异性角膜炎症反应中B7-1mRNA的表达
目的:探讨小鼠角膜缝线及联合结膜下药物注射动物模型B7-1 mRNA表达与非特异性角膜炎症反应的相关性及核因子NF-kB抑制剂对B7-1 mRNA表达的阻断作用.方法:建立BALB/C鼠角膜缝线及联合结膜下药物注射的动物模型,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对各组术后1、3、7和14 d不同时相点角膜B7-1 mRNA的转录水平进行检测.结果:缝线联合细菌脂多糖(LPS)1、3和7 d角膜处理组与单纯缝线组比较B7-1 mRNA表达增加(P＜0.05),而术后14 d两组比较差异无显著性(P＞0.05);缝线联合LPS和吡咯啉烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)角膜处理组1、7和14 d与缝线联合LPS组比较B7-1 mRNA表达降低,3 d组B7-1 mRNA表达增加(P＜0.05).结论:缝线联合结膜下LPS注射可在术后诱导B7-1 mRNA的高水平表达,使炎症反应程度加重;而核因子NF-kB抑制剂PDTC可抑制角膜B7-1 mRNA的表达.核因子NF-kB对B7-1 mRNA表达具有重要的调控作用.
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IL-12联合B7-1基因放射治疗对小鼠B16移植肿瘤生长的影响
目的:探讨基因联合放疗对小鼠B16移植肿瘤的抑制作用.方法:碱裂解法提取纯化质粒DNA,微量注射法直接将质粒DNA导入体内肿瘤;建立荷瘤小鼠模型, 于小鼠右后肢皮下接种5×105个B16黑色素瘤细胞,待肿瘤直径达0.3～0.5 cm时开始治疗;肿瘤局部注射pNE-mIL-12和pcDNA-B7-1质粒3次,并给予3次X线照射,观察小鼠移植肿瘤的生长情况.结果:pNE-mIL-12重组质粒与pcDNA-B7-1质粒联合2 Gy放射治疗组肿瘤生长速率低,小鼠生存时间明显延长(P＜0.01～P＜0.001),末次照射后31 d小鼠死亡率仅为22.2%,而且其中有1只小鼠肿瘤消退.结论:多基因联合放疗可有效抑制小鼠B16移植肿瘤的生长,其效果好于单基因治疗和单纯放疗.
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足细胞病与相关循环因子的表达
肾小球足细胞的损伤不仅是遗传性肾小球病的发病基础,还在很多后天的肾小球疾病中发挥重要作用.常见的足细胞病以微小病变性肾病(Minimal Change Disease,MCD)和局灶阶段性肾小管硬化(Focal Segmental glomerulosclerosis,FSGS)为主,有实验证明,足细胞损伤同时参与了各种不同类型的肾小球疾病,比如糖尿病肾病,HIV相关肾病,膜性肾病及其他获得性肾小球病等,因此,了解足细胞病损伤的机制尤为重要.临床观察提出局灶节段行肾小球硬化患者体内可能存在一种与大量蛋白尿发生有关的循环因子,相关的动物实验和体外观察同时也证实了循环因子的存在.越来越多的研究支持T细胞功能不全,细胞因子异常释放可能是循环因子的来源之一.如果能对患者循环因子进行检测,借助它来指导治疗方案的选择(免疫抑制剂、血浆置换),可能成为局灶节段行肾小球硬化诊断和治疗中的一个突破.本文以国内外研究文献为基础,对文献资料进行分析、归纳和总结,综述了足细胞病中相关循环因子的表达,探讨足细胞病发生及复发的机理,为足细胞病的定向治疗提供帮助.
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人肝癌靶向性CD80基因表达重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的:构建人肝癌靶向性CD80基因重组腺病毒载体.方法:首先,从人基因组DNA中克隆AFP增强子、启动子,利用腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShutte-CMV,采用AFP增强子替换CMV启动子,构建含有AFP启动子和增强子的穿梭质粒,命名为pShuttle-AFP.将人CD80基因克隆到pShuttle-AFP的AFP增强子和启动子之后,构建pShuttle-AFP-CD80质粒.再将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183,利用同源重组构建腺病毒质粒pAd-AFP-CD80.以获得的重组子转染AD293细胞后制备重组腺病毒,并对重组的病毒进行鉴定和病毒滴度测定.结果:测序结果与Genebank中公布的AFP启动子、核心增强子和CD80基因序列相符.双酶切结果与预期结果相符.Pac I酶切结果与目的结果一致.穿梭质粒pShutte-AFP-CD80和腺病毒质粒pAd-AFP-CD80经酶切和PCR鉴定均获得期望大小的目的片段.结论:成功的构建了人肝癌靶向性pAd-AFP-CD80腺病毒载体,为CD80基因在肝癌靶向性治疗的研究奠定了基础.
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腺病毒CD-80基因转导B16-F10细胞的体外生物学特征
目的探讨含hB7-1基因的重组腺病毒hCD80rAd对B16-F10肿瘤细胞体外生物学特性的影响.方法以腺病毒为载体,将CD80基因导入B16-F10肿瘤细胞后,以PCR方法检测基因导入,以电镜、FACS等方法观察对其体外生物学特性的影响.结果重组腺病毒的滴度可达1010PFU/mL,20MOIs rAd可使95%以上的B16-F10细胞被感染.转染CD80基因后,B16-F10细胞的生长能力、克隆形成能力等均无变化,电镜下,细胞表面结构及胞内超微结构有轻微变化.结论重组腺病毒hCD80rAd可以有效地将hCD80基因导入肿瘤细胞而不会引起明显的生物学特性改变,制备肿瘤疫苗是可行的.
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灭活草分枝杆菌雾化吸入对过敏性支气管哮喘患者外周血及诱导痰中B7分子的影响
探讨单核细胞B7分子在雾化吸入灭活草分枝杆菌防治过敏性支气管哮喘中的作用.正常对照组15例(A组),27例尘螨过敏性轻、中度持续期支气管哮喘患者随机分为常规治疗组(B组,13例)和雾化吸人组(C组,14例),B组吸入沙美特罗替卡松粉吸入剂;C组雾化吸入灭活草分枝杆菌,两组患者分别在治疗前、治疗第6天、第31天检测肺通气功能、流式细胞术检测外周血和诱导痰中CD80+、CD86 +单核细胞占CD14+单核细胞百分率.结果显示B、C两组外周血CD80表达率均高于A组(P值均＜0.01)、第31天比治疗前降低(P值均＜0.01);CD86表达率B、C组与A组无统计学意义,B、C两组治疗前后比较无统计学意义;B、C两组诱导痰中CD80、CD86表达率均比A组高(P值均＜0.01),与治疗前相比,第6天CD80、CD86表达率C组降低(P值均＜0.05);第31天CD80、CD86表达率B、C两组均显著降低(P值均＜0.05);哮喘患者外周血及诱导痰中单核细胞CD80、CD86表达率与FEV1、PEF呈中度负相关(P值均＜0.01).由此证明过敏性支气管哮喘患者外周血及诱导痰中B7分子表达增高,且与肺通气功能呈负相关;雾化吸入灭活草分枝杆菌可通过下调B7分子从而达到对过敏性支气管哮喘的防治.
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胶原诱导的关节炎小鼠脾脏髓样抑制细胞检测
研究髓样抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)在Ⅱ型胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠发病过程中的动态变化.使用牛Ⅱ型胶原建立DBA/1J小鼠CIA模型并进行关节炎指数评分.在CIA诱导的第21d、28d、35 d、40 d和45 d,采用流式细胞术检测CIA小鼠及正常对照小鼠脾脏中CD11 b+ Gr-1+的MDSC比例动态变化.采用流式细胞术检测第35 d CIA小鼠和正常小鼠脾脏MDSC表面CD80、CD86和MHCⅡ分子的表达水平.结果发现,CIA造模小鼠脾脏中MDSC比例在第二次免疫时(第21d)即明显增高,至第28 d达高峰(P均＜0.05).CIA诱导第35天脾脏中MDSC比例和绝对细胞数较正常对照组明显升高(P＜0.05).CIA小鼠脾脏MDSC CD80和CD86的表达水平高于正常对照组(P＜0.05),但MHCⅡ的表达水平在模型组与正常对照组间无显著差别(P＞0.05).MDSC在CIA小鼠造模和发病过程中呈现规律性的变化,提示MDSC可能参与了类风湿关节炎发展的免疫病理过程.
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抗人CD80双价抗体的构建、表达及生物学功能初步研究
构建及表达抗人CD80双价抗体(dimeric antibody fragment,diabody),并初步研究其生物学功能.PCR法获得轻重链可变区基因,构建表达载体pIRES2-EGFP/diabody.将pIRES2-EGFP/diabody转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压,筛选稳定高表达细胞株,扩大培养并收集上清,经镍柱纯化,并经变性及非变性SDS-PAGE电泳对抗体分子的双体性进行鉴定.采用免疫荧光及流式细胞术(FCM)分析抗体与细胞膜型CD80分子的结合活性及与鼠源性亲本抗体4E5的竞争抑制效应;MTT法分析该抗体对天然高表达CD80的Raji细胞体外增殖的影响.结果:成功构建抗人CD80-diabody表达载体并含有编码信号肽和Gly4Ser连接肽的序列.获得了稳定分泌双价抗体的细胞株(命名为SA-Ⅲ),培养上清中纯化抗体的得率为50 mg/L,PAGE结果显示其为一个二聚体,Mr约为53 000(抗人CD80-ScFv Mr约为27 000).抗CD80-diabody与L929-CD80、Raji及Daudi的阳性结合率分别为96.5%、98.1%及93.0%;该抗体对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的抑制率为97.11%,对Raji细胞体外增殖的抑制率达31.27%.与单链抗体相比,亲和活性明显提高.成功建立了抗CD80 diabody CHO细胞的表达株,其分泌的抗体具有良好的生物学活性.
