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稳定表达的人GDNF基因对PC12细胞的分化作用研究
目的利用自行构建的BHK-hGDNF基因工程细胞,研究GDNF是否具有促进大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞分化的作用. 方法从人胎儿脑组织中提取总RNA,用RT-PCR的方法克隆人GDNF基因;利用Lipofecamine将构建的真核表达载体pTARGET/hGDNF(±)转染BHK-21细胞,在含有G418的选择培养基中筛选出稳定表达人GDNF的BHK-hGDNF基因工程细胞.用免疫组织化学的方法检测BHK-hGDNF基因工程细胞中人GDNF的表达.并且用BHK-hGDNF基因工程细胞培养的上清液培养PC12细胞,观察GDNF是否具有促进大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞分化作用. 结果构建的正向和反向真核表达载体pTARGET/hGDNF(±)的酶解消化和测序结果正确;用正向真核表达载体pTARGET/hGDNF(+)转染BHK-21细胞后免疫组织化学的结果证明BHK-hGDNF细胞能够表达人GDNF;BHK-hGDNF基因工程细胞培养上清液可以促进PC12细胞分化. 结论构建的BHK-hGDNF基因工程细胞中表达的人GDNF可以促进PC12细胞分化.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 基因工程细胞 细胞分化 -
微囊化人血管抑素基因工程细胞对人脐静脉内皮细胞增殖的影响
目的 了解海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate - polylysine - alginate,APA)微囊化人血管抑素基因工程细胞对人脐静脉内皮细胞(Huecv304)增殖的影响.方法 采用APA制备微囊包裹的表达人血管抑素(human angiostatin,hAS)的基因工程细胞(APA - hAS/293细胞微囊)或空载体转染的基因工程细胞(APA - 0/293细胞微囊).分别将上述两种细胞微囊以不同浓度与人脐静脉内皮细胞Huecv304细胞共培养,于培养0、24、48及72h时,以MTT法测定Huecv304细胞的增殖情况.结果 APA - hAS/293细胞微囊对共培养的Huecv304细胞的增殖具有明显的抑制作用(P＜0.01),且具有良好的量效关系.而对照组APA - 0/293细胞微囊对Huecv304细胞的增殖无明显抑制作用.结论 体外培养的表达人血管抑素基因的工程细胞的分泌物可以通过微囊膜并对人脐静脉内皮细胞的增殖产生显著的抑制效应.
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间充质干细胞与基因治疗
随着组织工程和基因工程技术的发展,细胞替代治疗和基因治疗是近年来医学领域乃至整个生命科学领域中的研究热点和前沿,其中一个很关键的问题是选择一种能满足要求以及来源容易的种子细胞.间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞.其作为基因工程细胞具有如下优越性:①MSCs来源广泛,易于分离培养,有增殖趋势,且生命周期长,体内外均能保持多向分化的潜能,遗传背景相当稳定;②离体细胞较易受外源遗传物质转染,并能长期稳定表达该遗传物质;③ MSCs经过转染和一定时间的体外培养后再输回体内仍能成活,并能迁移到病变部位;④MSCs移植从接受者自体获得,属同种移植,无免疫排斥反应,不涉及伦理问题.基于上述原因,间充质干细胞成为基因治疗的种子细胞之一,对于它的研究越来越多,现就间充质干细胞的分离培养鉴定及基因治疗的应用综述如下:
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hBcl-2基因修饰的骨髓基质细胞对体外培养PC12细胞的保护作用
目的 观察hBcl-2转染的骨髓基质细胞(MSCs)对体外培养PC12细胞的保护作用,为下一步hBcl-2修饰的MSCs脑内移植治疗奠定基础.方法 采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs,对培养第3代的MSCs进行鉴定;hBcl-2用脂质体转染MSCs建立MSCs-hBcl-2基因工程细胞;用H2O2建立PC12细胞氧化应激损伤模型;MTT法检测MSCs-hBcl-2基因工程细胞上清对体外培养的PC12细胞活性的影响.结果 成功培养出MSCs细胞,免疫组化结果显示培养的细胞CD44、CD71表达阳性,而CD45表达阴性;建立了有稳定高效hBcl-2表达的MSCs-hBcl-2基因工程细胞,并观察到MSCs-hBcl-2基因工程细胞较MSCs更能减轻PC12细胞的氧化损伤(P<0.05).结论 hBcl-2基因修饰的MSCs对PC12细胞的生长、生存有着重要的保护作用.
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神经干细胞移植治疗Alzheimer病的研究进展
阿尔茨海默病(AD)的神经干细胞(NSC)治疗目的是修复和替代受损神经细胞,重建细胞环路和功能.主要有2种途径:一是内源性途径,即诱导内源性神经干细胞增殖与分化,使损伤的中枢神经系统进行自我修复;二是外源性途径,即直接替代缺损组织或植入基因工程细胞,这一类细胞能分泌促进干细胞增殖与存活的因子.目前,还没有应用NSC治疗人类AD获益的证据,尚缺乏足够的证据来评价NSC移植在人类神经功能恢复方面所起的作用.
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GDNF的基因结构、信息传递及神经保护作用
胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)是TGF-β家族的一个新亚族，该亚族还有新发现的三个成员：Neurturin (NTN)、Persephin (PSP)和Artemin (ART)，它们均不程度地对多巴胺神经元、脊髓前角运动神经元、背根神经节、颈上神经节以及肾等非神经元细胞都具有生长促进作用。GDNF基因位于5p12-13.1，全长约28～30kb，由三个外显子和两个内含子构成，转录后形成4.6kb的mRNA，其中编码区全长636bp，超始密码子在第二个外显子上，编码的GDNF前体蛋白为211个氨基酸残基(其中信号肽19个氨基酸)，酶解后形成134个氨基酸的成熟多肽。GDNF受体系统由膜外糖磷酯酰肌醇(GPI)偶联的直接与GDNF结合的受体GFR(GDNF family receptor)和跨膜的酪氨酸激酶Ret两部分构成。研究表明将GDNF向纹状体、黑质或脑室内直接注射；胚胎中脑组织用GDNF处理后植入脑内；GDNF转基因工程细胞脑内移植；用腺病毒、腺相关病毒介导的GDNF cDNA直接注入脑内等不同方式给予帕金森病模型动物，可以改善这些动物的PD症状。
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体外培养下可持续分泌人血管抑素和内皮抑素基因工程细胞对血管生成的抑制效应
背景:以往实验构建了可持续分泌人血管抑素和内皮抑素的基因工程细胞,即人血管抑素/293细胞和人内皮抑素293细胞,并已证明可持续分泌人血管抑素蛋白和人内皮抑素蛋白.但尚不了解其分泌物是否能发挥血管生成的抑制作用.目的:观察以基因工程技术构建的人血管抑素/293细胞和人内皮抑素,293细胞对鸡胍尿囊膜血管新生的抑制效应.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-0612007-01在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学研究室完成.材料:Hek/293细胞为人胚胎肾细胞,由解放军军事医学科学院提供.人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞由课题组前期构建.SPF级鸡胚购自北京维通利华实验动物有限公司.方法:将鸡胚消毒后,置于37℃无菌恒温箱中孵育5 d,在距胚头1 cm两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位磨切暴露尿囊膜,制成假气室,用无菌滤纸封闭窗口.制成鸡胚尿囊膜模型,备用.用灭菌蒸馏水配制体积分数为0.5%甲基纤维素溶液,制成甲基纤维素小杯.卵壳开窗后第3天,分别吸取浓缩的293细胞、人血管抑素/293细胞、人内皮抑素/293细胞培养上清液各20 μ L.或人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞培养上清液各10 μ L,加于甲基纤维素小杯中,将其置于鸡胚 尿囊膜的两条大血管之间的无血管区.主要观察指标:观察尿囊膜血管生成的变化.结果:共培养9 d时,与单纯293细胞上清液组相比,人血管抑素/293细胞上清液或人内皮抑素/293细胞上清液组,甲基纤维素小杯内及邻近区的鸡胚尿囊膜血管明显发育不良,血管分布稀疏,数量明显减少,其一级血管数量盟未明显减少,但其管径较细,而二级血管和二级以下的血管数量明显减少、管径明显变细,伸入尿囊膜边缘区的血管数量减少,管径明显变细.与人血管抑素/293细胞组或人内皮抑素/293细胞组相比,人血管抑素/293细胞+人内皮抑素/293细胞组的一级血管数量和管径未见明显变化,而其二级血管和三级以下血管数量明显减少,血管树消失.结论:人血管抑素/293细胞和人内皮抑素/293细胞的分泌物对鸡胚尿囊膜的血管新生均具有明显的抑制作用,且联合用药抑制作用增强.
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人Maspin cDNA克隆在真核细胞中表达及意义
[目的]构建表达人Maspin的基因工程细胞.[方法]提取健康人乳腺组织的总RNA,扩增出编码Maspin的全长cDNA,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/Maspin,然后转染到正常的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,应用RT-PCR和Western blot方法分别验证Maspin基因在CHOI/pcDNA3.1(+)/Maspin细胞中RNA水平和蛋白水平的表达,同时检测细胞培养上清中Maspin的蛋白分泌.[结果]经酶切证实,得到正向插入的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/Maspin.Western blot分析证明Maspin成功转染到CHO中并表达,且分泌到细胞外.[结论]人Maspin基因可在靶细胞表达,并能分泌到细胞外,为进一步了解Maspin的功能和转Maspin基因细胞成为治疗恶性肿瘤的效应细胞奠定了一定的基础.
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脑源性神经营养因子基因修饰骨髓基质细胞对体外培养小鼠螺旋神经元的影响
目的探讨人脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因工程细胞的建立及其对体外培养的小鼠螺旋神经元生长活性的影响.方法参照分子克隆技术成功构建BDNF真核表达载体--pcD-NA3.1(-)-BDNF,体外证实BDNF基因转染猿猴病毒40肝脏转化细胞(COS7)后正常表达,将骨髓基质细胞分离培养,体外转染骨髓基质细胞建立BDNF基因工程细胞,观察该基因工程细胞对体外培养小鼠螺旋神经元的生长活性的影响.结果成功构建BDNF基因真核表达载体,并且建立了BDNF基因工程细胞;在体外BDNF基因工程细胞能促进螺旋神经元的生长,并保护螺旋神经元免受氧化损伤.结论建立的BDNF基因修饰的骨髓基质细胞,对体外螺旋神经元生长、生存起着重要的保护作用,为进一步研究基因修饰的骨髓基质细胞内耳移植奠定了重要的基础.
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帕金森病与基因工程细胞移植
细胞基因工程技术发展为治疗诸如帕金森病等神经细胞变性疾病提供了广阔的前景，人们开始考虑移植基因工程细胞，例如胚胎多巴胺能细胞移植，转基因的原代细胞包括原代非神经细胞和原代神经细胞移植，以及神经干细胞移植，把它作为生物微泵以产生治疗因子，以期能恢复或改善黑质纹状体多巴胺系统功能。胚胎组织移植对于不断增加的病人数来说显得并不太可行。人们正在研究这些决定成人大脑中神经干细胞分化的刺激信号。也许不久的将来，转基因的原代细胞和神经干细胞就可以广泛用于治疗。
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神经干细胞分化的基因决定及基因工程化神经干细胞的应用前景
20世纪90年代初以来,科学家们相继从各种动物及人的中枢神经系统(CNS)内分离培养了具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞(NSCs),打破了传统观点认为CNS细胞不能再生的观念,为CNS损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希望.目前已知,NSCs的分化受内在的遗传信息和外在的多种因素调控,而非对称性分裂是决定干细胞分化的调节因素之一.NSCs在体内能够沿着即定的路线增殖发育成各种神经细胞主要是受基因调控的.随着基因工程技术的发展,人们可以根据不同的科研及治疗目的,对NSCs进行不同的遗传学修饰,以制成基因工程细胞,这些细胞极具有科研和应用价值,受到广泛关注.本文就决定NSCs分化的内在遗传因素和基因工程化NSCs的应用前景做一综述.
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大鼠基因工程化神经干细胞的建立
自从九十年代初科学家们分离、培养出神经干细胞以来,人们相继从各种动物及人的中枢神经系统内分离、培养了神经干细胞,因其具有很强的分裂、增殖及自我更新能力,打破了传统的认为中枢神经系统细胞不能再生的观念,为中枢神经系统损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希望.随着基因工程技术的发展,人们可根据不同的科研及治疗目的,对神经干细胞进行不同的遗传学修饰、以制成基因工程细胞,这些细胞极具科研和应用价值,受到广泛关注.本实验利用无血清培养技术,分离、培养了胚鼠端脑神经干细胞,并用巢素(Nestin)免疫组化染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经丝-200(NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 免疫组化染色鉴定分化细胞.再用含有脑源性神经营养因子(BDNF)的复制缺陷型腺病毒感染神经干细胞,并用原位杂交检测.结果显示:①获得了大量未分化,呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,且能诱导分化为神经元和神经胶质细胞.②约80-90%神经干细胞能被腺病毒感染,经传代培养12代后仍具干细胞特性.因此,本实验从胚鼠端脑分离培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞.经基因工程化及传代后 ,仍具干细胞特性,获得了大量基因工程化的神经干细胞,以期为神经干细胞的基础研究和中枢神经损伤修复及疾病治疗提供基础资料.
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细胞微囊技术及其在基因治疗领域的研究进展
利用重组工程细胞进行基因治疗无疑为多种难治性疾病的有效治疗提供了新的思路,但宿主对异源细胞产生的移植排斥反应却是其在临床上应用的主要障碍.现代细胞微囊技术因其具有良好的免疫隔离屏障作用,使克服这一障碍成为可能.近年来,细胞微囊技术在基因治疗方面的发展迅速,已在血友病,帕金森病、肿瘤等多种难治性疾病的治疗应用中显示出广阔的应用前景.本文就细胞微囊技术的微囊膜材料、制作工艺、微囊内重组细胞的构建以及其在基因治疗方面的研究作一综述.
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hTNFα／CHO基因工程细胞的构建及其分泌蛋白功能的检定
目的：构建能够持续分泌人肿瘤坏死因子（ hTNFα）的中国仓鼠卵巢细胞（ CHO）基因工程细胞hTNFα／CHO细胞系，并且观察其分泌功能的变化。方法应用载体GV141构建携带hTNF基因表达的质粒；采用脂质体转染法，经G418筛选稳定转染细胞株；通过Real-Time PCR鉴定其基因表达，采用ELIAS法鉴定其蛋白分泌情况。结果经序列比对，证明GV141-hTNFα表达载体构建成功，Real-Time PCR证明转染细胞系包含hTNFα目的基因，ELIAS鉴定结果证明该细胞系可以在一定代数稳定持续内分泌hTNFα。结论构建的hTNFα／CHO细胞系可以在一定代数内稳定持续地分泌人肿瘤坏死因子。
