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E1A基因对人宫颈癌细胞放射增敏的实验研究
目的 探讨E1A基因对人宫颈癌细胞的放射增敏作用及其初步的作用机制.方法 将人宫颈癌细胞(Hela)、转染空栽体纳米粒的人宫颈癌细胞(Hela-vector)及转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A)分别给以0、2、4、6和8Gy的6MV-X线照射,用集落形成法计算细胞存活分数及放射增敏比(SER),检测E1A基因对人宫颈癌细胞对放射线敏感性的影响;采用RT-PCR检测E1A基因的表达以及E1A基因对Her-2基因表达的影响,采用流式细胞术检测E1A基因对细胞周期的影响.结果 集落形成实验结果显示:经不同剂量照射后Hela-E1A组平均细胞存活分数明显低于Hela和Hela-vector组,而后两组相近.Hela-E1A组D0值为1.23,Hela和Hela-vector组D0值分别为2.51和2.59,放射增敏比(SER)=(2.04);RT-PCR结果显示:E1A基因在Hela细胞中能稳定表达,E1A基因的转染明显降低了Her-2基因在Hela细胞中的表达水平;流式细胞术结果显示:转染E1A基因后,细胞周期出现S期抑制,G2期阻滞.结论 E1A基因能够明显提高人宫颈癌细胞对放射线的敏感性,其作用机制可能与E1A基因抑制了该细胞Her-2基因的表达,使细胞周期再分布有关.
关键词： 人宫颈癌细胞 E1A基因 HER-2基因 PEI-Fe304纳米粒 放射增敏 -
E1A基因对人肺腺癌细胞增殖和细胞周期的影响
目的 探讨E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的抑制作用与细胞周期的关系及作用机制.方法 利用细胞增殖曲线和裸小鼠体内致瘤性实验研究E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析人肺腺癌细胞周期,以蛋白印迹方法 分析P16、P21、P53和cyclin B1水平变化.结果 转染E1A基因后,人肺腺癌细胞(Anip973-E1A)生长缓慢,体内致瘤性降低.Anip973-E1A细胞周期出现明显的S期抑制和G2/M阻滞,周期调控蛋白P16、P21、P53水平无明显变化,但cyclin B1表达明显下降.结论 E1A基因能显著抑制人肺腺癌细胞的体内外增殖,降低周期蛋白cyclin B1的表达,使细胞周期阻滞于G2/M,这可能与E1A基因抑癌作用有关.
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E1A基因对鼻咽癌放射敏感性影响动物实验研究
目的 大部分鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)具有高表达核转录因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)的特征,而后者与细胞凋亡途径相关,可能导致鼻咽癌对放射不敏感.本研究探讨E1A基因对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响及其可能机制.方法 取对数生长期的CNE-2细胞1×107 mL-1,接种于6周龄左右裸鼠左后肢腹股沟部皮下致瘤,当裸鼠移植瘤长至直径(8±0.5) mm时,随机分为4组(n=10):Ad-β-gal组(Control组),Ad-E1A组(Ad E1A组),放射组(RT组),Ad-E1A+放射组(Ad E1A+RT组).观察E1A基因联合放射对鼻咽癌裸鼠移植瘤的治疗效果;RT-PCR检测E1A基因对NF-κB表达的影响;凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测E1A基因对NF-κB活性的影响;蛋白质印迹法检测NF-κB、cIAP-1、cIAP-2和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平;TUNEL分析肿瘤细胞的凋亡水平;免疫组化分析Ki 67的表达.结果 与Control组相比,RT组、Ad-E1A组和Ad E1A+RT组均可抑制裸鼠移植瘤的生长,抑瘤率平均值分别为(35.87±4.58)％、(40.68±4.16)％和(89.15±4.63)％;与RT组相比,Ad-E1A+ RT组的抑瘤率为(74.3±3.21)％.鼻咽癌细胞无内源性的E1A表达,E1A基因能够在鼻咽癌移植瘤内稳定表达并且能够抑制NF-κB的表达;EMSA进一步证实了NF-κB活性的下降.蛋白质印迹法实验显示,Ad-E1A+ RT组的NF-κB、cIAP-1和cIAP-2蛋白表达较RT组明显下降(P＜0.05),Ad-E1A+RT组的Cleaved Caspase-3表达水平明显高于RT组,P＜0.05.TUNEL分析结果显示,Control组、RT组、Ad-E1A组和Ad-E1A+ RT组凋亡指数分别为(10.7±2.12)％、(21.4±3.45)％、(23.5±2.86)％和(65.8±3.62)％,Ad-E1A+ RT组肿瘤细胞凋亡数目明显高于RT组,两者之间差异有统计学意义,P＜0.01.免疫组化结果显示Ad-E1A+ RT组的Ki-67表达明显低于RT组,P＜0.01.结论 E1A可通过抑制NF-κB信号通路和诱导细胞凋亡来增加鼻咽癌对放疗的敏感性.
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E1A基因对鼻咽癌细胞放射敏感性影响的初步实验研究
目的 探讨E1A基因对鼻咽癌细胞放射增敏作用及相关机制.从而为提高鼻咽癌放射治疗疗效提供实验依据.方法 经腺病毒介导,将E1A基因导入人鼻咽癌细胞系CNE2细胞.经RT-PCR鉴定,获得含E1A的阳性克隆.将未转染的CNE2细胞、转染对照空载体Ad-B-gal的CNE2细胞和转染Ad-E1A的CNE2细胞用6 MV X线分别照射0、2、4、6、 8 Gy后进行成克隆分析并绘制细胞存活曲线,计算放射增敏比.流式细胞术和RT-PCR检测转染前后的细胞周期分布以及wtp53表达情况.结果 转染后阳性克隆细胞RT-PCR结果说明E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达.细胞存活曲线结果显示转染E1A的CNE2细胞放射增敏比分别为1.37(D_0值比)、1.95(D_q值比)、1.46(SF_2值比).未转染及空载体转染后的CNE2细胞照射后细胞存活曲线分析结果显示无差异,D0D_qSF2值分别为1.57 Gy及1.53 Gy、1.82 Gy及1.78 Gy、0.89及0.82.流式细胞术显示细胞周期出现G_2+M期阻滞,RT-PCR结果显示E1A基因能提高wtp53的表达.结论 E1A基因能显著提高人鼻咽癌细胞的放射敏感性,其作用机制可能与E1A基因提高叭p53基因的表达和引起G2+M期阻滞有关.
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E1A基因对喉癌细胞系放射敏感性的影响及机制的初步实验研究
目的 探讨ElA基因对喉癌细胞系(Hep-2细胞)放射敏感性的影响并初步探讨其机制.方法 以腺病毒为载体将E1A基凶及其空载体转染至人Hep-2细胞,经RT-PCR法鉴定获得含ElA的阳性兜隆.设未转染组(PBS)、转染空载体组(Ad-β-gal)和转染组(Ad-E1A),分别给予6 MVx线单次照射0、1、2、4、6、8、10 Gy,成克降实验绘制细胞存活曲线并计算D0、Dq、α、β值以观察E1A基因对Hep-2细胞放射敏感件的影响.设PBS组、Ad-β-gal组、Ad-E1A组、PBS+照射组、Ad-β-gal+照射组、Ad-E1A+照射组,单次照射6 Gy,流式细胞仪检测细胞凋亡及RT-PCR检测血管内皮牛长因子(VEGF)水平并半定量VEGF以初步探讨机制.结果 转染后的阳性克隆细胞RT-PCR结果显示E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达.Ad-E1A组、Ad-β-gal组、PBS组细胞的D0值分别为0.86、1.96、1.98 Gy,Dq值分别为1.02、1.97、1.99 Gy,α值分别为0.536、0.112、0.104(Gy-1)和β值分别为0.521、0.137、0.125(Gy-2).PBS组、Ad-β-gal组、Ad-ElA组、PBS+照射组、Ad-β-gal+照射组、Ad-E1A+照射组的细胞凋亡率分别为1.26%、1.18%、2.16%、2.55%、2.96%、4.96%.Ad-E1A组、PBS+照射组、Ad-βgal+照射组及Ad-ElA+照射组VEGF的表达水平较PBS组及Ad-β-gal组低,且Ad-E1A+照射组表达低.结论 成功构建了稳定表达E1A基因的喉癌细胞系.EIA基因对人喉癌细胞有放射增敏作用,其机制可能与降低VEGF表达和促进细胞凋亡有关.
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E1A基因通过抑制NF-κB信号通路增加鼻咽癌细胞放射敏感性实验研究
目的 探讨E1A基因对人鼻咽癌细胞放射敏感性的影响及其可能机制.方法 通过腺病毒载体介导,将E1A基因转染至鼻咽癌CNE-2R细胞,采用RT-PCR鉴定E1A基因的表达;分别给予未转染组(PBS组)、转染空载体Ad-β-gal组(Ad-β-gal组)和转染E1A组(Ad-E1A组)的CNE-2R细胞0、2、4、6、8 Gy照射,应用克隆形成实验检测各组CNE-2R细胞放射敏感性的变化;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;蛋白印迹法检测各组细胞NF-κB、CK2α、Bcl-2及Cleaved caspase-3蛋白的表达.结果 RT-PCR确认E1A基因已整合到CNE-2R细胞中且稳定表达;Ad-E1A组CNE-2R细胞克隆形成率明显少于PBS和Ad-β-gal组的克隆形成率,Ad-E1A组CNE-2R细胞SF2为0.217小于 PBS组和Ad-β-gal组的0.602和0.585(P<0.05),Ad-E1A组α/β值为24.68大于PBS组和Ad-β-gal组的5.268和5.132(P<0.05);流式细胞术显示单独放射可促进CNE-2R细胞的凋亡,当与E1A基因联合使用时,细胞凋亡率明显增加(P<0.05);蛋白印迹法显示E1A基因可下调NF-κB/P65、CK2α、Bcl-2和上调Cleaved caspase-3的表达.结论 E1A基因可以通过抑制CK2的表达阻断NF-κB信号通路以及促进细胞凋亡,来提高鼻咽癌细胞对放射的敏感性.
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纳米粒子介导E1A基因体外转染人甲状腺未分化癌细胞HTC/3
目的 探讨纳米粒子介导E1A基因转染人甲状腺未分化癌细胞HTC/3的可行性和效率,并检测转染细胞对X线的敏感性和X线诱导转染细胞凋亡.方法 应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小.用制备的包裹DNA纳米粒子转染人甲状腺未分化癌细胞HTC/3,并以阳离子脂质体为对照,用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测转染细胞(HTC/3-E1A)的E1A基因mRNA表达.四甲基偶氮唑盐(MTF)法检测HTC/3-E1A细胞、对照细胞的体外生长率和不同剂量X射线对HTC/3-E1A细胞的生长抑制率.HTC/3-E1A细胞经一定剂量X线(2 Gy)照射后,用流式细胞仪进行细胞周期分析,DNA电泳观察细胞凋亡.结果 制备的纳米粒子直径为150～280 nm,包埋率为0.78%,体外释放约为18 d.在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数多于脂质体组(P＜0.05).RT-PCR结果表明,纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因mRNA表达.HTC/3-E1A细胞群体生长缓慢,倍增时间延长(是亲本细胞的1.44倍).HTC/3-E1A细胞对X线敏感性较转染空载体细胞(HTC/3-Vect)和HTC/3细胞分别提高约2.9倍和2.8倍.流式细胞仪分析显示,HTC/3-E1A细胞亚G0/G1期比例显著高于HTC/3-Vect和HTC/3细胞(P均＜0.01),S期比例显著低于HTC/3-Vect细胞和HTC/3细胞(P均＜0.01).DNA电泳显示,HTC/3-E1A细胞出现典型的凋亡梯度变化,而HTC/3-Vect和HTC/3细胞无此变化.结论 纳米粒子可携带外源基因进行基因转染并获得表达,转E1A基因HTC/3细胞对X线敏感性明显提高,且X线诱导了转E1A基因HTC/3细胞凋亡.
关键词： 纳米粒子 载体 E1A基因 基因转染 人甲状腺未分化癌细胞系HTC/3 -
007 慢性阻塞性肺疾病炎症机制和腺病毒E1A基因在其中的作用
慢性阻塞性肺病(COPD)是一种常见的呼吸系统疾病,发病率高,呈缓慢进行性发展,严重影响人们的劳动能力和生活质量.其发病机制尚不甚清楚.近年来对此病的研究表明:慢性阻塞性肺病是一种炎症性疾病,其中炎症细胞、细胞因子及其它炎症介质、粘附分子等起重要作用,另外腺病毒E1A基因的存在也与此过程相关.对这些因素的深入研究,有助于COPD的早期治疗,降低发病率和死亡率.
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腺病毒5型E1A基因转染前后乳腺癌细胞相关指标水平的变化
目的 本研究旨在探讨E1A基因对乳腺癌细胞凋亡的影响,为乳腺癌E1A基因治疗的可行性提供理论和实验依据.方法 ①构建E1A基因真核表达质粒pEGFP-E1A:通过酶切反应获得E1A基因,琼脂糖凝胶回收后,连接入pEGFP-C1载体EcoRⅠ和BamH Ⅰ位点中.②E1A基因转染乳腺癌细胞系:脂质体介导将E1A基因转入乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株,经筛选获得稳定表达E1A基因的转染试验组细胞.③RT-PCR检测E1A基因的mRNA表达、western-blot检测E1A蛋白表达.流式细胞仪观察细胞凋亡率、免疫组化法检测HER-2/neu基因的表达水平,对比各组间的差异.结果 与对照组、空载体组相比,转染E1A基因后,E1A RNA和蛋白表达明显增高.SK-BR-3肿瘤细胞HER2/neu的表达明显降低,凋亡率增高.结论 本实验成功构建并稳定表达了E1A基因质粒,明显抑制乳腺癌细胞的生长,说明E1A基因在乳腺癌基因治疗中有重要意义,为其临床应用提供了理论和实验依据.
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腺病毒5型E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响
目的 探讨E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响.方法 双酶切质粒pUC119-E1A,获得E1A基因,连接入pEGFP-C1载体,构建真核表达质粒pEGFP-E1A.经脂质体介导转染人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株,经筛选获得稳定表达E1A基因的转染细胞.RT-PCR检测E1A基因的mRNA转录水平.体外观察各组细胞软琼脂集落及对抗肿瘤药物顺铂的敏感性.结果 RT-PCR结果显示,只有重组质粒pEGFP-E1A转染的细胞在约380 bp处有一特异性扩增条带,与未转染组和空载体转染组相比,转染E1A基因后,SK-BR-3肿瘤细胞在软琼脂中形成的集落明显变小,集落形成率明显降低,对顺铂的敏感性明显提高.结论 已成功构建E1A基因表达质粒,并稳定表达了E1A基因,表达产物明显抑制乳腺癌细胞的生长,有效提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为其临床应用提供了理论和实验依据.
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腺病毒E1a基因增强P16基因诱导SMMC-7721肝癌细胞的凋亡
目的:研究腺病毒E1a基因与P16抑癌基因协同对肝癌SMMC-7721细胞凋亡和增殖的影响,探索肿瘤基因治疗新模式.方法:构建E1a基因真核表达质粒pDC315-E1a和携带P16的重组病毒AdCMV-P16,RT-PCR和免疫荧光标记法检测pDC315-E1a质粒转染或AdCMV-P16病毒感染后SMMC-7721细胞中P16和E1a的表达.建立裸鼠SMMC-7721细胞移植瘤模型,pDC315-E1a和AdCMV-P16单独或联合治疗,观察其对移植瘤生长的抑制作用,免疫组化和TUNEL法分别检测移植瘤组织中P16、E1a蛋白的表达和移植瘤细胞的凋亡.结果:SMMC-7721细胞感染AdCMV-P16或转染pDC315-E1a后,P16、Ela mRNA和蛋白水平均呈阳性表达.与空白对照组相比,AdCMV-P16治疗组移植瘤细胞凋亡率为(14.3±2.5)％(P＜0.01),抑瘤率为36.1％(P＜0.01)；pDC315-E1a治疗组抑瘤率为17.1％ (P ＞0.05),移植瘤细胞凋亡率为(8.5±2.9)％(P＜0.01)；AdCMV-P16联合pDC315-E1a治疗组移植瘤细胞凋亡率为(27.3±6.3)％(P＜0.01),抑瘤率达57.2％(P＜0.01).结论:腺病毒E1a基因能够增强P16基因对肝癌SMMC-7721细胞移植瘤的抑制作用,促进移植瘤细胞的凋亡,增强P16基因治疗的效果.
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E1A抑制鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长并增强其对放疗的敏感性
目的:探讨E1A基因对人鼻咽癌CNE2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用和对放疗的增敏作用及其相关机制.方法:以腺病毒为载体,将E1A基因导入CNE2细胞.获得含E1A的阳性克隆.通过裸鼠致瘤实验,观察E1A基因的抑瘤作用.观察E1A基因疗法及其与放疗联合应用对CNE2细胞裸鼠移植瘤的疗效.RT-PCR法检测E1A基因治疗对P53基因表达的影响.结果:建立稳定转染Ad-E1A的CNE2阳性细胞克隆(CNE2-Ad-E1A),CNE2-Ad-E1A组小鼠细胞移植瘤较CNE2组和CNE2-Ad-β-gal组(稳定转染Ad-β-gal对照质粒的CNE2细胞)成瘤时间晚、肿瘤小.单纯放疗、单纯Ad-E1A基因治疗及Ad-E1A+放疗3种治疗方法均可抑制CNE2裸鼠移植瘤的生长,抑瘤率分别为(60.32±5.34)%、(70.53±6.12)%和(97.15±4.87)%.E1A基因治疗能上调鼻咽癌组织中P53的表达.结论:E1A可抑制人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长并增加其对放疗的敏感性,该作用可能与E1A上调P53基因的表达有关.
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重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用
目的:探讨含腺病毒基因E1A、融合自杀基因CDglyTK及报告基因GFP的重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK与酶前体药物5-FC和(或)GCV联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用.方法:将重组腺病毒质粒prAd-E1A-CDglyTK经脂质体介导转染293细胞,进行病毒的扩增、纯化与PCR鉴定,以紫外分光光度法与TCID50法测定纯化病毒的颗粒浓度与感染性滴度,计算病毒比活性;在SKOV3细胞中观察重组病毒的复制能力及感染效率,确定感染率达90%以上的小MOI.用MTT法观察感染重组病毒的SKOV3细胞对5-FC或GCV的敏感性,并计算IC50;观察一定MOI的rAd-E1A-CDglyTK或重组复制缺陷型腺病毒rAd-CDglyTK与IC50的5-FC和(或)GCV联合应用对SKOV3细胞生长的抑制作用.结果:经PCR和琼脂糖凝胶电泳证实,纯化重组腺病毒中存在E1A和CDglyTK两个基因片段,其病毒颗粒浓度和感染性滴度分别为9.47×1011VP/ml和3.16×1010IU/ml,病毒比活性为3.34%.重组病毒可在SKOV3细胞中复制,对SKOV3细胞的感染效率随MOI的增加而增加,可致细胞感染率达90%以上的小MOI为50 IU/cell.5-FC或GCV明显抑制感染细胞的生长,且存在明显的剂量依赖效应.两种重组腺病毒/前药系统的抑瘤作用比较显示,rAd-E1A-CDglyTK组细胞生长抑制率[(16.57±1.59)%]显著高于rAd-CDglyTK组[(10.44±1.80)%,P<0.01];与IC50的5-FC和GCV双药联合应用,其抑制率达(71.68±2.63)%,显著高于rAd-CDglyTK/5-FC+GCV组的(63.64±2.91)%(P<0.01).结论:重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK与酶前体药物联合应用对卵巢癌SKOV3细胞具有显著的抑制作用,其效果优于重组复制缺陷型腺病毒rAd-CDglyTK.
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选择性杀伤CEA阳性结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体的构建及应用
目的 构建能选择性杀伤表达癌胚抗原(CEA)的结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体.方法 PCR扩增CEA基因5'端调控序列,构建以EGFPLuc作为报告基因的表达质粒pCEA-EGFPLuc.利用脂质体将pCEA-EGFPLuc导入CEA阳性和阴性细胞中,通过检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达和荧光素酶(luciferase)活性,评价CEA启动子活性.构建由CEA启动子调控的E1A,并携带HSVtk基因的条件复制型腺病毒Ad.CEA-E1A/CMV-TK,分别感染CEA阳性肿瘤细胞(Lovo和SW620)和阴性肿瘤细胞(HeLa),通过E1A表达和细胞存活率检测,评价该病毒对CEA阳性肿瘤细胞的选择性杀伤效果及联合应用环氧鸟苷(GCV)后的协同效应.结果 CEA启动子具有较好的选择性和较高的活性.Ad.CEA-E1A/CMV-TK只在CEA阳性的肿瘤细胞中表达E1A.感染Ad.CEA-ElA/CMV-TK后,Lovo和SW620细胞的存活率分别为(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%,均显著低于HeLa细胞的(87.44±2.76)%(P<0.01);联合GCV对Lovo和SW620的杀伤效果增加,细胞存活率分别为(17.26±3.65)%和(23.93±5.40)%,显著低于未加GCV的(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%(P<0.01).结论 由CEA调控复制的Ad.CEA-E1A/CMV-TK对CEA阳性的结直肠癌细胞具有选择性杀伤作用,联合GCV后杀伤效果明显增强.
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聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应
目的 以自行合成的聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)纳米凝胶为载体转染E1A基因,并观察E1A基因对肝癌细胞体外生长的抑制作用及其对化疗药物的增敏效应,初步探讨其作用机制.方法 经PEI介导,将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人肝癌H22细胞,RT-PCR证实其转染,G418筛选出阳性克隆细胞,观察EIA基因对该细胞系生长的抑制作用.用MTT法测定转染E1A基因前后,顺铂、泰素、5-氟尿嘧啶、博来霉素对肝癌H22细胞的效应.结果 质粒psv-E1A测序结果与基因库E1A基因序列完全相符.G418筛选出阳性克隆细胞.RT-PCR结果显示PEI能转染质粒psv-E1A并有稳定的表达.转染E1A基因后,H22-E1A细胞对顺铂、博来霉索、泰素的敏感性显著提高(P<0.01),而对5-氟尿嘧啶的敏感性无明显变化(P>0.05).结论 PEI能正常转染质粒psv-E1A, E1A基因能够明显抑制肝癌H22细胞的生长,并明显提高其对顺铂、博来霉索及泰素等化疗药物和放射线的敏感性.其机制可能与E1A基因改变肿瘤细胞的增殖状态和细胞周期时相有关.
关键词： E1A基因 基因转染 肝癌细胞 聚乙烯亚胺 四甲基偶氨唑盐微量染色法 -
一种新的重组腺病毒的构建及其对人肿瘤细胞的影响
腺病毒E1A基因诱导细胞凋亡,E1B19K基因及E1B55K基因抑制细胞凋亡,前者被克隆到腺病毒转移载体pCA13的HCMV IE启动子下游,构建成转移载体pCAE1A.采用lipofectin法将pCAE1A和含腺病毒基因组(E1区、E3区缺失)的质粒pBHG11共转染293细胞,7～10 d后得到重组病毒v5Ad4.用v5Ad4感染人肺腺癌细胞系A549,结果表明v5Ad4有明显杀伤和裂解肿瘤细胞功能.在人胚肺正常二倍体细胞中,v5Ad4没有表现出可见的细胞毒效应.
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E1A基因对喉癌Hep-2细胞体外生长和增殖的影响
目的 探讨E1A基因与喉癌Hep-2细胞生长和增殖的关系.方法 将Ad-E1A和对照空载体组Ad-β-gal在293细胞中扩增后提取、纯化并滴定,将其转染至喉癌Hep-2细胞,转染后将Hep-2细胞分为空白组(PBS组)、对照组(Ad-β-gal)和实验组(Ad-E1A组).经RT-PCR鉴定,采用胎盘兰染色并计算细胞数及MTT法绘制细胞生长曲线并计算倍增时间;采用流式细胞术计算分析细胞周期.结果 RT-PCR结果显示E1A已整合到Ad-E1A转染的细胞基因组中并且稳定表达.实验组(E1A组)细胞生长减慢,倍增时间分别是空白组(PBS组)、对照组(Ad-β-gal组)的1.72倍和1.70倍.流式细胞术结果显示转染E1A的细胞出现S期减少和G2/M期被阻滞.结论 ①E1A基因可以抑制喉癌Hep-2细胞在体外的生长,延长其倍增时间.②E1A基因可以改变喉癌Hep-2细胞的细胞周期,使S期细胞减少,G2/M期被阻滞.
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腺病毒E1A基因对人宫颈癌细胞体外增殖抑制的实验研究
目的:探讨聚已烯亚胺-四氧化三铁(PEI-Fe3O4)纳米粒E1A基因对人宫颈癌细胞体外增殖的抑制作用及其作用机制,为宫颈癌E1A基因治疗的可行性提供实验依据.方法:E1A基因经PEI-Fe3O4纳米粒载体介导转染人宫颈癌细胞(Hela细胞),用细胞计数法测绘生长曲线、计算倍增时间及软琼脂集落形成数目,观察E1A基因对该细胞系体外生长的影响.采用RT-PCR 和 Western印迹检测E1A基因在宫颈癌细胞中的表达及对HER-2/neu基因表达的影响.结果:转染E1A基因的人宫颈癌细胞系生长缓慢,倍增时间延长,是转染空载体组的1.53倍, 是Hela细胞组的1.58倍 ;未经转染的Hela细胞系、转染空载体纳米粒的Hela细胞系(Hela-vect)及转染E1A基因的Hela细胞系(Hela-E1A),细胞集落形成率分别为30.48%,28.32%和6.62%,转染E1A基因组(Hela-vect)明显低于Hela和Hela-vect组(均P＜0.05).与Hela及Hela-vect组的集落形成率相比,Hela-E1A组集落形成抑制率分别为78.28%和76.62%.RT-PCR和Western印迹结果显示,E1A基因能在Hela细胞中稳定表达,且显著降低了HER-2/neu在宫颈癌细胞中的mRNA和蛋白表达水平.结论:PEI-Fe3O4纳米粒E1A基因能够明显抑制人宫颈癌细胞的生长,其作用机制可能与E1A抑制HER-2/neu基因的表达有关.
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E1A基因对人乳腺癌细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨
目的 探讨E1A基因对人乳腺癌细胞化疗药物的增敏作用及相关机制.方法 通过PEI-Fe3O4纳米粒介导将E1A基因导入人乳腺癌细胞系MCF-7,经G418筛选获得稳定表达E1A的转染细胞(MCF-7-E1A).用不同浓度的表阿霉素、泰素帝及5-氟尿嘧啶等化疗药物处理细胞,通过MTT法测绘细胞存活曲线,观察E1A基因对表阿霉素、泰素帝、和5-氟尿嘧啶等化疗药物敏感性的影响;用同浓度的泰素帝和5-氟尿嘧啶处理细胞,观察E1A基因在不同时间对癌细胞存活率的影响.结果 转染E1A基因的人乳腺癌细胞(MCF-7-E1A)对表阿霉素和泰素帝的敏感性显著增加,与MCF-7和MCF-7-vect细胞系比较,MCF-7-E1A细胞对表阿霉素和泰素帝的敏感性增加11倍和15倍;对5-氟尿嘧啶的增敏作用不明显.结论 E1A基因能显著增加人乳腺癌细胞对表阿霉素和泰素帝等化疗药物的敏感性.
关键词： E1A基因 人乳腺癌细胞 化疗敏感性 PEI-Fe3O4纳米粒 -
E1A基因对裸鼠移植瘤化疗增敏的实验研究
目的 探讨E1A基因对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤化疗的增敏作用及其相关作用机制.方法 通过E1A基因对裸鼠移植瘤化疗增敏实验,观察E1A基因对裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响;采用RT-PCR鉴定E1A在肿瘤细胞中的表达及E1A转染后对HER-2/neu基因表达的影响.结果 E1A基因化疗增敏实验结果显示:E1A基因组裸鼠肿瘤体积缩小明显,肿瘤重量明显小于对照组及空载体组(均P＜0.05);而后两组差异无显著性(P＞0.05).RT-PCR结果显示:E1A基因在宫颈癌细胞中能稳定表达并且显著降低HER-2/neu在宫颈癌细胞中的表达水平.结论 E1A基因能够显著增加紫杉醇对裸鼠移植瘤的药物敏感性.该作用机制可能与E1A基因降低HER-2/neu蛋白的表达有关.
