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磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1在Notch1诱导的小鼠急性T淋巴细胞白血病发展中的作用
目的:应用Mx1-cre;LoxP系统,建立可诱导敲除PDK1的Notch1诱导的急性T淋巴细胞白血病小鼠模型,观察PDK1在急性T淋巴细胞白血病发展过程中的作用.方法:用流式细胞术检测小鼠骨髓白血病细胞的周期和凋亡率,应用实时荧光定量PCR检测小鼠白血病细胞中肿瘤相关基因和转录因子的表达水平.结果:成功建立诱导敲除PDK1的T-ALL小鼠模型;体内诱导PDK1敲除后,与对照组相比,敲除组白血病小鼠的生存期明显延长(P＜0.01);PDK1敲除对白血病细胞的周期无影响;敲除组小鼠骨髓白血病细胞的凋亡率显著高于对照组(P＜0.001);PDK1的敲除引起肿瘤相关基因和转录因子c-Myc和NF-κB表达水平降低(P＜0.01)以及P53表达水平升高(P＜0.01).结论:PDK1的敲除可抑制T-ALL的发展,推测其机制可能是通过调控白血病细胞的凋亡和多种转录因子的表达来影响白血病的进程.
关键词： PDK1 Notch1 条件基因敲除 急性T淋巴细胞白血病 白血病小鼠模型 -
PDK1对中性粒细胞分化的影响
目的:应用Vav-Cre在成体小鼠敲除PDK1并观察PDK1敲除对中性粒细胞比例、数目及分化的影响.方法:应用RT-PCR分析PDK1敲除后骨髓细胞PDK1表达水平;应用CFU-C实验检测PDK1对祖细胞功能的影响;应用流式细胞术分析PDK1对中性粒细胞比例的影响.结果:PDK1敲除后骨髓细胞PDK1表达水平很低;粒系祖细胞及巨噬祖细胞数目减少;中性粒细胞比例数目减少,但幼稚的中性粒细胞比例增多.结论:PDK1敲除影响了造血干细胞向祖细胞分化的过程,以及中性粒细胞的分化成熟过程.
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泛素连接酶Smurf1促进PDK1的多聚泛素化修饰
目的 探讨3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)发生多聚泛素化修饰的机制.方法 免疫共沉淀(CO-IP)和免疫印迹(WB)分析PDK1的多聚泛素化修饰,MEF细胞内印证泛素连接酶Smad泛素化修饰调节因子1 (Smurf1)增强PDK1多聚泛素化修饰,定点突变和CO-IP及WB确定PDK1多聚泛素化修饰位点.结果 PDK1可发生多聚泛素化修饰,泛素连接酶Smurf1增强PDK1多聚泛素化修饰,且依赖HECT类泛素连接酶Smurf1 K699位点活性;K304是PDK1多聚泛素化修饰位点.结论 泛素连接酶Smurf1增强PDK1的多聚泛素化修饰.
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PDK1在内皮细胞向造血细胞转换中的作用研究
目的 研究磷酸肌醇依赖性激酶1 (PDK1)在内皮细胞向造血细胞转化阶段对造血干细胞(HSC)发生的影响.方法 应用Vec-Cre在内皮细胞中特异性敲除PDK1基因,取对照组PDK1fl/fl、PDK1fl/+小鼠及敲除组Vec-Cre;PDKIfl/fl小鼠胚胎的主动脉-性腺-中肾区(AGM区)细胞进行集落形成实验,检测PDK1基因对造血祖细胞功能的影响;取对照组和敲除组AGM区细胞行移植实验,检测PDK1对HSC功能的影响;取对照组和敲除组AGM区细胞,通过流式细胞术检测PDK1对能够向造血转化的CD31 +c-Kitugh细胞群比例、细胞周期及细胞凋亡的影响;分选对照组和敲除组AGM区CD31+c-Kithigh细胞群,通过Real-time PCR检测PDK1对内皮向造血转换相关的转录因子(RUNX1、P2-RUNX1、GATA2)的影响.结果 PDK1敲除后,造血祖细胞形成的克隆形态变小,数目减少[敲除组CFU-GM为(24±5)个/ee,对照组为(62±1)个/ee,P=0.001];破坏了造血干细胞重建造血及多向分化的能力(敲除组移植5只,0只重建,对照组移植7只,5只重建,P=0.001);AGM区CD31 +c-Kithigh比例降低[敲除组CD31+c-Kithigh曲比例为(0.145±0.017)％,对照组比例为(0.385±0.04)％,P=0.001];并且AGM区由内皮细胞向造血细胞转换的关键转录因子表达下降,但对CD31 +c-Kithigh细胞的增殖和凋亡无明显影响.结论 在内皮细胞中特异敲除PDK1基因,导致具有向造血转化的内皮细胞群比例降低,影响了HSC的发生,破坏了HSC重建造血的能力.
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小RNA干扰PDK1抑制乳腺肿瘤细胞侵袭
目的:在肿瘤侵袭转移的细胞和生物学机制中,包含有多种基因和信号传导通路的改变.PDK1是P13K分子通路上的一个重要分子,为了研究PDK1对乳腺肿瘤细胞侵袭能力的影响,我们以乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究模型,用小RNA干扰法特异下调PDK1的表达,研究其侵袭能力的变化,为乳腺癌临床治疗探索新的分子靶点.方法:通过构建PDK1特异的小RNA干扰质粒,利用脂质体介导的方法转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,无限稀释法筛选单克隆细胞系,并通过Western Blot的方法检测各组细胞中PDK1蛋白的表达水平.细胞计数的方法观察各组细胞之间的增殖情况,并利用Matrigel Transwell的实验方法研究细胞在体外的侵袭能力差别.结果:MDA-MB-231细胞经小RNA干扰后PDK1蛋白表达水平明显下降,与对照组相比,细胞的生长增殖能力没有显著差异(P＞0.05),细胞的侵袭能力显著下降,并且差异有统计学意义(P＜0.05).结论:MDA-MB-231是一种侵袭能力高的乳腺癌细胞系,本研究利用小RNA干扰技术,特异性下调了乳腺癌MDA-MB-231细胞中的PDK1蛋白表达,结果表明,乳腺癌细胞的生长能力与对照组的细胞相比没有明显差别,但是,PDK1蛋白表达水平下降后乳腺癌细胞的侵袭能力明显下降,提示我们PDK1可能与乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力紧密相关.鉴于PDK1处于PDK1-Akt-PKC信号通路的上游,以PDK1为靶标的分子干预可能对乳腺癌细胞的侵袭转移起到有效的作用.
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PDK1对生发中心的生成、发育及功能的影响
目的:研究PDK1对生发中心(GC)的生成、发育及其功能的影响.方法:通过配种小鼠得到在GCB细胞中特异性敲除PDK1的小鼠,然后采用共聚焦显微镜观察小鼠脾脏GC的大小,多色流式细胞分析方法观测PDK1的敲除是否会影响小鼠B细胞的发育,ELISA技术检测PDK1敲除的小鼠经免疫后其体内产生抗体的能力是否受影响,结合平面脂双层抗原呈递系统及全内反射荧光显微镜成像系统(TIRFM)观测PDK1的敲除是否会影响小鼠脾脏IgG细胞P85的磷酸化水平.结果:PDK1的缺失并不会影响小鼠B细胞的发育,细胞群中成熟与不成熟B细胞所占比例均无显著性变化,但在GCB细胞中条件性敲除PDK1会影响小鼠脾脏GC的生成以及T细胞依赖性抗原免疫反应,而且同等条件活化后,GCB细胞中条件性敲除PDK1的小鼠脾脏IgG细胞其胞内分子P85的磷酸化水平显著降低.结论:PDK1对GC的生成、发育及功能都具有重要作用.
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小鼠海马区PDK1基因敲除对海马依赖的学习记忆功能的影响
目的:探索3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1,PDK1)在海马依赖的学习记忆中的作用.方法:采用Cre/Loxp系统条件性敲除了表达在背侧端脑中Emx1 (empty spiracles homeobox 1)阳性神经细胞中的PDK1,利用聚合酶链式反应及行为学实验Morris水迷宫对PDK1敲除小鼠进行研究.结果:该系统确实能敲除海马中的PDK1,且敲除后的小鼠学习记忆能力明显下降.结论:PDK1敲除后影响了小鼠的学习记忆能力,PDK1在海马介导的学习记忆过程中有重要作用.
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miR-375和PDK1在胰腺癌组织中的表达及两者的相关性
目的 探讨miR-375与PDK1在胰腺癌中的表达及两者的相关性.方法 qRT-PCR方法检测胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中miR-375、PDK1表达,转染miR-375模拟物上调其在Panc-1中的表达,检测转染后Panc-1中PDK1表达变化.结果 miR-375在人胰腺癌组织中表达下调,在Panc-1中表达较HEK293明显降低.PDK1在胰腺癌组织中表达上调,在Panc-1中表达较HEK293明显增高.转染miR-375模拟物上调Panc1中miR-375表达后,转染组PDK1表达较空白组和阴性对照组均明显下降.结论 miR-375在胰腺癌中发挥抑癌基因作用,对PDK1具有负调控作用.
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同型半胱氨酸调控脂肪组织PDK1的表达与糖代谢的关系
目的 研究同型半胱氨酸对脂肪组织PDK1表达的影响,探讨PDK1是否抑制p-Akt(Thr-308),影响PI3K/Akt信号通路,降低脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用.方法 40只6周龄小鼠(n=10只)随机分为:空腹正常对照组；进食正常对照组；空腹高同型半胱氨酸血症组和进食高同型半胱氨酸血症组.利用小鼠饮用水中加入1.5％的甲硫氨酸饲养3个月制作高同型半胱氨酸血症的动物模型.测定各组血糖和血胰岛素.利用RT-PCR检测PDK1和Akt的mRNA表达水平,Western blotting检测PDK1、p-Akt(Thr-308)和Akt的表达.结果 与空腹和进食对照组相比,空腹和进食高同型半胱氨酸组小鼠血糖和血胰岛素的含量增加(P＜0.05),PDKI的mRNA表达水平下调,PDK1、p-Akt(Thr-308)蛋白质表达降低(P＜0.05),而Akt在mRNA和蛋白质的表达水平差异无统计学意义.结论 在脂肪组织中,同型半胱氨酸可能通过调控PDK1表达的下调,影响PI3K/Akt信号通路,导致对葡萄糖的摄取能力降低.这可能是同型半胱氨酸引起糖代谢紊乱的原因之一.
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吉非替尼通过PDK1-Akt信号通路影响肺癌E-Cadherin表达和上皮间充质转化
目的:研究吉非替尼在肺癌上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)中的作用.方法:将24例肺腺癌行纤维支气管镜患者,取活检标本行H&E染色和Western,观察细胞形态和蛋白表达.将24只成年小鼠,植入LLC,随机挑选12只予吉非替尼灌胃,余12只作为对照组,观察肿瘤生长情况,病理切片观察细胞形态,Western观察E-Cadherin表达.结果:在人群中发现有转移灶的患者,H&E染色有大量间质细胞形态倾向的肿瘤细胞,同时蛋白质组学提示,PDK1-Akt有活化,E-Cadherin表达较对照有降低.在动物实验中,发现吉非替尼组转移的肿瘤灶明显减少(P＜0.05),细胞形态较对照组细胞显示较弱的倾袭形态;Western提示PDK1-Akt信号通路蛋白表达吉非替尼组有明显降低,吉非替尼组E-Cadherin表达降低.结论:吉非替尼通过PDK1-Akt通路影响肺癌细胞E-Cadherin表达和EMT.
关键词： 肺肿瘤 吉非替尼 PDK1 E-cadherin EMT -
PDK1缺失导致血管内皮细胞连接异常
目的：研究3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）对血管内皮细胞间连接的作用。方法：用 Cre 重组酶介导的敲除系统在内皮细胞中敲除了 PDK1，观察其对血管内皮细胞间的影响。结果：内皮特异性敲除PDK1的小鼠出现血管发育的畸形，同时易出现血管渗漏、出血表型，组织分析显示血管内皮细胞结构异常。结论：研究表明 PDK1对血管内皮的功能和完整性起了重要的作用。这对 PDK1-Akt 信号通路在血管内皮中作用的机制做了初步的阐明，为进一步的研究打下基础。
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携带人AKT2、PDK1、BAD基因的慢病毒表达载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建含人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT2)、磷酸肌醇依赖激酶-1(phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)、bcl-2相关性死亡蛋白(bcl-2-associated death protein,BAD)基因的绿色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达.方法 选择病理证实的非小细胞肺癌(NSCLC)组织,采用特异性引物RT-PCR扩增AK T2、PDK1及BAD cDNA.将PCR产物与T载体连接测序,测序正确的目的片段从T载体上酶切下与慢病毒骨架质粒连接,将此重组的慢病毒表达载体质粒及包装系统共转染入293T细胞(人胚肾细胞系),收集病毒上清,Western blot检测AKT2,BAD及PDK1蛋白质表达.结果 凝胶电泳证实AK T2,BAD,PDK1三基因成功转导至以pCDF1-MCS2-EF 1-copGFP为骨架质粒的慢病毒包装系统中,磷酸钙转染法72h后BAD、PDK1及AK T2的转染率分别约为100％、95％、90％.慢病毒包装后测定3种病毒滴度均达6.7×106PFU/mL,并通过Western blot法检测到AKT2,BAD,PDK1蛋白在293T细胞的表达.结论 成功构建了携带人AKT2、BAD、PDK1原癌基因的慢病毒表达载体,在293T细胞中成功鉴定其表达.
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同型半胱氨酸对小鼠骨骼肌组织PDK1的影响
目的 研究高同型半胱氨酸血症中骨骼肌组织PDK1的变化,探讨同型半胱氨酸对葡萄糖摄取的影响.方法 20只6周健康小鼠随机分为对照组(10只)和高同型半胱氨酸血症组(10只).3个月饮水中加入蛋氨酸(1.5%)复制高同型半胱氨酸血症模型,测定进食状态下血糖浓度.免疫组化检测骨骼肌细胞PDK1、PDK1磷酸化和Akt磷酸化的改变.Western Blot检测骨骼肌细胞PDK1与PDK1磷酸化和Akt与Akt磷酸化的表达.结果 与对照组比较,高同型半胱氨酸血症组进食血糖浓度增加(P<0.05),高同型半胱氨酸血症组骨骼肌细胞中PDK1、p-PDK1(ser-241)和p-Akt(Thr-308)平均灰度值增加(P<0.05);高同型半胱氨酸血症组骨骼肌组织PDK1、p-PDK1(Ser-241)和p-Akt(Thr-308)蛋白质水平下调(P<0.05),Akt的表达无差异(P>0.05).结论 同型半胱氨酸可能通过降低骨骼肌组织PDK1的表达和PDK1磷酸化,抑制对葡萄糖的摄取.
