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荧光定量聚合酶链反应直接检测血清中乙型肝炎病毒核酸方法的建立及评价
荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术灵敏度高,速度快[1,2],已被临床广泛应用.然而,尽管该方法采用尿嘧啶糖基酶(UNG)等防交叉污染措施,但由于进行核酸提取时,用的是非封闭式人工操作,很难实现真正意义上的零污染(避免假阳性).
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胃癌微转移基因检测的临床应用
目的:探讨荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)扩增P53基因作为检测胃癌血行微小转移方法的可行性及其表达的临床意义.方法:应用对胃癌患者转移(n=12)和无转移组(n=18)的外周血的基因进行检测,分析这两组基因的表达与胃癌转移复发之间的关系,并将FQ-PCR与普通PCR的敏感性进行比较.结果:胃癌患者30例,在转移组中P53基因表达检出为58.3%(7/12);而无转移组中为11.1%(2/18).两组比较,具有显著性差异(P＜0.01),表明外周血癌基因表达与转移复发是相关的,其他病种患者外周血中无阳性表达,而28名健康献血员中均为阴性.结论:P53基因可作为胃癌微小转移的重要指标,FQ-PCR是检测微小转移的敏感方法,对胃癌的早期诊断和预测微小转移有一定的临床价值.
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Aiolos基因mRNA表达与支气管哮喘发病的相关性
Aiolos是表达在淋巴细胞内的转录因子,对淋巴谱系细胞的发育有着重要的作用.近年Aiolos在淋巴瘤以及淋巴细胞白血病等系统疾病中已有突破性发现,支气管哮喘(简称哮喘)的发生与发展与淋巴细胞及其分泌的细胞因子密切相关,我们采用SYBR Green荧光实时定量聚合酶链式反应(PCR)法检测33例哮喘患者及38名健康人外周血中Aiolos mRNA的表达,探讨Aiolos mRNA的表达差异与哮喘发病间的关系.
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Wistar大鼠smad3 cDNA序列测定及其mRNA水平实时荧光定量PCR检测方法的建立
目的:克隆和测定Wistar大鼠smad3基因部分序列,构建检测Wistar大鼠smad3基因表达的重组质粒标准品并建立实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法.方法:提取并培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞的总RNA,逆转录(RT)-PCR扩增,将扩增产物克隆到PMD-18 T载体上,测序分析.用已测定序列的T载体作为标准品建立实时荧光定量PCR方法,并检测转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激对培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3 mRNA表达的影响.结果:测定Wistar大鼠smad3基因cDNA序列长415 bp,其与人、家鼠、小鼠具有较高的同源性,已被GenBank收录(DQ409172).建立的实时荧光定量PCR方法在103～107拷贝数/μl的标准品梯度稀释范围内相关系数为0.989 46.25 ng/ml TGF-β1刺激后Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3基因表达升高为PBS刺激对照组的1.5倍.结论:获得Wistar大鼠smad3基因序列并成功建立了smad3实时荧光定量PCR的方法,为Smad3作用的分子机制研究提供了实验基础.
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FQ-PCR技术检测乳腺癌HER2基因
我们初步探索了采用即时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)方法检测乳腺癌组织中HER2的可行性,现报告如下.
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定量聚合酶链式反应技术检测骨关节炎软骨组织中纤维连接蛋白mRNA的表达水平
目的:探讨纤维连接蛋白(FN)mRNA表达水平的变化与骨关节炎的关系.方法:采用石膏管型固定右膝关节,人工制作骨关节炎动物模型作为实验组,另设对照组,采用定量聚合酶链式反应方法检测FN mRNA表达水平的变化.结果:Wistar鼠正常膝关节的软骨组织与人工制造膝关节骨关节炎的软骨组织中均存在FN mRNA表达,但其表达水平在骨关节炎的软骨组织中显著低于正常膝关节的软骨组织(P＜0.01).结论:软骨组织中FA mRNA表达水平降低可能是骨关节炎发生和难以愈合的原因之一.
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乳鼠心室肌起搏电流的特点及其基因的表达
目的 研究乳鼠心室肌细胞起搏电流(If)的特点,并运用实时定量聚合酶链式反应(PCR)分析乳鼠心室肌If基因的表达.方法 通过酶消化法分离乳鼠心室肌细胞,用光镜、透射电镜、免疫组化鉴定心肌细胞;用全细胞膜片钳技术记录If并研究其特性;采用SYBR-Green I染料进行实时定量PCR,测定乳鼠心室肌If基因即超极化激活的环核苷酸门控通道(mHCN)亚型2和mHCN4的表达.结果 光电显微镜下见搏动频率50～100次/分的细胞团;透射电镜看到丰富的线粒体、肌丝明显;用抗肌动蛋白α-actin的单克隆抗体鉴定心肌细胞,95%以上呈现阳性.全细胞膜片钳记录到心室肌细胞的If,并得到电流密度-电压曲线,其激活电压约为-75 mV;实时定量PCR检测mHCN2:mHCN4为(5.15±0.19):1.结论 乳鼠心室肌细胞有超极化激活、可被Cs+阻断的If,其基因表达以mHCN2为主.
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基于定量聚合酶链式反应技术的多囊卵巢综合征与促卵泡激素的受体基因多态性的相关性研究
目的 多囊卵巢是造成不孕和子宫内膜癌等疾病的重要因素之一,该研究目的是探索多囊卵巢与相关单核苷酸的多态性位点相关性.方法 该研究首先提出了一种改良的等位特异的定量聚合酶链式反应技术并对其进行了可靠性评估,随后对多囊卵巢患者和对照样本进行了卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点进行了分型鉴定.结果 该研究结果显示其提出的改良的定量聚合酶链式反应方法进行单核苷酸的多态性位点分型准确度高,区分度好,与Sanger测序法获得的结果完全一致,能够很好的用于单核苷酸的多态性等多态性位点的分型鉴定;该实验对152例多囊卵巢患者和152例对照样本中卵泡刺激素受体基因两个单核苷酸的多态性位点分型检测结果显示Thr307Ala和Asn680Ser两个位点的等位基因频率和基因型频率均呈现了与多囊卵巢之间的显著相关性.结论 该研究结果表明卵泡刺激素受体基因的两个单核苷酸的多态性位点可能与多囊卵巢的发病密切相关,为深入探讨该疾病和进一步研究单核苷酸的多态性分型奠定了基础.
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PDGF-BB与脊柱黄韧带增生肥厚致腰椎管狭窄的相关性研究
目的：探讨血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）在腰椎黄韧带中的表达与黄韧带增生肥厚致腰椎管狭窄的相关性。方法：10例黄韧带增生肥厚腰椎管狭窄者为LSS组，10例腰椎间盘突出症者为LDH组，术前采用腰椎核磁共振的T1轴位加权像，经腰椎关节突平面定位，精确测量两组黄韧带厚度；分别采用实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）法、免疫印迹法（Western Blot）对比检测正常黄韧带与增生肥厚黄韧带腹侧、增生肥厚黄韧带背侧PDGF-BB mRNA和PDGF-BB蛋白表达的差异。结果：LSS组黄韧带显著厚于LDH组（P<0.05）；增生肥厚黄韧带内部纤维化程度明显高于正常黄韧带（P<0.05）， PDGF-BB主要在增生肥厚黄韧带背侧呈显著表达；退变增生肥厚黄韧带背侧PDGF-BB mRNA表达显著高于正常黄韧带（P<0.05）；退变增生肥厚黄韧带背侧PDGF-BB蛋白表达显著高于正常黄韧带（P<0.05）。结论：PDGF-BB在增生肥厚黄韧带内背侧过度表达是引起脊柱黄韧带增生肥厚的主要原因，并导致腰椎管狭窄症。
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定量聚合酶链式反应技术检测溃疡创面纤维连接蛋白表达水平的变化
目的研究纤维连接蛋白在糖尿病患者足溃疡组织中的表达特征与规律,探讨纤维连接蛋白表达量的变化与糖尿病足溃疡发生的关系.方法取患者溃疡创面及创缘组织为实验组,以患者正常皮肤为对照组,采用定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测纤维连接蛋白mRNA表达水平的变化.结果在正常皮肤组织和溃疡组织中均存在纤维连接蛋白mRNA的表达,但其表达水平在溃疡组织中显著低于正常皮肤,表达量约为正常皮肤的34%.结论糖尿病患者足溃疡组织中纤维连接蛋白mRNA表达水平降低,这种转录水平的下调可能是慢性难愈合溃疡发生的机制之一.
