弓形虫新基因表位疫苗免疫效果的观察

目的 观察弓形虫新基因WX、WX2的表位疫苗对小鼠的保护作用.方法 将昆明小鼠分成5组,分别用pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b4a质粒及pcDNA3和NS,肌注3次,每次间隔2周.免疫完成后ELISA法检测血清抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测CD4+与CD8+淋巴细胞比值,PCR检测肌肉组织中重组质粒.免疫后第3周,小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察发病情况和存活时间.30 d后仍存活的小鼠,取组织匀浆后进行小鼠盲传.结果 免疫后第3周,pcDNA3-W2b组小鼠血清抗体水平显著高于pcDNA3和NS对照组( P ＜0.05);用PCR法从pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a和pcDNA3-W2b4a质粒组小鼠肌肉组织中成功检测到各表位疫苗质粒,且各组小鼠脾脏CD4+与CD8+T淋巴细胞比值显著低于pcDNA3组和NS组( P ＜0.05).pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2b4a 组小鼠存活时间与pcDNA3组及NS组比较明显延长( P ＜0.05).结论 弓形虫新基因WX、WX2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示DNA类表位疫苗的研制可作为弓形虫疫苗研究的策略之一.

弓形虫新基因表位疫苗质粒的构建及鉴定

目的 构建两个弓形虫新基因2B9G1、7C3-C3的表位疫苗质粒,为阐明表位疫苗的保护性奠定基础.方法 采用生物信息学方法对新基因2B9G1、7C3-C3进行表位预测,PCR扩增基因中编码3个表位的片段W2b、W2a和W4a,连接入pcDNA3,转入DH5α,挑阳性菌落进行PCR、酶切和测序鉴定;同法将W2a、W4a分别克隆入pcDNA3-W2b载体中W2b片段下游,再将W4a克隆入pcDNA3-W2b2a载体中W2a片段下游.结果 经PCR、酶切鉴定及序列测定,W2b、W2a和W4a 3个片段分别插入pcDNA3预期位置;W2a和W4a片段分别插入pcDNA3-W2b预期位置;W4a片段插入pcDNA3-W2b2a预期位置.结论成功构建单表位、双表位、多表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b4a、pcDNA3-W2a2b4a.

细粒棘球蚴Eg95重组表位蛋白的免疫特性研究

目的 研究Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3表位蛋白的抗原性,为细粒棘球蚴多表位疫苗的研制奠定基础. 方法 构建细粒棘球蚴Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3抗原原核表达载体并体外诱导表达重组蛋白,纯化后免疫家兔,制备Eg95抗原多克隆抗体,采用Western blot检测Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3抗原与Eg95多抗的反应性;分别用重组蛋白Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测小鼠血清特异IgG水平,MTT法检测脾淋巴细胞增殖. 结果 用Western blot检测重组蛋白Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3均能与Eg95多抗血清反应,以Eg95-2和Eg95-3反应性较强.用Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3重组抗原免疫小鼠后,随着免疫次数的增加和时间的延长,小鼠血清IgG水平升高,小鼠脾淋巴细胞在体外经ConA和Eg95抗原刺激诱导发生增殖. 结论 构建的3个表位均为Eg95的有效抗原表位,用重组抗原Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3免疫小鼠后均可诱导以产生IgG为主的体液免疫应答,因此构建的3个表位蛋白抗原可用于细粒棘球蚴多表位肽疫苗的研制.

以HBc颗粒为载体的真核表达载体pcDNA3.1-HBcNheⅠSpeⅠ的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBcNheⅠSpeⅠ,为预防性及治疗性表位疫苗的研制打下基础.方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc-core的HBcAg e1-loop及e2-loop内分别添加NheⅠ及SpeⅠ酶切位点,双酶切此重组载体pTrc-core NheⅠSpeⅠ及真核表达载体pcDNA3.1,产物经纯化、连接,构建成真核表达质粒pcDNA3.1-HBc NheⅠSpeⅠ,并通过酶切、PCR及测序对该质粒加以鉴定.为了证实质粒pcDNA3.1-HBcNheⅠSpeⅠ作为表达载体的可行性,实验中以GFP为报告基因,利用基因重组技术在该质粒的基础上构建了真核表达质粒pcDNA3.1-HBc-GFP,并将其转染HeLa细胞,共聚焦显微镜观察HeLa细胞内绿色荧光蛋白的表达情况.同时将质粒pcDNA3.1-HBc-GFP转化大肠杆菌JM109,密度梯度离心回收并纯化其表达产物HBcAg-GFP,电镜下观察其成颗粒性.结果酶切、PCR及测序结果均与预期结果相符,共聚焦显微镜下观察到HeLa细胞内绿色荧光蛋白的成功表达.电镜下观察到重组蛋白HBcAg-GFP为颗粒性蛋白.结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-HBc NheⅠ SpeⅠ,该载体可作为治疗性及预防性DNA疫苗的候选载体,为深入研究预防性及治疗性表位疫苗提供了资料.

匹多莫德增强弓形虫新基因wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保护研究

目的 探讨匹多莫德增强弓形虫新基因wx2b4a表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果.方法 将昆明小鼠分成4组,分别用pcDNA3-W2b4a质粒、pcDNA3-W2b4a+匹多莫德、pcDNA3及生理盐水肌注3次.ELISA法检测血清IgG抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,末次免疫后第4周,小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察小鼠生存时间.结果 pcDNA3-W2b4a+匹多莫德组、pcDNA3-W2b4a组小鼠血清IgG抗体水平显著高于pcDNA3组和生理盐水对照组(P＜0.05)；各免疫组小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞数量显著高于对照组(P＜0.05)；pcDNA3-W2b4a+匹多莫德组CD4+T细胞数量、CD4+/CD8+比值高于pcDNA3-W2b4a组(P＜0.05).小鼠攻击试验表明,pcDNA3-W2b4a+匹多莫德组小鼠存活时间明显长于对照组和pcDNA3-W2b4a组(P＜0.05).结论 匹多莫德可增强弓形虫新基因wx2b4a表位疫苗诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫.

CEA的多表位疫苗基因的设计及构建的表达载体在原核表达系统中的表达

目的 本研究设计肿瘤相关抗原CEA的多表位疫苗基因和构建的重组表达载体在原核表达系统中成功表达融合蛋白.方法 根据预测分析得到的表位氨基酸序列,选取预测分值较高的CTL表位(IMIGVLVGV)和B细胞表位(SNNSKPVEDK),并结合“非选择性”辅助T细胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串联起来,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,委托生物技术公司合成寡核苷酸,退火获得目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内.将此重组载体转化E.coli BL21(DE3)表达融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表位融合蛋白ozlf-86/87.结果 嵌合有多表位目的基因的原核重组质粒pET32a(+)/ozlf-86/87,进行酶切和测序鉴定,构建成功.SDS-PAGE分析表明,重组质粒在37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20kDa,与预期Mr大小吻合；蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％.,并经Western blot鉴定为目的蛋白.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化成功获得表位融合蛋白,即ozlf-86/87,纯度达到90％以上.结论 本研究获得的多表位融合蛋白对胃肠道恶性肿瘤诊断试剂的研究和进一步的疫苗研究奠定了基础.

禽流感病毒(H5N1型)血凝素(HA)T细胞抗原表位的预测

目的:应用免疫信息学的方法寻找不同来源的H5N1型禽流感病毒血凝素(HA)的共同抗原决定簇,为发展H5N1型禽流感病毒的表位疫苗打基础.方法:从GeneBank下载不同来源的H5N1型禽流感病毒血凝素(HA)的氨基酸序列,先使用ClustalW1.83生物软件对这些氨基酸序列进行同源性比较,然后使用SYFPEITHI生物学软件分析不同来源氨基酸序列的MHC Ⅰ类分子提呈的抗原肽(抗原决定簇),后寻找共同的、且和MHC Ⅰ类分子结合比较强的抗原肽.结果:不同来源的氨基酸序列同源性虽然不尽相同,但是,他们之间也有一些相同的、并且和MHC Ⅰ类分子结合比较强的抗原肽.结论:利用这些相同的、并且和MHC Ⅰ类分子结合比较强的抗原肽有可能发展H5N1型禽流感病毒表位疫苗,用来预防H5N1型禽流感.

布鲁氏菌OMP31T-B联合表位抗原的免疫应答分析

目的:研究OMP31表位的抗原性和免疫应答特点,为布鲁氏菌表位疫苗的研制奠定基础.方法:利用生物信息软件筛选OMP31 T-B联合优势抗原表位,进一步合成肽段.用OMP31肽段免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平,ELISPOT检测脾淋巴细胞中IFN-γ阳性的T淋巴细胞活化情况.结果:用OMP31合成肽段免疫BALB/c小鼠4次后,小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平升高,小鼠脾淋巴细胞集落形成单元(SFU)增高.结论:OMP31 T-B联合表位抗原能增强小鼠Th1免疫应答和体液免疫应答,可以作为布鲁氏菌病的候选疫苗.

两种免疫调节剂增强弓形虫W2b2a表位疫苗的小鼠保护作用

目的：探讨匹多莫德、沙利度胺增强弓形虫W2 b2 a表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。方法：将匹多莫德、沙利度胺分别与弓形虫W2 b2 a表位疫苗混合肌注免疫小鼠，检测其细胞免疫和体液免疫，并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存时间。结果：pcDNA3－W2b2a加匹多莫德组、pcDNA3－W2b2a加弗氏佐剂组、pcDNA3－W2b2a加沙利度胺组小鼠血清IFN－γ水平显著高于pcDNA3－W2b2a组（ P＜0．05）；pcDNA3－W2b2a加匹多莫德组、pcDNA3－W2b2a加弗氏佐剂组IgG抗体水平、CD4＋／CD8＋比值、T细胞增殖活性显著高于pcDNA3－W2b2a组和pcDNA3－W2b2a加沙利度胺组（ P＜0．05）；小鼠攻击试验表明，免疫组小鼠存活时间明显长于对照组（P＜0．05）。结论：匹多莫德、沙利度胺可增强弓形虫W2b2a表位疫苗免疫小鼠的保护作用。

幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定

目的 构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定.方法 设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因,重叠延伸PCR法将两段基因拼接,T-A克隆后,构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB,经酶切鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定.结果 PCR扩增出206 bp和336 bp的目的片段,重叠延伸PCR扩增出524 bp的融合目的基因片段.原核表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定,与设计序列一致.重组工程菌pET-22b(+)-Uepi-LTB/BL21经IPTG诱导,目的蛋白表达率约25%,SDS-PAGE分析相对分子质量约20 000,目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达96%,Western blot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合.结论 Hp UreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆,可获得高效表达,并显示出较好的免疫活性,为新一代Hp疫苗的研制奠定基础.

宫颈癌CTL表位疫苗TAT-HPV蛋白的构建与表达

目的构建宫颈癌的CTL表位疫苗,并在大肠杆菌中表达.方法应用PCR的方法合成编码CTL表位疫苗基因序列,将其亚克隆入pET28a-TAT表达载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,用Western blot对重组蛋白进行鉴定.结果通过4轮PCR获得疫苗的基因片段,构建的重组表达载体pET28a-TAT-HPV在大肠杆菌中得到高效表达,Westernblot检测显示特异性条带.结论构建的宫颈癌CTL表位疫苗在大肠杆菌中得到了表达,为该疫苗的功能性研究奠定了基础.

乙型肝炎病毒核心颗粒重组疟疾表位疫苗的免疫原性研究

铜绿假单胞菌多表位核酸疫苗的构建及其生物学作用的研究

目的:构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)多表位-MyD88基因疫苗并对其免疫原性进行研究.方法:将PA 外膜蛋白F(OprF)的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联,采用重叠PCR方法合成DNA,并在此序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的信号肽基因,将此获得的片段与MyD88基因分别克隆入pIRES载体构建重组质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,并将该质粒免疫Balb/c小鼠,采用ELISA法测定特异性抗体水平.气管内接种PA,进行肺组织匀浆PA细菌计数.结果:成功构建真核表达质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,用该质粒免疫小鼠,能刺激机体产生高度特异性抗体,气管接种PA后,免疫组小鼠肺匀浆细菌计数明显低于其他对照组.结论:成功构建了重组有MyD88基因的PA表位核酸疫苗,接种小鼠后可诱导特异性免疫应答,产生较好的抗铜绿假单胞菌感染的免疫保护作用.

p53肽在肿瘤免疫治疗中的研究进展

体内外研究证实wtp53肽段可诱导特异性的CD8+T细胞和CD4+T细胞,因此,wtp53肽在肿瘤免疫治疗中得到广泛应用,并且,一些表位疫苗的抗肿瘤免疫治疗已进入Ⅰ、Ⅱ期临床研究.全文就近年来wtp53在肿瘤细胞中的免疫原性、新表位的确定以及这些新表位在临床肿瘤治疗中的作用进行阐述.

黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用

目的 探讨黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫保护作用.方法 将小鼠随机分成pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组、黄芪治疗组、pcDNA3及生理盐水对照组.将弓形虫pcDNA3-W2b2a肌注免疫pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠3次,末次免疫后4周,每组小鼠腹腔注射102个速殖子,感染后2d起,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组小鼠给予黄芪75mg/d灌胃治疗,连续用药7d,用ELISA法测定免疫前、末次免疫后4周、感染后6d小鼠血清IgG水平及免疫前、末次免疫后2周、感染后4、6、8d小鼠IFN-γ、IL-18水平,并观察弓形虫感染后小鼠的生存时间.结果 pcDNA3-W2b2a免疫小鼠后血清IgG抗体水平均高于其它组(P＜0.05),末次免疫后4周,感染后第6 d pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠特异性IgG抗体水平无显著性差异(P＞0.05);末次免疫后2周、感染后4d、6d、8 d pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平分别高于其它组(P＜0.05);感染后各组小鼠血清IL-18水平持续上升,但感染后8d,黄芪治疗后小鼠血清IL-18水平显著低于pcDNA3和生理盐水对照组(P＜0.05);小鼠RH株速殖子感染后,pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3+黄芪治疗组及黄芪治疗组(P＜0.05).结论 黄芪可增强弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用.

黄芪多糖、香菇多糖增强弓形虫wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保护作用

目的 探讨黄芪多糖(Astragalan)、香菇多稽(Lentinan)增强弓形虫wx2b4a表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果.方法 将黄芪多糖、香菇多糖分别与弓形虫wx2b4a表位疫苗混合肌注免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平,pcDNA3-W2b4a刺激下培养各组小鼠脾脏淋巴细胞,ELISA法检测IL-2、IFN-γ分泌水平,CCK-8法检测免疫鼠脾细胞增殖活性,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存时间.结果 各免疫组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P＜0.05),且pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组要高于pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组(P＜0.05);pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a组(P＜0.05);各免疫组T细胞增殖活性与对照组比较明显增强(P＜0.05),且pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组要高于pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组;小鼠攻击试验表明,pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠存活时间明显长于对照组和pcDNA3-W2b4a组(P＜0.05).结论 黄芪多糖、香菇多糖可增强弓形虫wx2b4a表位疫苗产生免疫应答,并显示较好的免疫保护效应.

幽门螺杆菌双亚单位表位疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)双亚基多表位疫苗,并对其免疫原性进行研究.方法 设计引物采用PCR法将黏附素(HpaA)的一个B细胞表位与尿素酶B亚单位的三个TH表位及一个B细胞表位串联起来(HUepi),表位之间用两个赖氨酸(KK)间隔,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白采用阳离子和疏水层析进行纯化,经鉴定后皮下免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答.结果 PCR法扩增出了约233bp的目的 片段;原核表达质粒pET-22b(+)-HUepi经酶切及测序鉴定,目的 基因序列与设计序列一致;重组蛋白HUepi表达率约20.0%,PAGE初步测定目的 蛋白的相对分子质量(Mr)约8.38×103Dr,破菌后电泳证实目的 蛋白以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度大于97.6%,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,TH表位多肽、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖(SI＞2),并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体.结论 Hp HpaA、UreB双亚基表位疫苗HUepi经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫原性.为新一代Hp疫苗的研制奠定实验基础.

Asia1型口蹄疫抗原位点研究进展

农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046 口蹄疫是一种严重危害偶蹄动物,在世界范围内引起巨大经济损失兼对政治莫大影响的疾病.全面了解FMDV 抗原结构,准确而详尽地绘制其抗原表位图谱对监测病毒抗原变异、正确理解病毒致病的分子机制、定点改造免疫原性相关的蛋白质分子以及口蹄疫病毒表位疫苗的研制具有重要意义.

血吸虫疫苗的研究进展

人畜共患的血吸虫病的危害是人所共知的.长期以来,人们一直在寻找能够控制与消灭血吸虫病的有效途径.血吸虫疫苗的研究,给人类带来了新的曙光,疫苗的研究仍然是当前的研究热点与难点.湘雅医学院血吸虫病研研室在疫苗的研究方面取得了可喜的成绩,30多个新基因的发现,及对部分新的基因的进一步研究,为血吸虫疫苗的研制提供了大量的科学依据.下面主要从核酸疫苗、表位疫苗和蛋白质疫苗三方面来阐述该研究室血吸虫疫苗的研究进展.

表位疫苗的研究进展

疫苗(vaccine)是控制乃至消灭传染性疾病的有效手段.传统疫苗有2种:减毒活疫苗和灭活疫苗.减毒活疫苗虽可刺激机体产生CTL、Th反应,并增强体液免疫等多种保护性反应,但减毒不充分可导致临床感染,减毒过强又可使疫苗效价降低.死疫苗虽然比较安全,但亦有一定的毒副作用.随着分子生物学与分子免疫学的发展,出现了替代减毒活苗与灭活疫苗的基因工程蛋白质疫苗、核酸疫苗及抗体疫苗等新形式的分子疫苗.