鼻咽癌患者EBV LMP1基因C端区的缺失突变及序列分析

目的研究LMP1基因C端区缺失突变在我国南方广东、广西鼻咽癌高发区的存在状况和探讨其在鼻咽癌中所起的作用.方法采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增鼻咽癌患者鼻咽组织中LMP1基因的C末端,并对其进行了克隆和序列分析.结果 20份鼻咽癌组织标本中,有17份扩增出特异性条带,阳性率为85%,阳性个体中只有1份未发生缺失.我们选择其中的4份样品进行了克隆和序列分析,结果显示,4份样品均存在30个碱基的缺失和某些位点的单点突变.结论广东、广西鼻咽癌高发区鼻咽癌组织中LMP1基因C端区存在较高比例的碱基缺失和点突变.

EB病毒潜伏膜蛋白1诱导细胞免疫的研究进展

Epstein-Barr Virus(EBV)是1964年Epstein等发现的.研究证实EB病毒与许多人类肿瘤相关.潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)是EBV编码的潜伏感染过程中表达的病毒膜蛋白,是较早被确认的病毒癌基因之一.近期研究发现LMP1的氨基酸序列中存在诱导细胞免疫应答的多肽表位.可以诱导LMP1特异性细胞免疫反应.本文就LMP1在细胞免疫应答方面的研究做一介绍.

Tea polyphenols present in green tea show cancer chemopreventive effects in many tumor models. Epidemiological studies have also suggested that green tea consumption might be effective in the prevention of certain human cancers. In the present study, we investigated the molecular mechanisms of the inhibition of cell proliferation by tea polyphenols in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE1-LMP1. Methods: CNE1-LMP1 cells were treated with tea polyphenols at various doses (0, 25, 50, 100, 200 μg/ml) for 24 hours, the morphology of cells was observed by light microscopy, and cell survival rate was determined by MTT assay. At the same time, cell cycle of CNE1-LMP1 was analyzed by flow cytometry. Cyclin D1 transcription was analyzed by cyclin D1 promoterluciferase reporter system and expression of cyclin D1 protein by Western blot analysis. Transactivities of NF-kB and AP-1 was analyzed by Dual-fluorescence reporter gene system. Results: After treatment of CNE1-LMP1 cells with tea polyphenols, the number of proliferating cells was obviously decreased as determined by light microscopy and MTT assay (from 100% to 89.4%, 83.3%, 74.8% and 38.1%). With the increase of tea polyphenols concentrations, the number of cells in S-phase was obviously decreased, and the number of cells in G1-phase from 22.20% to 13.16%, and the number of cells in G0/G1 phase was elevated from 68.5% to 74.08%. It suggests that tea polyphenols could arrest the cell cycle at both of the two checkpoints. Furthermore, transcription and were obviously declined 7-8 folds (100-200 mg/ml tea polyphenols or EGCG group) and expression of cyclin D1 protein also decreased in a dose-dependent manner. Transactivities of NF-kB and AP-1 were obviously down-regulated in CNE1-LMP1 cells. Conclusion: Green tea polyphenols could inhibit cell proliferation, by suppressing the activity of NF-kB and AP-1, and by down-regulation of the transcription of cyclin D1.

鼻咽癌肿瘤相关分子水平和局部免疫状态与远期生存关系的研究

现普遍认为EBV编码LMP1蛋白在其致瘤中发挥重要作用.VEGF是目前已知具活性的促血管生成因子,在肿瘤生长、转移相关事件中具有重要意义.

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进MMP9表达

目的探讨EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)LMP1是否通过NF-κB和AP-1促进MMP9表达,为全面阐明LMP1的分子致瘤机制提供实验依据.方法将MMP9-CAT表达质粒导入HNE2-pSG5、HNE2-LMP1、HNE2-LMP1(1-185)、HNE2-LMP1(1-231)、HNE2-LMP1 Δ187-351鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)细胞系,比较各组细胞系的氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否上调MMP9转录;采用明胶Zymography法检测上述细胞产生MMP9的活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否促进MMP9蛋白表达;借助报道基因分析法确定在NPC中野生型LMP1能否激活NF-κB和AP-1的活性,进一步将突变了NF-κB或AP-1结合位点的MMP9-CAT表达质粒导入上述细胞系;比较相应的CAT活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否通过NF-κB或AP-1上调MMP9表达.结果与导入载体pCDNA3比较, HNE2-LMP1、HNE2-LMP1(1-185)、HNE2-LMP1(1-231)和HNE2-LMP1 Δ187-351 NPC细胞系CAT活性分别提高7.2,1.3,3.3和4.0倍.明胶Zymography法检测显示,在HNE2-LMP1、HNE2-LMP1(1-231)和HNE2-LMP1 Δ187-351细胞系中,均可检测到92 000 MMP9活性,而HNE2-pSG5、HNE2-LMP1(1-231)几乎均为阴性.较之母细胞,野生型LMP1活化NF-κB及AP-1分别为13.8和 8.4倍. 导入NF-κB mut MMP9的HNE2-LMP1、HNE2-(1-231)和HNE2-LMP1 Δ187-351细胞系CAT活性,与导入MMP9-CAT相应的细胞系比较,分别下降至原有水平的18.1%、35.0%和29.1%;而导入AP-1 mut MMP9,则分别下降至原有水平的16.3%、33.3%和26.1%,HNE2-pSG5、HNE2(1-185)影响不大. 结论 LMP1 CTAR1与CTAR2可能通过NF-κB或AP-1促进MMP9表达,从而有助于NPC侵袭与转移.

EBV-LMP1的信号传导通路及与p53的相互作用

大多数正常人携带的EBV处于静止状态,一旦受到某些诱导因素的刺激,潜伏的病毒被激活,这可能成为与很多疾病相关的病因.LMP1这种非受体蛋白能利用细胞内多种信号传递系统,调节和控制细胞的增生和凋亡,从而在癌变的发生和发展过程中起着重要的作用.p53是一具有促进细胞凋亡作用的重要的抑癌基因,在大多数肿瘤中由于基因突变而表现促癌作用.随着EBV感染与肿瘤相关性研究的深入,发现LMP1与P53蛋白的相互作用在某些肿瘤发生的始动环节上有重要意义.现对LMP1的信号传导通路及与p53的相互作用加以综述.

LMP1-CTAR3对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响

背景:课题组前期构建了CTAR3缺失突变型LMP1(LMP1△232-351)表达载体,初步了解该活性区在LMP1发挥作用中扮演十分重要的角色.目的:观察LMP1-CTAR3对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响.方法:采用逆病毒感染方式,建立稳定表达LMP1及CTAR3缺失突变型LMP1(LMP1△232-351)的鼻咽癌干细胞SP18细胞系,通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验和平皿克隆形成实验观察LMP1△232-351对鼻咽癌干细胞SP18生长的影响,然后选用流式细胞术检测细胞周期,计算细胞增殖指数.另外,利用Western-blot检测细胞中JAK3蛋白的磷酸化水平.结果与结论:①与SP18-LMP1细胞比较,SP18-LMP1△232-351细胞生长速度减慢,增殖指数降低(P < 0.01).②在SP18- LMP1△232-351细胞中JAK3的磷酸化水平低于SP18- LMP1细胞.结果说明LMP1-CTAR3可能通过影响SP18细胞中JAK3的磷酸化,下调细胞的增殖指数,降低促细胞增殖的能力.

EB病毒LMP1对鼻咽癌中瘤细胞分化的影响

目的探讨EB病毒LMP1对早期鼻咽癌中瘤细胞分化的影响.方法收集31例早期鼻咽非角化性癌活检组织.采用DAKO公司的PNA探针和PNA原位杂交试剂盒检测EB病毒早期RNAs(EBERs).应用免疫组化法检测LMP1,α-catenin,β-catenin,γ-catenin以及高、低分子量细胞角蛋白.结果31例癌组织中均有相当数量的瘤细胞呈EBERs阳性,其中19例表达LMP1(61.29%).LMP1阳性组γ-catenin的表达百分率(53.25±34.12%)明显低于LMP1阴性组(80.42±15.77%,P＜0.01).γ-catenin的表达与低分子量细胞角蛋白的表达间呈正相关(r=0.440,P＜0.05).α-catenin,β-catenin和γ-catenin的表达相互间呈两两正相关.结论鼻咽癌中瘤细胞的LMP1能下调γ-catenin的表达,从而抑制瘤细胞的分化.

EB病毒潜伏膜蛋白1胞外区融合蛋白的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)胞外肽段与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并用该融合表达蛋白检测EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者血清中的特异性抗体.方法:用BamH I和EcoR I将含LMP1胞外区重组基因的质粒pMD18-LMPI双酶切后,克隆到pGEx4T-2中.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经谷胱甘肽S-转移酶柱亲和层析纯化,纯化的蛋白经Westemblot法检测鉴定.结果:重组表达质粒经酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为32.2 ku,此抗原能够与鼻咽癌患者血清中抗体特异性结合.结论:成功获得了LMP1胞外区重组基因表达的蛋白,并证明原核表达的LMP1胞外肽段保持了原有的抗原性,能够与EBV相关鼻咽癌患者血清中的抗体特异性结合.

NF-κB介导LMP1在鼻咽癌干细胞SP18增殖中的作用

目的 探讨LMP1-CTAR2影响鼻咽癌干细胞SP18增殖的作用机制.方法 采用逆病毒感染方式,建立稳定表达LMP1及CTAR2的TRADD活性区突变型LMP1( LMP1TRADD)的鼻咽癌干细胞SP18细胞系(空载体pLNSX为阴性对照),通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验、平皿克隆形成实验和流式细胞术观察LMP1 TRADD对鼻咽癌干细胞SP18增殖的影响.同时利用Western-blot检测细胞中NF-κB P65蛋白的表达.结果 (1)SP18-LMP1细胞生长较SP-pLNSX细胞加速,增殖指数增加(n=3,P＜0.01).(2)SP18-LMP1TRADD细胞的生长速度较SP18-LMP1细胞减慢,增殖指数降低(n=3,P＜0.01).(3)SP18-LMP1TRADD细胞中NF-κB P65蛋白的表达水平较SP18-LMP1细胞降低,与SP-pLNSX细胞相似.结论 NF-κB通过介导LMP1 -CTAR2胞内信号,降低SP18细胞的增殖指数,影响细胞的增殖.

非特指性外周T细胞淋巴瘤中EBER、 LMP1的表达及与预后的关系

目的 探讨非特指性外周T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma,not otherwise specified,PTCL-NOS)中EBER、LMP1的表达及与患者预后的关系.方法 采用原位分子杂交(in situ hybridization,ISH)技术和免疫组化法分别检测81例PTCL-NOS及59例对照组[48例血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-cell lymphoma,AITL)和11例结外NK/T细胞淋巴瘤(extranodal NK/T cell lymphoma,ENK/TCL)]中EBER和LMP1的表达,并分析EBER表达与PTCL-NOS患者临床病理特征及预后的关系.结果 (1)81例PTCL-NOS中,EBER阳性率为43.2％ (35/81);35例EBER阳性的PTCL-NOS病例中免疫组化得分1分+2分者共29例,占EBER阳性病例的82.9％(29/35),3分+4分者共6例,占17.1％ (6/35).EBER表达与PTCL-NOS患者年龄、性别、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平及临床分期均无明显相关性(P＞0.05).(2)81例PTCL-NOS组织中,LMP1蛋白阳性率为22.2％(18/81).LMP1蛋白表达与EBER表达具有一致性,但EBER阳性率明显高于LMP1 (P ＜0.05).(3)33例PTCL-NOS获得临床随访资料,随访时间1～63个月,中位生存期为23个月,总生存率为33.3％(11/33).Kaplan-Meier生存曲线分析显示,EBER阳性组的生存率明显低于EBER阴性组(P＜0.05).结论 EB病毒(EBV)感染可能是PTCL-NOS发生、发展中重要但非根本性的因素.EBER-ISH检测EBV感染具有较高的敏感性和特异性.EBV感染对PTCL-NOS患者的预后判断具有重要意义.

LMP1、COX-2、VEGF、IL-8与鼻咽癌复发转移的相关性研究

目的 研究LMP1(潜伏膜蛋白-1)、COX-2(环氧化酶-2)、VEGF(血管内皮生长因子)、IL-8(白细胞介素-8)与鼻咽癌复发、转移的相关性.方法 选取自2010年3月～2016年12月间,就诊于我院诊断为鼻咽癌的患者共100例,将患者分为对照组(初诊为鼻咽癌不伴鼻咽癌的转移)和观察组(患者为鼻咽癌复发或转移),各50例.收集患者新鲜手术切除组织或活检组织,使用免疫组化法分析比较两组患者组织中LMP1、COX-2、VEGF的表达.分析比较两组患者血清中IL-8的表达情况.另外,对观察组中无鼻咽癌转移和伴鼻咽癌转移的患者间上述指标的表达情况进行比较分析.同时,对鼻咽癌复发和转移进行多因素分析.结果 观察组组织中COX-2和VEGF表达的阳性率均显著高于对照组(P<0.001),LMP1的阳性率明显低于对照组(P<0.001),另外观察组血清中IL-8的表达水平较对照组明显增高(P<0.001).观察组伴鼻咽癌转移患者COX-2和VEGF表达的阳性率较无转移患者明显增高(P<0.05),且LMP1表达的阳性率明显低于无转移患者(P<0.01),另外伴鼻咽癌转移患者血清中IL-8的表达水平较无转移患者明显增高(P<0.05).在关于复发与转移的多因素回归分析中发现,VEGF和IL-8的表达水平与鼻咽癌的复发和转移均呈正相关(P<0.05),COX-2的表达水平仅与鼻咽癌的复发呈正相关(P<0.05),而LMP1的表达水平与鼻咽癌的复发和转移均呈负相关(P<0.01).结论 LMP1、COX-2、VEGF和IL-8的异常表达与鼻咽癌的预后密切相关,上述指标的联合检测可为患者的预后提供临床指导.

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1与P53在鼻咽癌中表达的意义

目的探讨EB病毒潜伏感染和抑癌基因P53异常表达与鼻咽癌的关系.方法用免疫组化S-P方法对59例鼻咽癌(NPC)和12例鼻咽部正常或慢性炎症组织进行单克隆抗体LMP1、P53标记,并结合组织学类型、分化程度、发病年龄进行分组研究.结果正常和慢性炎症的鼻咽粘膜均呈阴性表达.NPC中,LMP1阳性率69.49%(41/59),P53阳性率44.06%(26/59),双阳性率30.51%(18/59).LMP1在非角化性癌、低分化癌及青年组NPC中高表达;在鳞癌、高分化癌及老年组中低表达.P53在低分化癌中高表达;但与NPC组织学类型、发病年龄不存在明显相关性.结论在NPC发生、发展过程中EBV潜伏感染起主导作用,P53基因异常表达可能起协同作用.EB病毒潜伏感染是NPC发病年龄年轻化的主要原因之一.

EBVaGC中LMP1和BHRF1的表达与血管生成淋巴管生成的关联性研究

目的 探讨EB病毒相关性胃癌中LMP1和BHRF1的表达与血管生成、淋巴管生成的关系.方法 选取EB病毒相关性胃癌组织标本采用免疫组化方法检测LMP1、BHRF1、VEGF-C、LYVE-1和CD34的表达水平,分析其可能存在的关系.结果 30例EBVaGC组织中不同TNM分期、有无周围淋巴结转移的LMP1蛋白的表达阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)；BHRF1表达和TNM分期、有无周围淋巴结转移有关联(P＜0.05).VEGF-C表达与周围淋巴结转移有关联(P＜0.05)；EBVaGC中MVD在不同TNM分期之间有统计学意义(P＜0.05)；MLVD与在不同TNM分期和有无周围淋巴结转移之间有统计学意义(P＜0.05).BHRF1的表达与MVD无统计学关联,而与MLVD有统计学关联(P＜0.05).VEGF-C阳性表达的19例EBVaGC组织中,MVD和MLVD均明显高于阴性组,两组比较其差异具有显著的统计学意义(P＜0.05).结论 EB病毒相关性胃癌中LMP1的表达率低,BHRF1的表达率高,可能与EB病毒相关性胃癌较少发生淋巴结转移有关.VEGF-C高表达说明VEGF-C可能参与EBVaGC的血管和淋巴管生成,其高表达间接促进肿瘤细胞沿新生的淋巴管迁徙和转移.

特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1 pSUPER retro RNAi系统的构建

目的构建并筛选携带针对Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆.方法用DNA重组技术,将60 bp能转录产生靶向LMP1小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆.结果重组逆转录病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7 167 bp和281 bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆.结论特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建和筛选成功.

鼻咽癌组织中潜伏膜蛋白的表达变化及意义

EB病毒编码的潜伏膜蛋白(LMP1)是目前惟一被证实具有转化上皮细胞功能的基因产物.2006年10月～2008年9月,我们检测了鼻咽癌组织中的LMP1,并探讨其与鼻咽癌发生发展的关系.现报告如下.

黑龙江地区淋巴瘤与EB病毒感染的相关性研究

目的:探讨黑龙江地区淋巴瘤的EB病毒(EBV)感染情况,分析其与EBV感染的相关性.方法:通过免疫组织化学和原位杂交的方法,检测122例淋巴瘤EBV-LMP1和EBER1/2的表达情况,分析其相关性,并复习文献.结果:56例霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)中有10例(17.8％)表达LMP1,15例(26.8％)表达EBER1/2:66例非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)中有22例(33.3％)表达LMP1,27例(40.9％)表达EBER1/2.NHL的EBV感染率明显高于HL(P ＜0.05)；LD型HL的EBV感染率高于LR型和NS型(P ＜0.05)；T/NK细胞淋巴瘤的EBV感染率显著高于B细胞淋巴瘤(P＜0.05).结论:黑龙江地区NHL的EBV感染率高于HL,LD型HL和T/NK细胞淋巴瘤与EBV感染有较高的相关性.

EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)与survivin在鼻咽癌中的表达

目的 探讨鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中EB病毒潜伏膜蛋白LMP1和survivin表达水平与预后的关系.方法 用免疫组化SP法对83例鼻咽低分化鳞状细胞癌组织进行LMP1和survivin标记,分析其与临床分期、放疗后三年内结果的关系.结果 LMP1的表达与临床分期无关(P＞0.05),但与放疗后三年内复发有关(P＜0.05).survivin与临床分期,放疗后三年内复发有关(P＜0.05).LMP1与survivin有相关(P＜0.05).结论 LMP1与survivin在鼻咽癌的预后中有重要价值,可作临床治疗的参考指标.

EB病毒LMP1与E-cadherin、ICAM-1在鼻咽癌组织中的表达及其相关性

目的 研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞黏附分子E-cadherin和ICAM-1表达的影响,探讨LMP1在鼻咽癌转移中的作用及其相关的机制.方法 应用免疫组织化学(SP法)分别检测LMP1、E-cadherin和ICAM-1蛋白在31例鼻咽粘膜慢性炎、32例鼻咽癌和24例鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中的表达.结果 LMP1和ICAM-1蛋白在鼻咽癌和鼻咽癌淋巴结转移灶中的阳性表达率显著高于在鼻咽粘膜慢性炎组织中的阳性表达率.E-cadherin蛋白在鼻咽癌和鼻咽癌淋巴结转移灶中的阳性表达率则显著低于在鼻咽粘膜慢性炎组织中的阳性表达率.Spearman相关分析显示,在鼻咽癌组织和鼻咽癌淋巴结转移灶中,LMP1与E-cadherin的表达呈负相关.而与ICAM-01的表达呈正相关.结论 在鼻咽癌和鼻咽癌颈部淋巴结转移灶中LMP1可能通过抑制E-eadherin的表达和促进ICAM-1的表达进而影响肿瘤细胞的黏附性.促进鼻咽癌的侵袭和转移.

普济煎液配合放、化疗治疗EB病毒感染鼻咽癌30例临床观察

目的:观察普济煎液配合放、化疗治疗EB病毒感染鼻咽癌患者的临床疗效.方法:筛选VcA-IgA、LMP1阳性鼻咽癌初诊患者为受试对象,以普济煎液配合放、化疗进行综合治疗,并以单纯放、化疗为对照.观察放疗后近期疗效并随访2年局部复发、远处转移及死亡病例数.结果:普济煎液能有效降低放、化疗后VCA-IgA阳性率、缩短肿瘤消退时间、减轻放、化疗反应、提高机体免疫功能及减少放、化疗后复发转移率.结论:普济煎液配合放、化疗对EB病毒感染鼻咽癌患者近期疗效及预后有一定改善作用.