首页 > 文献资料
-
抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定
背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的-种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用.本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性.方法:用重叠PCR(overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/抗CD19 diabody 载体,转化感受态大肠埃希菌进行原核表达.表达产物经抗His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定.应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(PACS)检测生物学活性.结果:基因重组质粒经测序证实序列正确.抗CD3/抗CD19 diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达.12%SDS-PAGE显示28×103和26×103各有-条带,Western blot在28×103显示有条带,与预期相符.表达产物经纯化定量可达5 mg/L.FACS检测抗CD3/抗CD19 diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合活性.结论:本实验成功构建了抗CD3/抗CD19 diabody,并且能够进行可溶性表达,可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,为以后的抗体功能实验奠定了基础.
-
抗CD19嵌合受体修饰的NK-92细胞的构建及其对CD19阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤作用
目的:构建表达CD19的二代CAR-NK-92细胞系,探讨其对CD19阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的特异性杀伤作用.方法:构建表达CD19-CAR基因的载体并包装慢病毒颗粒,感染NK-92细胞,流式细胞术检测感染率,并进一步分选阳性细胞,Western blotting检测CD19-CAR在NK-92细胞中的表达;以CD19阴性骨髓瘤细胞U-266、CD19阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞ARH-77和HS-Sultan细胞为靶细胞,以CD19CAR-NK-92为效应细胞,流式细胞术检测细胞杀伤实验中存活肿瘤细胞的绝对数量并计算杀伤率.结果:成功构建慢病毒载体pLVX-CD19-CAR并包装病毒颗粒,感染NK-92细胞后CD 19CAR-NK-92细胞纯度高于90％;Western blotting分析显示CD19-CAR已经成功表达在NK-92中.CD19CAR-NK-92对ARH-77[(70.10±1.86)％ vs (1.95±0.63)％,P＜0.01]和HS-Sultan[(74.98±1.60)％ vs (0.58±1.49)％,P＜0.01]细胞的杀伤率显著高于空载体对照组ZsGreen-NK-92细胞,对U266的杀伤率无显著差别(P＞0.05).结论:成功构建了表达CD19CAR的NK-92细胞系,其对CD19阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞有特异性杀伤作用.
-
CD19与B细胞恶性肿瘤的免疫治疗
CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白,在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用.因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性,使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点.靶向CD19的各种免疫治疗策略正在实验室和临床展开,包括Fc段修饰抗体、抗体-药物偶联物、双特异性抗体、嵌合抗原受体修饰T细胞等,在白血病和淋巴瘤中取得了令人鼓舞的治疗效果,有力地推动了靶向免疫治疗的发展.本文就近年靶向CD19治疗B细胞恶性肿瘤的研究进展加以综述.
-
靶向CD19的CAR修饰的NK细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤
目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(pCD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列.分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19-CAR片段,然后将其克隆到慢病毒载体上,病毒包装制备后,转染NK-92MI细胞.后,用流式细胞术检测不同的pCD9-CAR-NK-92MI细胞对CD19+细胞的杀伤率.结果:(1)成功筛出特异性强的CD19单克隆抗体-pCD19;(2)抗体检测结果显示CD19+的Ramos细胞的阳性率为84.3％,Raji为85.6％,与商业化抗体结果相似;(3)被pCD19-CAR修饰的CD19-CAR阳性率为28.72％的NK-92MI细胞对CD19+的Ramos和Raji细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的NK-92MI细胞株对Ramos和Raji细胞的杀伤率[(47.1±1.7)％vs(24.7±6.2)％和(51.8±7.9)％vs(27.6±9.6)％,均P＜0.05];对CD19-细胞Jurkat,不论是未被pCD19-CAR修饰的NK-92MI或是被修饰的NK-92MI细胞,几乎都不存在特异性杀伤作用[(16.1±0.7)％vs(17.7±2.9)％,P＞0.05].结论:成功构建pCD19-CAR,被pCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19+B细胞淋巴瘤细胞.
-
CD19-CAR-T细胞治疗难治复发急性淋巴细胞白血病的研究进展
难治复发急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)预后差,生存期短,其治疗已成为国际难题.嵌合抗原受体基因修饰T (chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T)细胞是目前具应用前景的靶向免疫治疗,靶向CD19的CAR-T细胞(CD19-CAR-T)治疗儿童及成人难治复发性ALL的完全缓解率(complete remission,CR)可达90％以上,疗效远高于化疗.然而,细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、严重神经毒性(serious neurotoxicity,SNT)、脱靶效应以及疾病复发等严重限制了CAR-T细胞的进一步临床应用.本文主要阐述CAR-T细胞的制备技术、预处理方案、细胞输注剂量及各种并发症防治策略等新研究进展.
-
CD19-CAR-T细胞治疗技术的产业化前景
嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T,CAR-T)细胞治疗技术自从2010年以来在临床上不断取得突破,特别是靶向CD19分子在针对难治、复发的B细胞来源的血液肿瘤(急、慢性淋巴细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤)的治疗上,获得了传统疗法无法达到的临床疗效,成为当下肿瘤免疫治疗中为引人关注的领域.不过CAR-T细胞技术在治疗中不断出现的高复发率、毒副作用及CAR-T细胞高昂的制备成本都为这一技术的产业化前景带来了不确定性.本文总结了目前国际上CAR-T细胞治疗技术领军企业的发展现状,就该技术产业化发展面临的挑战进行了深入分析,并展望该产业的发展趋势和产业化前景.
关键词： 肿瘤 CD19 嵌合抗原受体基因修饰T细胞 细胞治疗 产业化 -
第二代CD19-CAR-T细胞治疗难治复发急性B淋巴细胞白血病的经验及问题
为了探索抗CD19嵌合抗原受体基因修饰T(CD19-CAR-T)细胞治疗难治、复发的B急性淋巴白血病(B-acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)安全有效的细胞剂量、毒副作用及其处理方法,2015年7月12日至2016年11月20日,笔者团队采用CD19-CAR-T细胞治疗了64例难治复发B-ALL患者.其中55例为原发耐药或难治性血液学复发患者,9例为FCM确认的难治性微小残留白血病(minimal residual disease,MRD)阳性B-ALL患者.在治疗工作早期,2例死于治疗后相关并发症(treatment related motality,TRM),疗效不可评估,4例未获得完全缓解(NR).以后通过调整入组标准及回输细胞数,近期连续33例患者均获得完全缓解(CR),或达到CR但血液细胞计数未正常(CR incomplete,CRi),无1例死亡.CD19-CAR-T细胞治疗达CR后,接受异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)者80％以上持续FCM-MRD阴性至观察结束,该疗效与第1次CR期(CRl)接受移植者相同;未移植者绝大多数在CR后1年内再次复发.治疗过程中,及时稳妥地处理好细胞因子释放综合征(cytokine releasing syndrome,CRS)及各种引起复发的因素是保证治疗成功的关键.
-
MIC分型评价成人急性髓系白血病中的淋系抗原表达
目的:研究成人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中淋系抗原的表达及其与预后的关系.方法:对275例成人AML进行细胞形态学、流式细胞免疫表型分析和染色体细胞遗传学(MIC)分型实验研究并对其中的64例M2进行临床治疗结果观察研究.结果:①AML淋系抗原阳性率31.3%,其中t(8;21)者为48.3%,无t(8;21)者为26.5%(P＜0.001).②CD19+在t(8;21)中占38.3%,无t(8;21)中占1.9%(P＜0.001);而其他淋系抗原两组比较均为P＞0.05.③治疗结果(CR率):t(8;21)和无t(8;21)M2分别为66.7%和41.9%,CD19+和CD19-M2分别为76.5%和46.8%,CD19+/t(8:21)和CD19-/无t(8;21)分别为80.0%和41.4%,以上均为P＜0.05.而CD19-/t(8;21)和CD19+/无t(8;21)分别为55.6%和50.0%(P＞0.05).结论:成人AML中淋系抗原表达与核型密切相关,t(8;21)AML高表达CD19.t(8;21)和CD19都是M2预后好的标志之一.
-
小剂量他克莫司添加治疗难治性全身型重症肌无力的疗效及对外周血CD19+BAFF-R+B细胞的影响
目的 探讨小剂量他克莫司添加治疗难治性全身型重症肌无力(MG)的疗效及可能机制.方法 纳入临床确诊的18例难治性全身型MG患者(Osserman Ⅲ型2例,Ⅳ型1例,Ⅱ B型15例),其中男性5例、女性13例,平均年龄(40.9±9.1)岁,所有病例均给予他克莫司3 mg·d-1治疗6个月.采用美国MG基金会量表(MGFA)、徒手肌力量表(MMT)和日常生活量表(ADL)分别在治疗前和治疗后第1、2、3、4、5、6个月进行疗效评估.其中10例在治疗前和治疗后3和6个月时进行外周血CD19阳性(CD19+)和B细胞活化因子受体阳性(BAFF-R+)B细胞百分比检测.结果 6个月后,所有患者添加小剂量他克莫司治疗MGFA、ADL和MMT量表均较治疗前有明显改善(P＜0.001);与泼尼松联合治疗的15例患者泼尼松使用剂量明显减少(P＜0.05); 10例患者CD 19+BAFF-R+B细胞百分比检测明显下降(P＜0.001).结论 小剂量他克莫司添加治疗难治性全身型MG,可改善患者日常生活质量、减少泼尼松用量,其机制可能与外周血CD19+BAFF-R+B细胞数量下降有关.
-
骨髓基质细胞抗原2在原发性舍格伦综合征中的表达及意义
目的:检测骨髓基质细胞抗原2 (bone marrow stromal antigen-2,BST-2)在原发性舍格伦综合征(primary Sj(o)gren's syndrome,pSS)患者唇腺及外周血淋巴细胞中的表达,探讨BST-2对淋巴细胞增殖的作用,以期为原发性舍格伦综合征的发病机制研究及药物治疗靶点的开发提供理论基础.方法:应用实时定量PCR技术检测30例pSS患者及30例对照患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和唇腺组织中BST-2的表达水平,并与临床指标进行相关性分析.采用免疫组织化学对唇腺组织中的BST-2进行定位及半定量分析.通过分选外周血中的淋巴细胞,实时定量PCR明确BST-2异常表达的淋巴细胞亚群,唇腺免疫组织化学连续切片染色验证.慢病毒转染人B淋巴细胞系以过表达BST-2,CCK8检测BST-2对细胞增殖活性的影响,流式细胞术分析其对细胞凋亡的影响.采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:与对照患者相比,pSS患者唇腺组织中BST-2表达升高,阳性细胞主要是浸润腺体的B淋巴细胞.同时,pSS患者外周血CD19+B细胞BST-2与对照组相比表达升高.过表达B细胞中的BST-2可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡.结论:BST-2在pSS患者外周血及唇腺组织中表达升高,BST-2主要定位于B淋巴细胞.推测BST-2通过促进B细胞在腺体中的增殖和浸润,从而参与pSS的发生与发展.
-
治疗B细胞淋巴瘤的抗CD19CAR-T细胞药物:axicabtagene ciloleucel
axicabtagene ciloleucel(商品名:YESCARTA)一种由凯特制药公司开发的抗CD19嵌合抗原受体(CAR)-T细胞药物.2017年10月18日,美国食品和药物管理局通过加速评审,批准axicabtagene ciloleucel用于经二线及以上系统治疗失败后的难治/复发性B细胞淋巴瘤.axicabtagene ciloleucel是首个针对非霍奇金淋巴瘤基因治疗的CAR-T细胞药物.本文主要对axicabtagene ciloleucel的制备方法、作用机制、药动学、临床疗效及安全性作一综述.
-
CD19和CD56与t(8;21)急性髓细胞白血病的相关性分析
CD19、CD56多表达在t(8;21)(q22;q22)M2白血病细胞上,而形成了一组具有特殊生物学意义的白血病亚型[1,2].我院自1995年～2000年5月共诊治了48例急性髓细胞白血病(简称AML)M2亚型的患者,现将其分化抗原CD19、CD56的表达与t(8;21)的关系报道如下:
-
CD19+PD-L1+ B细胞在浸润性乳腺癌中的作用及生物学意义
目的：探讨CD19+PD-L1+肿瘤浸润性B淋巴细胞在乳腺肿瘤组织中的作用以及生物学意义，为进一步了解B细胞在肿瘤免疫应答的作用提供理论基础。方法利用免疫组织化学多种染色技术分析CD19+PD-L1+肿瘤浸润B细胞在31例乳腺纤维腺瘤患者标本、16例乳管内乳头状瘤患者标本、15例导管内原位癌患者标本和134例浸润性乳腺癌患者标本中的表达情况，采用趋势性检验及卡方检验等统计学分析CD19+PD-L1+ B细胞与乳腺肿瘤的相关性及临床病理参数之间的生物学意义。结果(1)CD19+PD-L1+ B细胞在乳腺浸润癌中的表达显著高于乳腺纤维腺瘤、乳腺导管内乳头状瘤以及原位癌组织中（P﹤0.0001）；(2) CD19+PD-L1+ B细胞的浸润与HER2的相关性接近统计学意义（P=0.073）。结论 CD19+PD-L1+B细胞与乳腺恶性肿瘤的发生发展存在一定相关性。CD19+PD-L1+ B细胞在乳腺浸润癌中的是否介导免疫逃逸以及对其它免疫效应性细胞的作用有待进一步研究。
-
慢性肾功能衰竭患者外周血CD23的表达
目的 研究CD23/sCD23、CD19在慢性肾功能衰竭(CRF)发病机制中的作用及CD23、CD19之间的相互关系.方法 CRF患者25例及健康体检者20人,分别抽取非抗凝、肝素抗凝静脉血各2ml,采用流式细胞仪分析检测外周血CD23+、CD19+及CD23+CD19+淋巴细胞百分率,用ELISA法检测sCD23水平.结果 CRF组外周血CD23+淋巴细胞百分率[(4.19±0.93)%]及CD23+CD19+淋巴细胞百分率[(3.21±1.30)%]显著低于正常对照组[(5.33±1.74)%,(4.79±2.18)%],差异有高度统计学意义(P<0.01).血清sCD23水平CRF组[(173.2±60.3)U/ml]显著高于正常对照组[(50.1±7.6)U/ml],差异有高度统计学意义(P<0.01).结论 CD23是引起CRF患者免疫紊乱的重要因素.
-
急性白血病细胞中CD19的表达
目的观察CD19在急性白血病(AL)中的表达与分布,为白血病的诊断、鉴别以及导向治疗提供依据.方法采用27个荧光直标单克隆抗体(单抗)及CD45/SSC双参数设门多色流式细胞术对321例AL细胞进行免疫诊断和分型,并对CD19在各类型AL细胞中的表达情况进行分析.结果在116例B细胞系急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者中,CD19的阳性率(99.1%)明显高于B细胞系其它相关性抗原的阳性率;CD19在17例含B细胞系成分的杂合型白血病(HAL)中全部表达,而在29例T细胞系ALL和7例T/My HAL则均无表达;在152例急性髓系白血病(AML)中,仅11例(7.2%)CD19阳性,明显低于其在B细胞系ALL中的阳性率(P=0.001);CD22在B/My HAL的阳性率(12/15,80.0%)明显高于CD19+-AML(0/11,0%,P＜0.001).结论 CD19对B系ALL细胞的特异性较好,敏感性较高,是诊断B细胞系ALL较为可靠的表面标记,也可作为导向治疗B细胞系ALL的理想靶点.
-
系统性红斑狼疮患者外周血CD4+和CD8+细胞端粒长度及端粒酶活性的研究
目的:探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD4+、CD8+和CD19+细胞端粒长度和端粒酶活性变化及其在发病中的作用.方法:用免疫磁珠法,从外周血单个核细胞分离CD4+、CD8+和CD19+淋巴细胞,提取细胞蛋白后,用PCR为基础的端粒酶测定法(Telomeric repeats amplification protocol,TRAP)测定端粒酶活性;Southern Blot测定细胞端粒长度.结果:SLE患者CD4+、CD8+和CD19+细胞端粒酶活性均高于正常对照,但只有CD19+细胞端粒酶活性与正常对照相比差异有显著性(P<0.05).SLE患者CD4+和CD8+淋巴细胞的端粒长度均较正常对照明显缩短,CD19+淋巴细胞的端粒长度无明显缩短.结论:SLE患者CD19+细胞端粒酶活性显著增高,维持了细胞端粒长度;而CD4+和CD8+细胞端粒酶活性可能不足以维持由于细胞分裂所导致的细胞端粒缩短.
-
急性白血病患者白血病细胞CD19和CD20反应谱分析
目的观察CD19和CD20在急性白血病(AL)细胞中的表达与分布,为免疫毒素导向治疗药物的合理应用提供依据.方法采用27个直接荧光素标记的单克隆抗体(单抗)及CD45/SSC双参数设门多色流式细胞术对321例AL患者白血病细胞进行免疫学诊断和分型,并对CD19和CD20在各种类型AL细胞中的表达情况进行分析.结果在116例B系ALL患者中,CD19持续稳定表达,其阳性率(99.1%)高于CD20阳性率(28.4%,P=O.001);在17例具B系特征的杂合型白血病(HAL)细胞中,CD19阳性率也明显高于CD20(P＜0.01),而在29例T细胞系ALL和7例T/My HAL细胞中,两者均无表达.在152例急性髓系白血病(AML)细胞中,CD19和CD20阳性率均很低,分别为7.2%和2.0%.结论CD19在B细胞系细胞的各分化阶段上持续稳定表达,且反应谱比CD20宽,CD19免疫毒素可能成为治疗大多数B系ALL的佳选择.
-
基因工程抗体抗CD19(Fab)-LDM的制备及生物学活性研究
目的 构建及表达抗CD19(Fab)-LDP(LDP为LDM辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM,进行体外生物活性的研究.方法 采用基因克隆技术,构建基因重组质粒pAZYanti-CD19(Fab)-LDP,测序进行鉴定,转化至大肠杆菌进行表达,表达产物经Protein G亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定;采用流式细胞检测技术(FACS)和激光共聚焦显微镜技术,检测融合蛋白与B淋巴瘤Raji细胞的结合活性;采用间接免疫荧光法,检测CD19介导细胞内化的情况;采用MTT法检测强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM对CD19+Raji细胞的靶向杀伤活性;采用彗星电泳的方法,检测强化融合蛋白对Raji细胞DNA的损伤程度.结果 用基因工程方法成功的构建、表达融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDP,Protein G亲和层析柱纯化后在SDS-PAGE上表现为相对分子质量约60 ku蛋白条带,且融合蛋白可与Raji细胞特异结合,并能介导细胞的内化;强化融合蛋白对Raji细胞具有较强的细胞毒性,并能引起细胞DNA损伤.结论 强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM可以靶向作用于B淋巴瘤细胞,并具有较强的抗肿瘤活性,在恶性B淋巴瘤生物治疗中具有潜在的应用价值.
-
CD19和CD27标记系统性红斑狼疮患者外周血B细胞的亚群分析
目的研究系统性红斑狼疮(SLE)外周血中B淋巴细胞亚群的分化状态及其与体液免疫的关系.方法选择SLE患者32例,SLE DAI分为≥10分组和＜10分组;健康献血者14例作为对照.采用流式细胞仪检测研究对象外周血中CD19+CD27-、CD19+ CD27+和CD19+ CD27++细胞,并分析各亚群比例、CD19平均荧光强度的差异和体液免疫的关系.结果两组SLE患者与正常对照相比,CD19平均荧光强度明显降低.SLEDAI≥10分组的CD19+ CD27++细胞比率较正常对照明显升高.SLEDAI＜10分组的CD19+CD27-细胞较正常对照明显升高,CD19+ CD27+细胞明显降低.IgG与浆母细胞比率呈正相关.CD19+ CD27++细胞比率在抗dsDNA抗体阳性组较阴性组明显升高.结论SLE患者外周血CD19+ CD27+及CD19+ CD27++亚群存在异常,可能与SLE患者体内的体液免疫异常有关,并在其中发挥重要作用.
-
嵌合抗原受体修饰T细胞在复发、难治性慢性淋巴细胞白血病中的治疗进展
#
