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重组腺病毒介导CD自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用
目的 观察重组腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）基因和人野生型p53基因共转染对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用携带CD/p53、CD、p53基因腺病毒感染直肠癌细胞SW837，计数瘤细胞集落数，采用四唑蓝比色(MTT法)检测瘤细胞存活率。于60只裸鼠移植瘤内注射重组腺病毒、磷酸盐缓冲液(PBS)，测定肿瘤生长抑制率。结果 用CD/p53、CD、p53重组腺病毒感染SW837细胞，加5-FC后细胞集落形成分别为：6、38、69。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为78.6%、56.5%、22.3%。CD/p53重组腺病毒感染组肿瘤细胞集落形成和存活率下降显著（P＜0.01），对肿瘤的抑制作用明显。结论 CD自杀基因与野生型p53基因共转染对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。
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hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用
目的 构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体,研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用.方法 PCR扩增hTERT核心启动子片段,克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic,检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性.构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERT-CD:UPRT,将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA 3.1-CD:UPI汀用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞,筛选稳定表达细胞系,用RT-PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5-FC对转染细胞的杀伤作用.结果 成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%,而在HLF细胞中仅有背景活性.成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达裁体,转染pcDNA 3.1-CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转粢hTERT-CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达,且对5-FC敏感;而转染hTERT-CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达,对5-FC不敏感.结论 构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5-FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞.
关键词： 人端粒酶逆转录酶启动子 胞嘧啶脱氨酶 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 胃癌 靶向基因治疗 -
CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究
目的:探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用.方法:采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞,G418筛选获得抗性克隆(取名为U251/CD细胞),使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞,MTT法测定活性细胞比率.采用高效液相色谱法(HPLC)检测5-FC培养液内5-FU的浓度.结果:U251细胞获得了质粒的成功转染.基因转染使G418抗性细胞(U251/CD细胞)对5-FC高度敏感.未转染的U251细胞对5-FC不敏感,IC50 约为6 500 μmol/L,而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L.并且加入不同浓度的5-FC后,U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU.结论:5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用;为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据.
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转自杀基因CD的LoVo细胞死亡机制的研究
目的研究转染逆转录病毒载体(G1CEACDNa)的肠癌细胞LoVo株的死亡机制.方法脂质体法转染G1CEACDNa至LoVo细胞.TRIzol试剂提取总RNA,行RT-PCR间接验证CD基因的表达情况.用含1mmol·L-115-FC的1640培养基培养细胞,MTT法测细胞生长曲线和旁观者效应;透射电镜观察细胞的超微结构;流式细胞仪annexin Ⅴ和PI双重染色行凋亡相关检查.结果RT-PCR产物电泳显示在1.5kb处可见相应的显影条带.MTT比色实验示1mmol·L-15-FC作用下CD+LoVo细胞48h开始生长抑制,72h、96h、120h抑制率分别约为30%、50%、80%.电镜下可见凋亡的早、中、晚期细胞及凋亡小体,同时可见部分细胞呈坏死改变.流式细胞仪显示48h开始有少量细胞出现凋亡,72h、96h细胞群凋亡和坏死的比例分别为23.8%、35.1%和20.4%、26.0%.结论转染G1CEACDNa的LoVo细胞给予5-FC治疗,其细胞死亡机制为坏死和凋亡并存,凋亡相关过程的诱导可能是该治疗过程中旁观者效应的重要机制.
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双自杀基因HSV-tk/CD对胆管癌体内体外旁观者效应的研究
目的研究双自杀基因HSV-tk/CD的体内外旁观者效应.方法在体外将tk/CD阳性的胆管癌QBC939细胞与亲本细胞按不同的比例混合,并与单自杀基因组对照,观察给予前体药物后对混合细胞的生长抑制情况.建立荷瘤裸鼠模型,在瘤体内注入不同数量的tk/CD阳性胆管癌细胞,观察给予前药后的旁观者效应.结果融合基因组在体外产生明显强于单基因组的BSE,tk组的BSE出现较晚,阳性细胞的比例需达到40%,而CD组和融合基因组中,阳性细胞仅占20%时,就可观察到明显的BSE.体内实验也观察到BSE,强度与注入阳性细胞数有关(P＜0.05);本研究没有观察到"远处旁观者效应".结论腺病毒介导的双自杀基因HSV-tk/CD在体外和体内均可产生旁观者效应.
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胞嘧啶脱氨酶基因修饰的结肠癌细胞瘤苗抗肿瘤研究
目的 研究胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)自杀基因修饰的结肠癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用.方法 用含EC-CD基因的逆转录病毒质粒pLCDSN将人EC-CD基因转导入鼠结肠癌细胞株CT26,用G418进行筛选,得到抗性克隆CT26/CD,比较CT26/CD与野生型CT26的成瘤性,评价CT26/CD对野生型CT26细胞肝转移模型的治疗作用.结果 CT26/CD能在含0.6 g/L G418的培养液中稳定生长;RT-PCR证实EC-CD基因在CT26/CD中表达;CT26/CD细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性明显增加(P=0.000),且具有良好的旁观者效应;CT26/CD的成瘤性与野生型CT26相似(P=0.892);CT26/CD联合5-FC对野生型CT26的肝转移有明显抑制作用,明显延长了荷瘤小鼠存活期(P=0.000).结论 EC-CD基因修饰的结肠癌细胞瘤苗有一定的抗肿瘤作用.
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温热疗法增强前药氟胞嘧啶对转基因结肠癌细胞株的杀伤作用
目的探讨温热疗法能否增强前药 5-氟胞嘧啶 (5- fluorocytosine,5- FC)对转染组织特异性胞嘧啶脱氨基酶( cytosine deaminase,CD)基因的结肠癌细胞 SW480的靶向性杀伤作用及其机制.方法将转染 G1CEACDNa之结肠癌 SW480细胞接种到 96孔细胞培养板中,同时加入含各种浓度梯度的前药 5- FC.实验组以水浴加温法在 43℃下热处理 30 min,对照组不加热.第 8 d去除培养液,以 MTT法测定活细胞比率,分析前药 5- FC联合温热疗法对转 CD基因结肠癌 SW480细胞的杀伤作用,并以流式细胞仪分析热化疗对肿瘤细胞周期的影响,透射电镜观察热化疗前后肿瘤细胞形态学改变.结果实验组细胞的杀伤率明显高于对照组 (P< 0.05,t=2.403,n=9);流式细胞仪检测显示实验组 S期细胞比例明显增高 (P< 0.001,t=7.158,n=6);透射电镜观察下显示实验组细胞膜微绒毛消失,边缘变平直,细胞核皱缩,染色质聚集在核模下.结论温热疗法能明显提高转 CD基因结肠癌 SW480细胞对前药 5- FC的敏感性;两者联用能使转 CD基因结肠癌 SW480细胞产生 S期阻滞,从而促进细胞凋亡.
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胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞及其表达研究
目的 探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞的方法及其表达效果.方法 采用脂质体法将CD基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞,G418筛选阳性克隆(U251-CD),采用RT-PCR、免疫细胞化学染色、流式细胞仪(FCM)凋亡分析和高效液相色谱(HPLC)等方法检测CD基因的表达及其功能.结果 CD基因成功转染U251细胞,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR证实阳性细胞有CD基因表达,抗-CD-抗体免疫细胞化学法显示细胞浆染色阳性,U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后,FCM显示细胞凋亡峰,HPLC可检测到5-FC培养液内有5-氟尿嘧啶(5-FU)产生.结论 CD基因能够在U251细胞表达,并具备将5-FC转变为5-FU的功能,造成肿瘤细胞凋亡,CD-5-FC系统可作为恶性脑胶质瘤辅助治疗手段之一.
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IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞IgA类别转换基因表达变化
目的 研究脂多糖(LPS)或溶血性链球菌(HS)刺激IgA肾病和非肾脏疾病慢性扁桃体炎患者腭扁桃体单个核细胞Iα-Cα胚系转录本、激活诱导的胞嘧啶脱氨酶(AID)mRNA和蛋白的表达,以探讨IgA肾病腭扁桃体单个核细胞IgA及IgA1产生异常的分子机制.方法 入组2009年1月到2010年2月在我院住院的IgA肾病患者27例,非肾脏疾病慢性扁桃体炎患者27例作为对照.通过单个核细胞分离液和密度梯度离心法分离出腭扁桃体单个核细胞.IgA肾病组及非肾脏疾病慢性扁桃体炎组腭扁桃体单个核细胞分别分为3组:LPS刺激组,HS刺激组和未刺激组.ELISA法检测培养上清中IgA和IgA1的浓度.实时PCR检测Iα-Cα胚系转录本和AID mRNA的表达；Western印迹检测AID蛋白的表达.结果 IgA肾病组腭扁桃体单个核细胞IgA和IgA1的分泌,特别是IgA1/IgA较慢性扁桃体炎组显著增加(P＜0.05),Iα-Cα和AID mRNA和AID蛋白的表达较慢性扁桃体炎组显著增加(均P＜0.05).IgA肾病组腭扁桃体单个核细胞IgA和IgA1的水平在刺激后明显增加(P＜0.05)；Iα-Cα和AID mRNA的表达明显上调(均P＜0.05)；AID蛋白表达明显增加(LPS刺激组P＜0.05,HS刺激组P＜0.01).结论 LPS和HS均能够诱导IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞IgA和IgA1的分泌、AID和Iα-Cα的表达增加,提示IgA肾病患者腭扁桃体IgA和IgA1的分泌增加可能与IgA类别转换相关基因AID和Iα-Cα高表达有关.
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腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌
目的探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较.方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因.建立C57BL/6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷(GCV)或/和5-氟胞嘧啶(5-FC)治疗后肿瘤体积及组织学变化.结果PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因.腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV+5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小(P=0.00),腺病毒注射联合GCV+5-FC有协同作用(P=0.04),优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC.基因治疗后肿瘤细胞大片坏死,对照组细胞形态无变化.结论腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或/和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK/(GCV+5-FC)系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK/GCV或CD-TK/5-FC系统.
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含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察
目的应用AdEasier-1系统高效制备含血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒并观察其体外肿瘤杀伤作用.方法以JM109细菌基因组为模板,PCR扩增出含HindⅢ/BamH Ⅰ酶切位点的CD基因,亚克隆到pREP8,继而用HindⅢ/XbaⅠ切出含pA加尾信号的CD基因,插入到预先构建的含VEGF启动子的转移质粒pAdtrack-VEGFP构建pAdtrack-VEGFP-CD.经Pme Ⅰ线性化后转化AdEasier-1细菌,用25 μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和Pac Ⅰ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CD.经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-CD,行PCR鉴定.通过测定细胞克隆形成率和细胞存活率观察重组腺病毒对体外培养的LoVo细胞的细胞毒作用.结果构建重组腺病毒质粒的成功率为70%(7/10).包装扩增后重组腺病毒的滴度为4.8×1012CFU/ml,PCR扩增结果与预期相符.在前药5-氟胞嘧啶存在下,重组腺病毒对LoVo具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞存活率都明显下降.结论应用AdEasier-l系统可以成功制备含VEGF启动子驱动CD自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用.
关键词： 腺病毒 胞嘧啶脱氨酶 基因治疗 血管内皮细胞生长因子 同源重组 -
Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究
目的 探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果.方法 利用Survivin启动子替换pEGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体pSurP-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在pSurP-EGFP中,构建成重组载体pSurP-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡.结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果.结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果.
关键词： Survivin启动子 自杀基因 胞嘧啶脱氨酶 5-氟胞嘧啶 -
CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较
[目的]探讨CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)与胸苷激酶(thymidine kinase,TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因.[方法]以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组,未转染者为对照组,5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-Fc)组系列质量浓度:10、8、6、4、2、0μg/mL;更昔洛韦(ganciclovir,GCV)组系列质量浓度:5、4、3、2、1、0μg/mL;两药联合应用的系列质量浓度:(10+5)、(8+4)、(6+3)、(4+2)、(2+1)、0μg/mL.光镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate,GIR)及半数抑制浓度(IC50).病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养,给予5-Fc5μg/mL或/和GCV 10μg/mL,噻唑蓝法测定细胞GIR.[结果]对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低,5-Fc组IC50为2 400 μg/mL,GCV组为3 500μg/mL.实验组随5-Fc与GCV剂量增加,对细胞的杀伤作用明显增加,5-Fc组IC50为5.75μg/mL,GCV组为3.50 μg/mL,两者同时应用相当于5-Fc1.90 μg/mL+GCV 0.95 μg/mL,细胞对5-Fc的敏感性提高417.4倍,对GCV的敏感性提高1 000倍.病毒杀伤Lovo细胞具有明显的"旁观者"效应,联合应药组的"旁观者"效应明显高于单独应用组.[结论]双自杀基因细胞毒效应以及"旁观者"效应均高于单一自杀基因.
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白介素18和胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌的联合基因治疗
目的观察白介素18和胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌MM45T.Li联合基因治疗的效果. 方法将小鼠IL-18基因克隆入pGCEN中,构建成pGCEN/IL-18.包装成逆转录病毒,感染小鼠肝癌细胞MM45T.Li, 制出具有生物活性的MM45T.Li/IL-18瘤苗,灭活后对荷瘤小鼠进行皮下接种.同时利用AdCD/5FC对小鼠肝癌原位注射,进行联合基因治疗. 结果在接受治疗30d后,MM45T.Li对照组肿瘤体积1580～1625mm3,MM45T.Li/IL-18治疗组(366±159)mm3,AdCD/5FC治疗组(438±65)mm3,IL-18和AdCD/5FC联合治疗组体积(15±7)mm3(P＜0.05).MM45T.Li对照组中位生存期50.0～51.5d,MM45T.Li/IL-18治疗组65d,AdCD/5FC治疗组57d,联合治疗组76d,和单独治疗组相比,联合治疗组中位生存期明显延长(P＜0.05).联合基因治疗组肿瘤组织周围有更多CD4+及CD8+淋巴细胞浸润. 结论 IL-18和CD基因的联合治疗组,其疗效要明显好于IL-18或CD基因单独治疗组.进行联合基因治疗,既有效地减少了肿瘤负荷,又充分调动了机体的抗肿瘤免疫,提高了疗效.
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腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌的治疗
目的：探讨腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌的基因治疗效果。方法：分离纯化AdCD，体外实验观察IC50，旁观者效应及凋亡现象。在体内，AdCD瘤内注射并腹腔注射5FC，观察AdCD/5FC系统对肝癌荷瘤小鼠的抗肿瘤效应。 结果：当MOI=100时，AdCD感染的MM45T.Li细胞对5FC敏感，IC50＜50μmol/L。当AdCD感染的MM45T.Li细胞占10%时，可有72%细胞死亡，AdCD/5FC系统对MM45T.Li细胞有明显的旁杀伤效应。TUNEL检测及Hoechst 33258荧光染色证实AdCD/5FC系统可以诱导部分MM45T.Li细胞凋亡。荷瘤小鼠经过治疗21d后，各对照组肿瘤体积均数为2303～2943mm3，治疗组AdCD/5FC组肿瘤体积（365±81）mm3，AdCD/5FC系统治疗小鼠肝癌，可以明显减小肿瘤体积（F＝20.33，P＜0.05＝。对照组中位生存期41～43d，治疗组中位生存期49d。 结论：AdCD/5FC系统对小鼠肝癌有明显的治疗作用。
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超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因对肺癌细胞的杀伤作用
目的:探讨超声微泡联合pDsRed2-N1-CD/UPRT融合自杀基因在肺癌A549细胞中的表达水平及其杀伤作用.方法:提取前期构建的pDsRed2-N1-CD/UPRT质粒,转染肺癌A549细胞,分为A组:空白对照组；B组:脂质体+质粒；C组:超声照射+脂质体+质粒；D组:超声照射+微泡+脂质体+质粒.荧光显微镜下观察质粒的转染情况,免疫细胞化学法及Western blot法检测胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase,CD)、尿嘧啶磷酸核糖转移酶(Uracil phosphoribosyltransferase,UPRT)在各组细胞中的蛋白表达水平,MTT法检测超声微泡联合CD/UPRT质粒对肺癌A549细胞的生长抑制作用.结果:超声微泡能提高A549细胞中CD/UPRT质粒转染率达(54.8±2.59)％.免疫细胞化学与Western blot结果均显示联合超声微泡后CD、UPRT蛋白表达明显增加(P＜0.05).在前体药物5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)作用下,CD/UPRT质粒转染对细胞有一定的杀伤作用,联合超声微泡后,细胞的生长抑制率明显升高(P＜0.05).结论:超声微泡能提高CD/UPRT质粒在肺癌A549细胞中的转染率及CD、UPRT在细胞中的蛋白表达,从而增强CD/UPRT对肺癌A549细胞的杀伤作用.
关键词： 超声微泡 自杀基因 胞嘧啶脱氨酶 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 肺癌 -
胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究
目的探讨胞嘧啶脱氨酶(Cytimidine deaminase, CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达.方法通过构建真核表达质粒pCMVCD,限制性内切酶消化鉴定后,采用Lipofectamine 2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞(Neural stem cells, NSCs),G418筛选阳性克隆,加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Flourocytosine, 5-FC),MTT比色法测定NSCs的生存率.结果本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞,并将CD基因成功地转染了神经干细胞,G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感.结论 CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗研究提供依据.
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HSV-tk/CD融合基因杀伤人胆管癌细胞QBC939的体内实验
目的研究单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/胞嘧啶脱氨酶(CD)融合基因在动物体内对人胆管癌的杀瘤作用.方法构建人胆管癌的裸鼠皮下移植瘤动物模型,按排序法随机分为4组,每组8只.对照组,每只裸鼠腋部瘤体内注入不含自杀基因的腺病毒液0.1 ml,CD基因组、tk基因组和HSV-tk/CD融合基因组,在每只裸鼠腋部瘤体内分别注入CD基因、tk基因及HSV-tk/CD融合基因的重组腺病毒液0.1 ml.注射后24 h每只裸鼠腹腔内注射5-氟胞嘧啶(5-flurocytosine, 5-FC)和丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV),观察肿瘤的生长情况.结果 CD基因组、tk基因组及HSV-tk/CD融合基因组肿瘤的生长均受到不同程度的抑制,与对照组比较,抑制率分别为41.2%、55.7%和70.7%,P均＜0.05; 病理组织学检查显示,对照组肿瘤生长良好,细胞分裂相多见; 其余各组出现不同程度的肿瘤坏死,这种现象以HSV-tk/CD融合基因组为明显.结论 HSV-tk/CD融合自杀基因在胆管癌细胞体内也具有较强的杀瘤活性,但作用不够彻底,可能与旁观者效应(bystander effect, BSE)的效应强度有关.
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PMG-36e-CD::upp重组质粒的构建及鉴定
目的:探讨利用分子生物学基因重组技术构建PMG-36e-CD::upp自杀基因重组质粒的方法.方法:用小量制备质粒DNA的方法分别提取表达型质粒载体PMG-36e和自杀基因pORF-CD::upp,以质粒pORF-CD::upp为模板PCR扩增CD::upp基因,表达型质粒载体PMG-36e与自杀基因CD::upp分别用限制性内切酶Sac Ⅰ与Sal Ⅰ进行双酶切,T4DNA连接酶16℃恒温水浴过夜连接,转化入感受态JM109,筛选单克隆提取重组质粒PMG-36e-CD::UPP进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,双酶切鉴定,PCR鉴定,及测序鉴定.结果:重组质粒PMG-36e-CD::upp经1%琼脂糖凝胶鉴定,分子量为5.5Kb,与其标准分子量大小一致;重组质粒PMG-36e-CD::upp经双酶切鉴定及PCR初步鉴定构建成功;送上海生物工程技术服务有限公司测序认证,同源性达100%.结论:重组质粒PMG-36e-CD::upp可成功构建,可用于后续实验的表达研究.
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婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建
目的构建婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统.方法 PCR扩增胞嘧啶脱氨酶(CD)基因, TSS法在大肠杆菌JM109中扩增pGEX-1LambdaT质粒, EcoRⅠ和BamHⅠ对CD基因和pGEX-1LambdaT质粒分别进行双酶酶切.琼脂糖电泳凝胶分离并切取其中4.9 kb和1.3 kb两个片段长度的凝胶.凝胶DNA提取试剂盒提取其中所含的DNA片段,T4 DNA连接酶连接这两个片段,后用电穿孔法将重组片段转染婴儿双歧杆菌,并挑选阳性菌落,提取质粒双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测.结果应用电穿孔法转染婴儿双歧杆菌,获得含6.2 kbp重组质粒的阳性转染婴儿双歧杆菌.结论成功构建婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统.
