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DNA聚合酶a反义寡聚脱氧核苷酸抑制人胃癌细胞生长的研究
肿瘤的特异性治疗一直是医学上的难题,常规的化疗药物对肿瘤的治疗效果不满意,而且副反应明显.近年来,应用人工合成的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)与靶基因或mRNA特异性互补结合,通过抑制与肿瘤发生及发展密切相关的基因产物的表达而达到特异性治疗目的[1,2].我们设计并合成了互补于DNA聚合酶a(DNA polymerase-a,DNApol-a)的ASODN,作用于人胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803,并用正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作对照,观察其特异性抑制癌细胞生长的效应.
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抗血管治疗联合抗血管生成治疗恶性肿瘤
近年来开展的通过抑制肿瘤血管生成而达到阻止肿瘤迅速生长和转移的治疗方法,即抗肿瘤血管生成治疗(anti-angiogenesis therapy)已成为肿瘤治疗研究热点之一.本期刊登的<重组人血管内皮抑素腺病毒对人癌裸小鼠移植瘤的抑制作用>、<肝癌患者血浆血管内皮生长因子的表达及动脉化疗栓塞对其影响的初步研究>、<血管内皮生长因子反义寡聚脱氧核苷酸与碘油混合栓塞治疗大鼠肝癌的实验研究>3篇论著,拓展了抗血管治疗联合抗血管生成治疗恶性肿瘤的思路,对推动抗血管生成治疗及其在介入治疗中的应用具有一定指导作用.
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反义寡聚脱氧核苷酸抑制脑胶质瘤多药耐药基因1的表达
目的研究多药耐药基因1(MDR1)反义寡聚脱氧核苷酸对胶质瘤耐药细胞系C6/adr中MDR1表达的抑制作用.方法以胶质瘤细胞株C6/adr作为胶质瘤体外耐药模型,针对MDR1基因mRNA的AUG起始区-9～+6序列合成反义和相应的正义寡聚脱氧核苷酸,均经硫代磷酸化修饰.反义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-AS)序列为5'-CTCCATCACCACCTC-3',正义寡聚脱氧核苷酸(MDR1-S)序列为5'-GAGGTGGTGATGGAG-3'.在脂质体介导下MDR1-AS、MDR1-S转染C6/adr细胞,48 h后利用形态学观察和噻唑蓝快速比色法检测MDR1-AS的细胞毒性作用;半定量RT-PCR检测MDR1-AS处理前后的MDR1 mRNA的差异表达;流式细胞术分析P糖蛋白(P-gp)的阳性细胞率.结果MDR1-AS对C6/adr细胞无毒性作用;MDR1-AS处理后MDR1 mRNA的差异表达由处理前的106%降至30.44%;P-gp阳性表达率亦由处理前的100%降至32.77%.结论MDR1反义寡聚脱氧核苷酸可有效抑制MDR1mRNA及P-gp的表达,从而为基因治疗耐药胶质瘤提供了实验依据,有望开发成为逆转胶质瘤耐药的反义药物.
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脂质体-C-erbB2反义寡核苷酸对卵巢癌细胞的作用
目的探讨脂质体-硫代磷酸化修饰的C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 antisense phosphorothioated oligodeoxynucleotides, C-erbB2 S-ODNs)对卵巢癌细胞系C-erbB2癌基因表达及细胞增殖的影响.方法采用流式细胞仪技术,3H-TdR掺入方法了解脂质体-C-erbB2 S-ODNs对卵巢癌细胞系SKOV3 C-erbB2癌基因表达及细胞生长,细胞周期的作用.结果脂质体-C-erbB2 S-ODNs能降低C-erbB2的表达,并抑制细胞生长达30%;脂质体-C-erbB2 S-ODNs较单用C-erbB2 S-ODNs的作用效率增强约40倍.结论 C-erbB2 癌基因的反义调控可能在卵巢癌基因治疗中有一定作用;脂质体能够有效地增强C-erbB2 S-ODNs的作用效率.
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端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的影响
目的 观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用.方法 用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后,观察细胞形态变化,检测细胞DNA含量的分布,测定端粒酶活性.结果 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在G1期前出现亚二倍体凋亡峰,端粒酶活性抑制.结论 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能抑制端粒酶活性,诱导胃癌细胞凋亡,从而抑制胃癌细胞的增殖.
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端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对子宫内膜癌细胞株的影响
目的 观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对癌细子宫内膜癌细胞株的作用.方法 用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与子宫内膜细胞株共同温育一定时间后,观察细胞形态变化,检测细胞Bcl-2蛋白表达情况,测定端粒酶活性.结果 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导子宫内膜癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为出现细胞质浓缩,变圆,核染色不均匀,核物质边聚成新月形或块壮;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,反义寡核苷酸在细胞进入DNA合成期前引起DNA 损伤,使细胞停滞在G0~G1期,并诱导细胞凋亡.结论 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能抑制端粒酶活性,诱导子宫内膜癌细胞凋亡,从而抑制子宫内膜癌的增殖.
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α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞生物学特性的影响
目的 探讨应用α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞生长、胶原合成等生物学特性的影响.方法 根据转染液分3组,实验组为脂质体加α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸;对照组1为脂质体组;对照组2为培养基空白对照组.用脂质体法将α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸转染增生性瘢痕成纤维细胞并运细胞计数法绘制细胞生长曲线;电子透射电镜观察转染后各组HF超微结构的变化;转染后0.5、1、3、5、7 d 分别提取各组细胞总RNA,行RT-PCR后测定各组Ⅰ胶原mRNA 表达量;Western-bloting法检测转染后各组Ⅰ型胶原蛋白的变化.结果 ①反义寡聚脱氧核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖无抑制;②实验组增生性瘢痕成纤维细胞蛋白合成的细胞器呈非活跃状态;③与对照组比较,实验组HF的α1(Ⅰ)型前胶原蛋白mRNA 的表达和Ⅰ型胶原合成量明显减少.结论 α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸能抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的α1(Ⅰ)型前胶原蛋白mRNA 的表达和Ⅰ型胶原蛋白的合成,提示可能抑制瘢痕增生.
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EBV-LCLs内Bcl-2水平与其对NK胞毒作用敏感性的相关性研究
目的：探讨EB病毒感染细胞内Bcl-2水平与其对NK胞毒活性及对凋亡诱导因素敏感性之间的关系。方法：应用反义寡聚脱氧核苷酸，抑制EB病毒转化B淋巴母细胞样细胞系(EBV-LCLs)胞内Bcl-2基因表达。然后观察NK细胞对其杀伤活性的改变以及其对致凋亡因素(地塞米松、撤除生长因子)敏感性的变化。结果：EBV-LCLs胞内Bcl-2表达水平与其对NK细胞杀伤的敏感性呈负相关(P＜0.01)；与无血清培养条件下EBV-LCLs细胞存活率呈正相关(P＜0.01)；与EBV-LCLs对地塞米松致凋亡作用的敏感性呈负相关(P＜0.01)。结论：胞内Bcl-2水平可能是决定靶细胞对NK细胞杀伤活性敏感性的关键因素之一，NK细胞对EBV-LCLs的杀伤机制之一可能是诱导细胞凋亡。
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端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞株端粒酶活性作用的实验研究
观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞株的作用.用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与肝癌细胞株共同孵育一定时间后,观察细胞形态变化、细胞DNA含量的分布,测定端粒酶活性.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在G1期前出现亚2倍体凋亡峰;端粒酶活性抑制.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导肝癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒合成,从而抑制肝癌细胞的生长.
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Survivin反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞生长的抑制
目的:观察survivin反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用.方法:用ASODN与人胃癌细胞SGC-7901共同温育一定时间后,PCR检测ASODN处理后肿瘤细胞survivin mRNA 的表达,倒置显微镜、电镜观察细胞生长形态变化,DNA电泳检测细胞DNA片段化分布,流式细胞术检测ASODN作用后人胃癌细胞SGC-7901的凋亡,TRAP法测定细胞端粒酶活性,MTY法检测ASODN对胃癌细胞增殖的抑制;上述实验以胃癌细胞不加ASODN和加无关寡聚脱氧核苷酸为对照.结果:ASODN作用后,肿瘤细胞survivin mRNA的表达受到明显抑制.survivin ASODN能诱导人胃癌细胞凋亡,在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;电泳呈凋亡特征性ladder 条带;流式细胞术分析显示,在G1期前出现亚2倍体凋亡峰,肿瘤细胞凋亡率显著增高[(7.01±0.21)%1/vs(25.00±0.52)%,P＜0.01].ASODN作用后SGC-7901细胞端粒酶活性明显受到抑制(P＜0.01).ASODN作用能明显抑制胃癌细胞的增殖,而且随ASODN浓度的增加(2×10-5×10-5mol/L)和作用时间延长(24～96 h)而加强(P＜0.05或P＜0.01).结论:survivin反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡,从而抑制胃癌细胞的增殖.
关键词： Survivin基因 反义寡聚脱氧核苷酸 胃癌细胞 凋亡 -
p38MAPK反义寡核苷酸对鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
目的:探讨丝裂素活化蛋白激酶p38(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AODN)对血管平滑肌细胞增殖的影响.方法:培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞.通过脂质体转染p38MAPK AODN到血管平滑肌细胞(VMSC).另设p38MAPK正义寡聚脱氧核苷酸(SODN)对照组和空白对照组.用流式细胞仪检测细胞增殖.结果:AODN明显抑制血管紧张素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞增殖(P<0.05~<0.01),其抑制作用呈剂量依赖性.结论:p38MAPK反义寡聚脱氧核苷酸能抑制大鼠的VSMC增殖,提示VSMC增殖与p38信号途径有关.
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端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸诱导入胃癌细胞凋亡过程中端粒酶活性的测定
目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同孵育一定时间后，观察细胞形态变化，观察细胞DNA含量的分布，测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性。在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成。电泳呈凋亡特征性Ladder带；流式细胞仪分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰；端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒形成，从而抑制胃癌细胞的生长。
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AP-1反义寡聚脱氧核苷酸逆转人膀胱癌耐药细胞多药耐药的实验研究
目的观察以激活剂蛋白-1(AP-1)位点为靶序列的特异性反义寡聚脱氧核苷酸(a-sODNs)对人膀胱癌耐药细胞株多药耐药性的逆转作用.方法设计针对谷胱甘肽(GSH)生物合成的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因启动子区域AP-1序列的特异性asODNs,用阳离子脂质体包被后转染人膀胱癌细胞株BIU87及其多药耐药(MDR)亚株BIU87/A,然后分别用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法[以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照]、荧光分光光度法、MTT法等检测AP-1-asODNs对两株细胞γ-GCS mRNA表达、细胞内GSH水平及其对6种抗癌药物肿瘤细胞抑制率的变化.结果 AP-1-asODNs转染72 h后,BIU87和BIU87/A细胞的γ-GCSmRNA的表达和细胞内GSH的水平均出现下降.同时6种抗癌药物对反义转染后的两株细胞的抑制率大部分都有所提高.结论γ-GCS特异的AP-1-asODNs可通过降低细胞内的GSH水平增强膀胱癌细胞对化疗的敏感性,逆转肿瘤细胞的耐药.
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反义药物的作用机理与临床应用
反义药物是以反义核酸技术为基础开发的以治疗为目的的安全有效的新型药物。与传统的药物相比较，反义药物的性质和作用对象明显不同，表现为：新的化学物质-寡聚核苷酸；新的药物受体-mRNA(信息核糖核酸)；新的受体结合方式：Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应，如RNase H(核糖核酸酶H)介导的靶RNA的降解［1］。近年来，随着对反义寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)及其结构衍生物如硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotides,PS-ODN)反义作用机理的阐明，大批以病毒、癌基因、细胞活性因子及其他疾病相关蛋白的基因为靶点的反义药物相继进入临床试验阶段，使反义药物的研究再次进入蓬勃发展时期。本文将在综述文献的基础上，对反义药物的作用机理及临床应用作如下介绍。
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血管内皮生长因子反义寡聚脱氧核苷酸对增生性视网膜病变幼鼠血管内皮生长因子表达的影响
目的观察血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODNs)对增生性视网膜病变幼鼠模型VEGF表达的影响. 方法将30只Sprague-Dawley(SD)新生幼鼠随机分为正常对照组、用药组及未用药组,每组10只.用高浓度氧诱导用药组及未用药组SD幼鼠,建立增生性视网膜病变幼鼠模型.对用药组幼鼠行VEGF ASODNs球后注射,3 d后取各组幼鼠除角膜、巩膜及晶状体外的全部眼内组织及血清,通过竞争性酶免疫测定法检测其VEGF的含量. 结果用药组幼鼠眼内组织VEGF含量明显低于未用药组(P＜0.05),而与对照组相比差异无显著性的意义(P＞0.05);用药组幼鼠血清VEGF含量与未用药组相比差异无显著性的意义(P＞0.05),两者均明显低于对照组(P＜0.05). 结论 VEGF ASODNs能明显抑制由高浓度氧诱导的增生性视网膜病变幼鼠VEGF的表达.
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c-fos基因的反义寡聚脱氧核苷酸鞘内注入减弱福尔马林引起的大鼠伤害性行为反应及脊髓背角Fos蛋白和强啡肽A表达的研究
本研究通过鞘内注射c-fos反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)封闭背角中Fos蛋白的表达,观察了Fos蛋白合成和慢痛反应的关系,并分析Fos蛋白合成和强啡肽A(DynA)表达之间的关系.实验组动物(n=5)鞘内预先注射f-fos的AS-ODN(50 μg,5 μl),另两个对照组(每组n=5)分别注射等量生理盐水和AS-ODN的反序核苷酸(reverse oligodeoxynucleotides,RS-ODN,50μg,5 μl);4 h后,各组动物均在一侧后肢脚掌皮下注射formalin(5%,50 μl),并立即用计算动物舔拭注射侧后脚掌累计时间的方法,检测大鼠的伤害性行为反应,行为检测后1 h处死动物,用免疫组化方法检查脊髓背角中Fos蛋白阳性神经元的数量和强啡肽A(1～8)的表达量.结果发现,和两个对照组相比,实验组动物Formalin诱发的伤害性行为反应的第二相明显减弱,同时Formalin注射侧背角Fos蛋白样免疫阳性细胞的数量和DynA含量的灰度值明显减少.本研究结果提示,外周伤害性刺激引起的长期持续的痛反应是以c-fos基因表达增加及受其调控的DynA表达上调为基础的,由此推测在脊髓背角神经元中Fos蛋白和DynA表达的增强可能是出现慢性痛行为反应和痛过敏状态的基础.
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端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对HL-60细胞生长的作用
目的: 观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对急性髓细胞白血病细胞株HL-60的作用. 方法: 采用台盼蓝排斥法进行药物敏感试验,流式细胞仪测定凋亡细胞含量. 结果: 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对HL-60细胞有生长抑制作用,作用具有序列特异性及剂量依赖性. 流式细胞仪检测到凋亡峰,含量为28.8%. 无关寡聚核苷酸片段无此作用. 结论: 端粒酶对维持白血病细胞的生长可能起十分重要的作用,它有可能成为白血病治疗的新靶点.
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α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸对瘢痕成纤维细胞的作用
1 对象与方法1.1 主要试剂及仪器α1(Ⅰ)型前胶原基因反义寡聚脱氧核苷酸(AODN,上海生工生物工程有限公司);阳离子脂质体LipofectAMINETM试剂(美国Gibco公司);即用型免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);倒置相差显微镜(上海宙山精密光学仪器有限公司);IBA 2.5型全自动图像分析系统(德国Kontron公司).
