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短发夹RNA抑制外源荧光素酶在肝癌细胞中的表达
目的:构建含荧光素酶(1uciferase,luc)基因的短发夹状RNA(shorr hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其在肝癌细胞Bel-7402中抑制外源荧光素酶的表达.方法:设计的两条反向重复的多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-luc重组质粒,与荧光素酶基因表达质粒pCMV-luc共转染肝癌细胞株BEL-7402,检测其对荧光素酶表达的影响.结果:PCR和DNA序列分析证实了重组质粒构建成功.pshRNA-luc对共转染的pCMV-luc中的荧光素酶具有明显的抑制作用,抑制率可达86%(P＜0.01).结论:构建的pshRNA-luc表达质粒能有效地抑制荧光素酶在肝癌细胞中的表达,为RNA干扰用于肿瘤的基因治疗打下基础.
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利用细菌内重组腺病毒系统构建胃癌MG7-Ag模拟表位疫苗
目的:以复制缺陷的腺病毒为疫苗载体,构建基于胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒疫苗.方法:将编码MG7-Ag模拟表位的互补序列设计到上游引物的5/端.以含有HBcAg全序列的质粒p1.2Ⅱ为模板,通过PCR扩增,获得MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因.经序列测定证实后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5 183中进行同源重组.经抗性筛选及酶切鉴定的重组质粒,再用导入293细胞进行包装,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:序列测定证实,PCR产物为胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片段;酶切鉴定表明胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片断插入了pAdTrack-CMV穿梭质粒,卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3 d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论:胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒载体的构建成功,为进一步研究胃癌MG7-Ag模拟表位诱发抗胃癌免疫打下了基础.
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定
目的 对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT51的基因进行克隆,表达,纯化与鉴定,为核酸疫苗的研制与应用打下基础.方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对编码MPT51蛋白的抗原基因进行扩增,产物克隆到表达载体pET22b中,构建了含mpt51的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coli XLI-Blue内提取质粒,酶切及测序鉴定,再转化入E.coli BL21(DE3)PLysS菌株内,以IPTG进行诱导后,破菌,离心,包涵体经尿素变性溶解后用His·Bind亲和层析柱纯化,透析复性,纯化后蛋白进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行特异性免疫检测.结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为27 800,抗体检测有特异条带,大小为27.8kDa.结论 目的基因克隆到了表达载体内并证明表达,重组结核杆菌分泌蛋白MPT51的成功表达为核酸疫苗的研制与应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础.
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pcDNA4-PDGF-B重组质粒的构建并转染体外培养兔骨髓间充质干细胞
目的:探讨自行构建pcDNA4-PDGF-B重组质粒并转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法及可行性,并观察转染阳性细胞形态及生物特性.方法:构建包含人类血小板源性生长因子B(PDGF-B)重组质粒,将目的基因转染到兔BMSCs中,并通过形态观察、双酶切、聚合酶链反应、免疫组化来检测该目的基因在兔BMSCs中表达,通过G418抗生素筛选、MTT法绘制细胞生长曲线探讨PDGF-B基因对靶细胞生长影响.结果:pcDNA4-PDGF-B重组质粒的构建合成及人PDFG-B基因成功转染BMSCs,并持续稳定地表述PDGF B.结论:PDGF-B基因可以对骨髓间充干细胞进行转染,PDGF-B对靶细胞增殖、分裂有明显促进作用,为后期研究植入人PDGF-B转染BMSCs以缓解急性肝功能衰竭奠定了基础.
关键词： 骨髓间充质干细胞 血小板源性生长因子-B 重组质粒构建 转染
