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HLA-A寡核苷酸芯片检测条件的初步探索
寡核苷酸芯片(Oligochip)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术.寡核苷酸基因芯片的一个主要用途是基因突变的快速和高通量检测.本研究以HLA-A小型阵列为平台,探讨寡核苷酸芯片检测条件(样品制备方法和单链扩增条件)的简化和优化.
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聚类分析在自身免疫病基因表达谱研究中的初步应用
目的探讨聚类分析方法在自身免疫病基因表达谱研究中的应用价值.方法从正常对照及自身免疫病患者外周血提取总RNA, 逆转录合成单链、双链cDNA后,体外转录合成生物素标记的 cRNA与基因芯片进行杂交,再经抗原抗体反应和标记荧光染料Cy3标记后,用基因芯片扫描仪进行图像扫描.经Quant Array分析软件将扫描的图像信息转化为数据.然后,进一步将标准化的数据用Gene Spring分析软件进行试验样本和基因的聚类分析.结果 10例系统红斑狼疮(SLE)、1例多发性肌炎(PM)和1例类风湿关节炎(RA)患者与1名正常对照外周血细胞的基因表达谱是不同的,患者之间的表达谱因临床表现的异质性,其表达谱也有差别,但SLE的聚类可与PM、RA相区分,同一SLE患者,2次采血所得的表达谱具有极强的相似性.基因聚类分析显示,具有相似功能的基因具有相似表达模式,据此可发现许多已知基因的免疫功能.结论聚类分析方法能根据基因表达谱,将基因进行功能分类,故可将自身免疫病的样本进行疾病分类.因此,本方法可应用于基因表达谱数据的分析.
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寡核苷酸基因芯片筛选早期和晚期妊娠胎鼠皮肤内差异表达基因
胎鼠皮肤创面无瘢痕愈合发生在特定的妊娠时期[1].胎鼠这种无瘢痕愈合的发生机理尚不清楚,为此本研究利用基因微矩阵芯片技术的信息集约化、平行处理、高效、快速和多参量等特点[2],大规模筛选无瘢痕形成的早期妊娠胎鼠和有瘢痕形成的晚期妊娠胎鼠皮肤间基因表达的差异,以探讨胎鼠皮肤无瘢痕形成的机理.
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系统性红斑狼疮的发病机制进展
作为自身免疫病的原型,阐明系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus,SLE)的发病机制一直是风湿界研究和奋斗的目标,通过国内外学者的不懈努力,近来对SLE发病机制的认识有了长足的进步.2003年4个不同的实验室的寡核苷酸基因芯片研究结果都提示SLE病人的Ⅰ型干扰素调控的基因存在异常活化,因此Ⅰ型干扰素在SLE发病中的作用日益受到重视,2004年在德国柏林的EULAR会议也作了相应的报道.本文就EULAR会议上SLE发病机制方面作一些介绍.
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家族聚集性慢性HBV感染者外周血单个核细胞自噬相关基因表达谱研究
目的 应用寡核苷酸基因芯片技术,研究家族聚集性慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)自噬相关基因的表达谱,并进行功能分析.方法:在聚集性HBV感染家族中,选取患者9例和对照11例,提取PBMCs中的RNA,与涵盖2.2万个EST的寡核苷酸表达谱基因芯片U133A 2.0杂交,通过Affymetrix扫描仪和DNT分析软件比较患病组与对照组PBMC免疫相关基因的的表达谱,获得基因的相对表达比值;对差异表达基因进行功能分析.结果:在2.2万个EST中,192个与自噬相关,初筛出19个自噬相关差异表达基因,7个基因表达上调,17个表达下调,差异表达基因主要与自噬的起始、延伸、包裹和降解过程有关;功能分析发现慢性HBV感染者PBMCs的自噬水平下降.结论:慢性HBV感染者的PBMCs的自噬基因存在差异表达,其噬水平下降,可能与淋巴细胞老化过程有关.
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乙醇代谢相关酶寡核苷酸基因芯片的制备及应用
20世纪90年代,基因芯片技术在美国率先开展.我国基因芯片技术还处于刚起步阶段,本研究尝试制备寡核苷酸基因芯片检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP),并初步应用于酒精性肝病的研究.
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高白细胞性急性髓系白血病细胞基因表达谱的研究
[目的]综合分析高白细胞性急性髓系白血病不同预后患者祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性以及差异表达的基因.[方法]半固体集落形成法观察不同预后患者骨髓祖细胞集落形成及对化疗药物的敏感性.采用Affymetrix公司人类寡核苷酸表达谱芯片检测患者初诊时骨髓单个核细胞基因表达谱,筛选出差异表达数据.[结果](1)患者骨髓祖细胞集落形成和化疗药物的敏感性与预后密切相关,未缓解者的骨髓祖细胞集落明显高于完全缓解患者,且对化疗药物不敏感.(2)完全缓解患者白血病细胞表达上调2倍以上的基因109条,占0.5%.下调2倍以上的基因134条,占0.6%,其中与预后密切相关的为TRIM16、TM4SF1.CD34和DNMT3B.(3)差异表达的基因按功能分成离子通道运输、细胞周期、细胞骨架运动、细胞凋亡等14类.上调的主要为DNA合成修复、细胞凋亡、细胞周期和应激相关等4类;而下调的主要为蛋白翻译合成、信号传导传递、发育相关和细胞骨架运动等4类.[结论]特定的基因表达模式决定患者预后.
关键词： 高白细胞性急性髓系白血病 基因表达谱 寡核苷酸基因芯片 -
TUSC3基因在胰腺癌组织中的表达
目的 研究TUSC3基因在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达水平.方法 利用寡核苷酸基因芯片技术和实时定量PCR技术检测20例胰腺癌组织和6例正常胰腺组织中TUSC3基因的表达.芯片杂交结果进行Ratio值分析,实时定量PCR进一步验证杂交结果,PCR产物的定量方法采用比较Ct法.结果 芯片扫描图像信号清晰,具有较低的整体背景和较高的信噪比.与正常胰腺组织相比,TUSC3基因在胰腺癌组织中表达下调,平均Ratio值为0.297±0.38.荧光定量PCR结果:TUSC3基因平均模板量在正常胰腺组织中为0.0387493±0.00965,胰腺癌组织中为0.0206028±0.00401;与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中TUSC3基因表达下调1.88倍(P＜0.05).结论 TUSC3基因在胰腺癌组织中表达水平明显下调,其可能机制与该基因启动子区过甲基化有关,TUSC3基因在胰腺癌发生发展中的生物学效应值得进一步研究. .
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上行型与下行型鼻咽癌的基因差异表达研究
背景与目的:鼻咽癌(nasopharygeal carcinoma, NPC)发展至中晚期时,可表现为上行型、下行型或混合型.上行型、下行型具有显著不同的临床特征,治疗策略和预后转归也不同.寻找它们之间的分子差异,对鼻咽癌的分子分型、预后预测和发生发展机理研究具有重要意义.本研究旨在寻找上行型、下行型鼻咽癌之间的差异表达基因.方法:利用涵盖2.13万条基因的寡核苷酸基因芯片(oligo gene chip)技术,筛选上行型、下行型鼻咽癌组织之间的差异表达基因.进一步用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,分析其中一个差异表达基因在上行型、下行型鼻咽癌组织中的表达情况.结果:用Oligo基因芯片检测分析技术,在上行型、下行型鼻咽癌中发现了17条差异表达基因,其中SELB、 Clorf29、 GLE1L和FLJ20989基因在上行型鼻咽癌的表达高于下行型鼻咽癌,而ID12A、 ASPN、 DCN、 PRO2219、 LRDD、 DIO2、 ULBP2、PRO3073、 IGVH3、 IGVH4、 IGLJ3、 PRO0943和AK057247基因在下行型鼻咽癌的表达高于鼻咽癌上行型;差异倍数在2.30-4.23倍之间.用RT-PCR方法进行研究发现,DIO2基因在下行型鼻咽癌中有90%(9/10)表达较高,而在上行型中只有33.3%(3/9)表达较高,两组表达差异有统计学意义(P=0.020).结论:上行型、下行型鼻咽癌的基因表达差异有统计学意义;DIO2基因在下行型鼻咽癌的表达高于在上行型,其高表达可能与鼻咽癌的转移潜能密切相关.
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寡核苷酸阵列引物延伸技术在p53基因突变检测中的应用
背景与目的:越来越多的研究表明,许多疾病的发生、个体化治疗及预后与基因的SNP密切相关,对其快速、准确的检测在基因组研究和应用中具有重要的意义.本文应用寡核苷酸阵列引物延伸法对人类肿瘤相关性高的基因棗p53基因进行SNPs的平行检测.方法:根据寡核苷酸基因芯片上延伸引物的设计原则设计出12条p53基因第三外显子上的SNP检测的延伸引物,点样制备7×8点阵的寡核苷酸基因芯片,将巢式PCR扩增出的p53基因片段与芯片杂交,在Klenow酶的介导下进行荧光标记的碱基延伸反应、洗脱、扫描.同时p53基因片段进行测序分析.结果:经荧光检测分析,芯片经延伸反应后出现了明显的Cy3-dUTP或Cy5-dCTP荧光标记信号,检测灵敏度好,结果与测序验证结果一致.结论:采用寡核苷酸芯片的阵列引物延伸技术可以在基因水平实现对p53基因的多个位点的高灵敏度平行检测,是一种高效、价廉、准确的SNP检测方法.
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SARS冠状病毒检测60 mer寡核苷酸基因芯片的设计及应用
目的设计并应用60 mer寡核苷酸基因芯片实现对SARS冠状病毒的检测.方法根据寡核苷酸基因芯片的设计原则设计出30条60 mer的寡核苷酸片段,覆盖SARS冠状病毒(以TOR2株为参考序列,GENEBANK索取号:AY274119)全基因组,点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片,将临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA,采用限制性显示技术进行标记,将标记好的样品与芯片杂交,洗脱,扫描.初步探索寡核苷酸芯片诊断SARS冠状病毒的敏感性及特异性,并对芯片做进一步的优化.结果来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交,出现了明显的荧光信号;阴性和空白对照探针上没有杂交信号,而对照样品仅与一个SARS探针有杂交.结论采用60 mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对SARS冠状病毒多段序列的平行检测,对于提高检出率有一定意义,此外,尚可用于监测在发病过程的各个阶段中病毒基因的活动状况.
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家族聚集性慢性乙型病毒性肝炎患者PBMC免疫相关的基因表达谱
目的:应用寡核苷酸基因芯片技术,研究家族聚集性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMC)免疫相关基因的表达谱.方法:在一聚集性HBV感染家族中,选取患者5例和患者的正常配偶4例,提取PBMC中的 RNA,与涵盖2.2万个EST的寡核苷酸表达谱基因芯片U133A 2.0杂交,通过Affymetrix扫描仪和DNT分析软件比较患病组与对照组PBMC免疫相关基因的的表达谱,获得基因的相对表达比值.结果:在2.2万个EST中,初筛出24个免疫相关差异表达基因,7个基因表达上调,17个表达下调.上调的主要是与适应性免疫相关的基因,下调的主要是与固有免疫相关的基因.结论:宿主感染HBV后,可改变其免疫基因表达,固有免疫功能的障碍可能是HBV感染慢性化的主要原因.
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寡核苷酸芯片检测肺癌患者痰标本中p53点突变
目的:用寡核苷酸基因芯片方法检测肺癌患者痰标本中p53基因的热点突变,为肺癌的诊断探索快速、准确的基因检测途径.方法:收集肺癌患者痰标本并提取基因组DNA,用荧光标记的引物对DNA进行p53基因Exon 5、Exon 7 PCR扩增,然后用PCR扩增产物与基因芯片进行杂交,通过对杂交信号的检测,判断是否发生点突变,并用测序方法对部分阳性结果进行验证.结果:在27例肺癌患者痰标本中,p53基因突变的检出率为25.92％,其中小细胞肺癌的突变率为40％( 2/5)、肺鳞癌的突变率为26.6％(4/15)、肺腺癌的突变率为14.28％(1/7),检测到的突变位点有175(2)、248(1)、249(2),对2例阳性标本的测序证实了基因芯片的结果.结论:寡核苷酸基因芯片法可以快速、准确检测出肺癌患者痰标本中p53基因的点突变,今后可用该法对肺癌患者和高危人群的痰标本进行大规模筛选,提高肺癌的早期诊断率.
