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人乳头瘤病毒疫苗研究新进展
宫颈癌的发病率和病死率较高,人乳头瘤病毒,特别是高危型人乳头瘤病毒持续感染是宫颈癌的主要病因,积极地治疗宫颈高危型人乳头瘤病毒感染对预防宫颈癌的发生、降低宫颈癌发病率及死亡率具有重要意义.采用宫颈癌疫苗预防人乳头瘤病毒感染,进而预防宫颈癌是根本的防治方法.因此,研究和开发人乳头瘤病毒预防性和治疗性疫苗之癌症疫苗对于预防及治疗宫颈癌具有重大意义,目前已进入临床应用的有二价和四价预防性疫苗两种.该文对人乳头瘤病毒预防性和治疗性疫苗的新研究进展进行综述,并探讨宫颈癌疫苗的临床应用前景.
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Hyper-IL-6基因诱导的体内抗肝癌免疫功能
目的:建立稳定表达Hyper-IL-6基因的小鼠肝癌细胞株,探讨Hyper-IL-6用于诱导抗肝癌主动免疫治疗的可行性.方法:用脂质体法将Hyper-IL-6基因转染小鼠肝癌细胞系MM45T.Li,通过G418筛选获得抗性细胞株,命名为MM45T-HIL-6,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.同时筛选空载体pEGFP-C1转染的阳性克隆命名为MM45T-mock作为对照.将BALB/c小鼠随机分为3组,于各组小鼠右侧腋部皮下分别接种细胞MM45T.Li、MM45T-mock和MM45T-HIL-6 5×105个/只,体内实验观察MM45T.Li、MM45T-mock及MM45T-HIL-6的成瘤性,流式细胞仪检测荷瘤小鼠外周血中CD4+,CD8+T淋巴细胞亚群水平.结果:RT-PCR和ELISA检测结果表明,筛选到的小鼠肝癌细胞株MM45T-HIL-6中存在Hyper-IL-6的表达,而MM45T.Li和MM45T-mock不表达.体内成瘤实验结果显示,与MM45T.Li、MM45T-mock相比,MM45T-HIL-6的成瘤性下降；流式细胞分析结果显示,与接种MM45T.Li和MM45T-mock的小鼠相比,接种MM45T-HIL-6稳定表达HYPER-IL-6基因的小鼠肝癌细胞株的小鼠外周血中CD4+,CD8+T淋巴细胞水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:转染Hyper-IL-6基因的小鼠肝癌细胞株能够诱导小鼠抗肝癌主动免疫反应.
关键词： IL-6 Hyper-IL-6 肝肿瘤 癌症疫苗 抗肿瘤免疫 -
冻存后人脐血DC介导的食管癌细胞瘤苗实验研究
目的:探讨杂交瘤技术制备脐血树突状细胞(DC)和食管癌细胞的融合瘤苗在低温冻存后的生物学特性及特异性CTL活性.方法:分离脐血CD34+干细胞诱导扩增为成熟DC,与EC109细胞经聚乙二醇(PEG)法融合;免疫磁珠法筛选EC109-DC;鉴定瘤苗表型;-80℃低温冰箱冻存融合细胞EC109-DC,3周后融冻;观察融冻瘤苗表型及致瘤性;MTT法测定瘤苗诱导淋巴细胞增殖能力及体外特异性免疫应答能力.结果:融冻后疫苗体外半悬浮生长;同时高表达FR和CD80;融冻后瘤苗接种小鼠体内未见肿瘤形成;未冻存和冻存后融合疫苗EC109-DC活化的T淋巴细胞,可产生针对EC109细胞的特异性杀伤作用.结论:冻存未破坏融合疫苗的完整性;融冻后瘤苗无体内致瘤性,安全可靠;-80℃低温冰箱短期冻存对EC109-DC融合疫苗生物学特性及特异的CTL活性无明显影响,可望为DC疫苗提供简单可行的保存方法.
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携带hTERT I540-PTD表达框重组复制缺陷型腺病毒的构建与鉴定
目的:构建携带人端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)I540-PTD,I540-PTD4融合基因表达框的重组复制缺陷型腺病毒.方法:将pDC315-I540-PTD,pDC315-1540-PTD4与腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE13Cre共转染HEK293细胞,出现典型的细胞病变反应后收获细胞,反复冻融法制备病毒粗提液,经扩增和纯化获得重组复制缺陷型腺病毒Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4.使用终点稀释实验和空斑形成实验测定纯化后病毒滴度.采用聚合酶链式反应(PCR)对Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4进行鉴定.使用病毒感染人骨肉瘤U20S细胞后,进行免疫组化定性并观察I540-PTD,I540-PTD4的表达情况.结果:共转染10 d后,HEK293细胞出现典型的细胞病变反应.经扩增、纯化后,终点稀释法和孔板形成法测定Ad-I540-PTD滴度分别为(8.9×1012),(6.3×1012)pfu/L;Ad-I540-PTD4滴度分别为(5.8×1012),(5.4×1012)pfu/L.以纯化的病毒为模板,使用自行设计的鉴定引物进行PCR均获得167 bp目标片段.抗组胺酸标签抗体对病毒感染后的U20S细胞免疫组化分析发现Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4转染的U20S细胞均呈强染,表明Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4中携带的I540-PTD,I540-PTD4真核表达读框可在人类细胞内高效表达.结论:成功构建可高效表达I540-PTD,hTERT I540-PTD4的重组复制缺陷型重组腺病毒Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4,为其作为基因疫苗诱发针对hTERT I540表位的抗瘤免疫奠定了基础.
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对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染
目的:探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法:应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果:转导mGM-CSF 基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5, 125.8±34.3 vs 27.8±24.0, P<0.01).结论:mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.
关键词： 黑色素瘤 小鼠 粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子 肺肿瘤/继发性 癌症疫苗 -
构建携带hTERT I540-PTD融合基因表达框的穿梭质粒
目的: 设计hTERT I540-PTD融合基因表达框并构建携带该表达框的穿梭质粒.方法: 根据hTERT I540表位、HIV-1 TAT-PTD和PTD4的氨基酸序列设计融合疫苗,然后根据哺乳动物偏爱密码子反翻译成基因序列.分段合成寡聚脱氧核糖核酸,磷酸化、退火后先后克隆至pSP72的BamHI-EcoRI和XbaI-BanHI之间.将经双酶切鉴定获得的阳性重组子进行基因测序.然后将hTERT I540-PTD融合基因表达框亚克隆至pDC315.结果: 测序结果表明hTERT I540-PTD和hTERT I540-PTD融合表达框的基因序列与设计完全一致.穿梭质粒pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4经EcoRI酶切后均清晰可见112 bp电泳条带,与预测相符.结论: 成功获得了携带hTERT I540-PTD和hTERT I540-PTD4表达框的穿梭质粒pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4,为制备以重组腺病毒为载体的I540-PTD基因疫苗、比较蛋白转导能力的强弱对基因疫苗免疫效能的影响奠定了基础.
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小鼠肝癌细胞系Hepa1-6 B7.1瘤苗抗肿瘤免疫的实验研究
目的: 研究小鼠肝癌细胞系Hepa1-6转染B7.1基因后在体内外抗肿瘤免疫的作用.方法: 采用脂质体介导的方法用pLXSN B7.1转染PA317包装细胞,经G418筛选出高滴度阳性的细胞克隆,以流式细胞仪检测B7.1分子的表达情况;用所获病毒上清进一步感染Hepa1-6细胞,观察转染B7.1基因后Hepa1-6细胞作为肿瘤疫苗在体内外诱发抗肿瘤免疫的情况. 结果: Hepa1-6/B7.1高表达B7.1分子,其致瘤性明显降低,接种小鼠后成瘤率为20%,而亲代Hepa1-6细胞成瘤率为100%.转B7.1基因肿瘤细胞疫苗可抑制肿瘤生长速度,延长荷瘤小鼠生存期;且转B7.1基因肿瘤细胞疫苗具有保护性免疫反应. 结论: 转B7.1基因的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗可有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应.
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巨噬细胞融合瘤苗对大鼠骨肉瘤的主动性免疫治疗
目的:探讨融合瘤苗在骨肉瘤免疫治疗中的应用潜力.方法:用UMR106细胞系建立大鼠骨肉瘤动物模型,然后将该细胞系与大鼠巨噬细胞融合作为瘤苗应用于荷瘤大鼠,观察其抑制肿瘤生长和肺转移的效果.结果:在治疗6wk时治疗组和对照组相比,瘤重明显减小(P＜0.01);肺转移发生率降低(P＜0.01).结论:骨肉瘤细胞与巨噬细胞的融合瘤苗可望在骨肉瘤的治疗中发挥作用.
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尤文肉瘤细胞总RNA修饰的树突状细胞的体外培养及其鉴定
目的:探讨树突状细胞(DC)经尤文肉瘤细胞总RNA加载后的体外RNA表达情况. 方法:采用分离尤文肉瘤患者外周血单核细胞体外诱导DC,用流式细胞仪检测DC成熟后的表面标志,Trizol法提取患者尤文肉瘤组织总RNA,用总RNA转染DC,用RT-PCR方法检测肿瘤总RNA加载的DC的表达. 结果:经尤文肉瘤总RNA加载的DC表面标记发生明显变化,DC的特异性表面标志如CD40由32.24%增高至72.32%,CD83由17.39%增高至30.97%,而代表单核细胞的CD14则由26.37%下降至10.46%,标志其抗原呈递功能显著增强. RT-PCR测定显示尤文肉瘤中的特异性序列EWS-FLI1可以和引物特异性结合,并且佳结合温度为54℃. 结论:尤文肉瘤细胞总RNA转染的DC可以呈递肿瘤特异性抗原,并特异性的表达其特有序列EWS-FLI1.
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DC 在抗肿瘤免疫应答中应用的研究进展
树突状细胞（DC）被称为机体功能强的抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。 DC 在细胞免疫、体液免疫中发挥重要作用，通过与 NK 、CTL 等细胞相互作用，执行免疫应答。体外培养的 DC 负载抗原后具有杀伤肿瘤细胞的效应，在抗肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。本文通过 DC 的生物学特性、DC 抗肿瘤机制、DC 疫苗等方面对 DC 介导的抗肿瘤免疫应答作一综述。
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白血病肿瘤疫苗联合1-甲基色氨酸免疫治疗荷瘤小鼠疗效观察
目的 探讨白血病肿瘤疫苗(简称瘤苗)主动免疫治疗及联合吲哚2,3双加氧酶(IDO)的抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT),在白血病荷瘤小鼠治疗中的作用.方法 采用FBL-3细胞皮下注射建立荷瘤白血病小鼠模型;实验分为5组:正常对照组、PBS对照组、环磷酰胺(CTX)化疗组、单用瘤苗治疗组和瘤苗联合1-MT治疗组;观察各组小鼠的一般状况、肿瘤缓解率、肿瘤大小、转移情况及生存期.结果 PBS对照组小鼠活动迟缓,体质量(含瘤结节质量)比其余各组均高;单用瘤苗组和瘤苗联合1-MT组小鼠活动、进食正常,体质量与正常小鼠筹异不大;化疗组体质量明显减轻,出现脱毛、弓背、活动减少等,差异有统计学意义(F=57.71,P=000);单用瘤苗组和瘤苗联合1-MT组治疗相关死亡率明显低于化疗组(0,0,40%).瘤苗联合1-MT组完全缓解率与单用瘤苗组(61.1%、70.0%)比较,差异无统计学意义(χ2=0.221,P>0.05),但瘤苗联合1-MT组的复发率低于单用瘤苗组(0,36.36%);复发小鼠再应用1-MT,能明显抑制瘤结节的生长.单用瘤苗组和瘤苗联合1-MT组小鼠中位存活期明显高于化疗组和PBS对照组(χ2=52.13,P<0.01).各组小鼠整体瘤结节的变化比较差异有统计学意义(F=89.966,P=0.000).结论 白血病瘤苗在动物实验具有肯定的疗效,能明显抑制肿瘤的生长,延长小鼠生存时间,且副作用小.免疫治疗联合1-MT对白血病进行治疗,可以显著减少肿瘤的复发率;而免疫治疗有效后复发时应用1-MT,可以显著抑制肿瘤的生长.
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粒-巨噬细胞集落刺激因子剂量对小鼠骨髓源性树突状细胞成熟状态的影响
目的 观察不同剂量粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对小鼠树突状细胞(DC)形态、纯度、成熟程度的影响,为不同用途的DC疫苗制备选择合适的GM-CSF质量浓度提供理论依据.方法 用低剂量(5 ng/ml)、常规剂量(20 ng/ml)、高剂量(50 ng/ml)GM-CSF联合重组小鼠白细胞介素-4(mIL-4)诱导小鼠骨髓细胞体外分化为DC,流式细胞术测定CD_(11c)、CD_(80)和CD_(86)表达率.结果 低剂量GM-CSF组诱导的DC不具有典型的DC形态,低表达CD_(11c)、CD_(80)和CD_(86).常规剂量GM-CSF组诱导的DC高表达CD_(11c)、CD_(80)和CD_(86),具有更强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力.高剂量GM-CSF组CD_(11c)、CD_(80)和CD_(86)表达率高,并具有强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力.结论 GM-CSF剂量影响诱导分化的DC成熟程度.低剂量的GM-CSF诱导的DC为不成熟的DC,常规剂量和高剂量GM-CSF诱导分化的DC为细胞表型和功能成熟的DC.高剂GM-CSF诱导的DC细胞表型和功能成熟.
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肝细胞肝癌免疫治疗的现状及进展
肝细胞肝癌(HCC)是我国发病率高的恶性肿瘤之一,其发生、发展与机体免疫系统有密切的关系.而免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的第4种治疗模式.其通过调节机体特异性免疫反应,增强机体免疫系统的自我调节能力,从而达到提高肿瘤治愈率,延长病人生存期的目的.近年来,肿瘤免疫治疗已成为临床研究的热点,本文就细胞免疫治疗、细胞因子、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂等治疗策略在肝癌治疗中的现状做一概述.
