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褪黑素减轻心肌缺血再灌注损伤的新机制
目的 研究褪黑素抗心肌缺血再灌注损伤的新分子机制.方法 H9c2细胞在接受模拟缺血再灌注损伤前,用不同浓度褪黑素(Mel)(10 μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L)预处理12 h.分别用CCK-8法检测各实验组细胞活力,酶活性测定法检测细胞中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性,DHE荧光探针检测细胞中活性氧(ROS)的含量,Fluo-4AM荧光探针检测细胞内钙离子浓度,Western blot法检测衰老标记蛋白30(SMP30)及凋亡与氧化应激相关蛋白的表达水平,免疫荧光染色检测细胞SMP30表达量.转染siRNA抑制SMP30的表达,进一步探究SMP30分子是否介导Mel的保护作用.结果Mel预处理可显著提高再灌注损伤后细胞活力,降低细胞凋亡相关蛋白的表达;降低细胞中MDA含量,增强SOD活性及抗氧化应激相关蛋白表达量,减少ROS的产生;并可显著上调SMP30的表达,降低细胞内钙离子浓度,而使用SMP30 siRNA明显逆转Mel的上述保护作用(均P＜0.05).结论 Mel通过激活SMP30分子,增强细胞抗氧化应激能力,减轻细胞钙超载,进而减少细胞凋亡和坏死,终改善心肌细胞缺血再灌注损伤.
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H2O2对人皮肤成纤维细胞衰老标记蛋白30及自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达的影响
目的 探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞(NHSF)衰老标记蛋白30(SMP30)以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ型(LC3 Ⅱ)的影响.方法 用150 μmol/L H2O2处理2～4代NHSF2h,构建细胞衰老模型作为H2O2组,而未处理的NHSF作为对照组.细胞衰老β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测衰老细胞比例,间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3的表达,反转录PCR(RT-PCR)检测SMP30 mRNA的表达,Western印迹法检测SMP30和LC3蛋白的表达.结果 H2O2组NHSF的SA-β-gal染色阳性率(41.70％±2.95％)显著高于对照组(3.03％±0.25％,t=22.59,P＜0.05).间接免疫荧光结果显示,H2O2组NHSF LC3阳性率(12.60％±1.57％)明显低于对照组(23.67％±3.04％,t=5.61,P＜0.05).Western印迹显示,H2O2组LC3 Ⅰ/GAPDH比值(0.40±0.02)与对照组(0.41±0.04)比较差异无统计学意义(P＞0.05),而H2O2组LC3 Ⅱ/GAPDH比值(0.20±0.02)明显低于对照组(0.80±0.03,t=29.69,P＜0.05),且H2O2组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值(0.51±0.03)亦明显低于对照组(1.98±0.23,t=10.967,P＜0.05).H2O2组SMP30mRNA和蛋白水平(与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.16±0.01和0.27±0.02)明显低于对照组(分别为0.35±0.01和0.63±0.02),均P＜0.05.结论 H2O2可降低NHSF中SMP30及LC3 Ⅱ的表达水平,加速NHSF衰老.
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UVB诱导人皮肤成纤维细胞的SMP30基因表达变化
目的 研究经过不同剂量紫外线中波(UVB)照射不同时间后正常人皮肤成纤维细胞(HSF)中衰老标记蛋白30 (SMP30)基因的表达改变,探讨UVB诱导HSF衰老可能的机制. 方法 以未采用UVB照射的HSF为对照组,经过不同剂量UVB(100、200、300 mJ/cm2)处理不同时间(1、2、3 d后)的HSF为实验组,四唑盐比色法(MTT)观察HSF的生长活性,流式细胞仪检测HSF的凋亡率,实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)检测实验组和对照组中SMP30基因的表达. 结果 不同照射时间组和不同剂量组之间,随着UVB照射时间延长和剂量的增加,HSF细胞增殖抑制率逐渐增高,细胞的凋亡率也逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05); UVB处理后实验组中SMP30基因的相对表达水平(0.66± 0.19)明显低于对照组(1.15± 0.11),差异有统计学意义(P<0.01);SMP30基因的表达水平随着UVB作用的时间和剂量的不同而变化,呈明显的时间依赖性和浓度剂量依赖性,不同照射时间组和不同剂量组之间基因表达的差异有统计学意义(P<0.05). 结论 经过不同剂量UVB处理不同时间后可以抑制HSF细胞生长,促进细胞凋亡,大剂量长时间UVB照射可诱导HSF发生衰老改变.
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H2O2诱导对正常人皮肤成纤维细胞β-catenin、SMP30基因表达的影响
目的 观察过氧化氢(H2O2)对正常人皮肤成纤维细胞(NHSF)β-链蛋白(β-catenin)和衰老标记蛋白30(SMP30)基因表达的影响,探讨H2O2可能诱导NHSF衰老的机制.方法 将传至2～4代的NHSF细胞随机分为2组:对照组和实验组.对照组NHSF细胞未作任何处理.实验组将NHSF细胞培养24 h后,分别给予50(实验1组)、100(实验2组)、150(实验3组)μmol·L-1的H2O2.在1、2、3h后,采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测各组α-catenin、SMP30基因表达的水平,并计算α-catenin mRNA、SMP30 mRNA值.结果 与对照组比较,实验组β-catenin、SMP30基因表达水平和实验1、2、3组1、2、3h时α-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显降低(均P＜0.05);与实验2组比较,实验1组1、2、3h时α-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显升高,实验3组1、2、3h时 β-catenin mRNA、SMP30 mRNA水平均明显降低(均P＜0.05).β-catenin、SMP30基因的表达对H2O2诱导有较为明显的时间依赖性和浓度剂量依赖性.结论 H2O2处理后NHSF细胞中β-catenin、SMP30基因表达水平明显降低,H2O2可能在诱导NHSF衰老中起重要作用.
关键词： 正常人皮肤成纤维细胞 过氧化氢 β-链蛋白 衰老标记蛋白30 荧光定量PCR -
人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒对人外周血树突状细胞成熟的影响
目的 探讨人肝癌相关抗原衰老标记蛋白30(SMP30)对人外周血树突状细胞(DC)成熟的影响.方法用Ficoll密度梯度离心法从健康成人外周血中分离获得外周血单个核细胞,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导生成DC,用流式细胞术对DC进行鉴定.将DC随机分为SMP30慢病毒组、空载慢病毒组,分别用人肝癌相关抗原SMP30重组慢病毒和空载慢病毒进行体外转染,另设空白对照组.荧光显微镜下观察各组绿色荧光蛋白表达情况,以判断DC的转染效率;Western blotting法检测各组SMP30蛋白表达;ELISA法检测各组白细胞介素12(IL-12)、干扰素γ(INF-γ)分泌情况;流式细胞术检测各组表面共刺激分子CD80和CD86表达.结果 荧光显微镜下观察到SMP30慢病毒组和空载慢病毒组成功表达绿色荧光蛋白,而空白对照组DC无绿色荧光蛋白表达.与空载慢病毒组、空白对照组比较,SMP30慢病毒组SMP30表达高,IL-12、INF-γ分泌量高,CD80、CD86表达率高(P均＜0.05).结论 体外转染人肝癌相关抗原SMP30慢病毒可促进人外周血DC的成熟.
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CpG位点选择对焦磷酸测序法检测肝癌SMP30启动子甲基化的影响
目的 选择适宜的CpG位点用于焦磷酸测序法检测肝癌衰老标记蛋白30 (SMP30)启动子甲基化.方法 提取人肝癌细胞系SMCC-7721和BEL-7404的基因组DNA,设计针对SMP30基因序列1和序列2的扩增和测序引物,焦磷酸测序法检测SMP30基因序列1和序列2中的CpG位点甲基化程度,并用Sanger测序法验证序列2中出现的SNP位点.结果 SMCC-7721和BEL-7404细胞系中,SMP30基因序列1中6个CpG位点低甲基化,与SMP30基因低表达不符,且测序结果质量评估均为失败.SMP30基因序列2中6个CpG位点高甲基化,与SMP30基因低表达相符,前2个CpG位点均为通过,而后4个CpG位点均为失败.去除第5和第6个CpG位点,只检测SMt30基因序列2中poly(T)结构前4个CpG位点,SMCC-7721细胞系中甲基化程度分别为100％、90％、100％和80％;BEL-7404细胞系中甲基化程度分别为100％、92％、100％和77％.除第3个CpG位点为失败,其余C心位点均为通过.Sanger测序显示SMCC-7721和BEL-7404细胞系在第3个CpG位点前存在SNP位点,且均为A.结论 焦磷酸测序时选择靠近基因转录起始点上游且在poly (T)结构之前的CpG位点,测得的SMP30启动子甲基化值较准确.
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急性氧化应激初期人晶状体上皮细胞株SRA01/04中衰老标记蛋白30抗氧化作用的研究
目的 初步探讨衰老标记蛋白30 (senescence marker protein 30,SMP30)的增加对处于急性氧化应激初期的人晶状体上皮细胞株SRA01/04的保护作用.方法 将处于对数生长期的SRA01/04接种于96孔板,分别使用含150μmol·L-1、200 μmol·L-1、250 μmol·L-1、300 μmol·L-1、350 μmol·L-、400 μmol·L-1、450μmol·L-1H2O2的培养基作用2h,CCK-8法选取佳H2O2浓度;使用慢病毒对SRA01/04进行转染建立SMP30高表达模型,实验分3组:SMP30过表达(over expression,OE)组、SMP30过表达相应空载(negative control over expression,NCOE)组及对照(control,CON)组.通过超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)定量检测试剂盒、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)/总谷胱甘肽(total glutathione,T-GSH)测定试剂盒测量细胞内SOD活力及GSSG/T-GSH比值的变化.结果 经分析,建立模型的佳H2O2浓度为300 μmol·L-1.在此浓度下,与CON组(5.783±0.192)U·mg-1及NCOE组(5.837±0.182)U·mg-1相比,OE组细胞内SOD活力升高,为(10.251±0.110)U·mg-;与CON组(29.943±0.241)及NCOE组(30.037±0.433)相比,OE组细胞内GSSG/T-GSH比值(20.990±0.342)降低;差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 当SRA01/04处于H2O2诱导的急性氧化应激初期时,SMP30表达的增加可通过增加SOD活力和降低GSSG/T-GSH比值,加强SRA01/04的抗氧化能力.
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过氧化氢诱导的急性氧化应激对人晶状体上皮细胞形态、生存率及衰老标记蛋白30(SMP30)表达的影响
目的 探讨过氧化氢诱导的急性氧化应激对人晶状体上皮细胞形态、生存率及衰老标记蛋白30(senescence marker protein30,SMP30)表达的影响.方法 采用不同浓度过氧化氢(0μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1)处理人晶状体上皮细胞24 h,建立不同浓度急性氧化应激模型,通过光镜观察、MTT分析细胞形态、生存率,Western blot检测SMP30蛋白的表达情况.结果 不同浓度过氧化氢处理细胞24 h后,100 μmol·L-1处理组和200 μmol·L-1处理组细胞密度、生长活力下降,细胞形态改变,开始出现变圆变大的细胞,胞体拉长,边界不清;300 μmol·L-1处理组细胞密度明显降低,细胞出现破碎,溃解.随着过氧化氢浓度的增高,细胞生存率逐渐下降,各处理组与对照组(Oμmol·L-)间相比,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).在对照组及100 μmol·L-1处理组、200 μmol·L-1处理组晶状体上皮细胞SMP30蛋白相对表达量分别为0.273±0.055、0.464±0.058、0.442±0.050,100 μmol·L-1处理组、200 μmol·L-处理组SMP30蛋白的表达均较对照组提高,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05),100 μmol·L-1处理组和200 μmol·L-1处理组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在急性氧化应激状态下人晶状体上皮细胞形态改变,生存率下降,SMP30蛋白表达上调,SMP30蛋白可能参与晶状体上皮细胞急性氧化应激损伤过程.
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衰老标记蛋白30在不同年龄白内障患者晶状体上皮细胞中的表达变化
背景 衰老标记蛋白30(SM P30)是一种新型的钙调节蛋白,具有抗氧化、稳定钙离子、抗凋亡等保护作用,研究证实随着年龄的增长,SMP30在机体组织中的表达逐渐减少,但其与不同年龄白内障发生关系的研究少有报道. 目的 对SMP30在不同年龄组白内障患者晶状体上皮细胞(LECs)中的表达情况进行定性、定位和定量研究,探讨其与白内障发生的关系.方法 本研究经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准,采用非随机对照临床研究设计.收集2011年9月至2012年12月在广西医科大学第一附属医院眼科行白内障手术的患者,根据患者的年龄不同分为儿童白内障组(1 ～18岁)、青年白内障组(19～ 45岁)、中年白内障组(46 ～ 60岁)和老年白内障组(＞60岁),均于白内障摘出术中获取晶状体前囊膜,每组各12例,并收集同期获取的19～45岁正常角膜供体的晶状体前囊膜12例作为正常对照组.采用间接免疫荧光法检测各组晶状体囊膜LECs中SMP30的表达,按单位面积吸光度(A)值计算平均荧光强度值. 结果 SMP30在各组患者晶状体囊膜LECs中均呈阳性表达,FITC染色呈绿色荧光,主要表达于细胞质,细胞核内有少量表达.儿童白内障组、青年白内障组、中年白内障组和老年白内障组患者LECs中SMP30表达的荧光强度分别为0.185±0.020、0.181±0.034、0.207±0.018和0.126±0.027,均明显高于正常对照组的0.087±0.007,差异均有统计学意义(q=3.96、3.82、4.01、3.55,P＜0.01),儿童白内障组、青年白内障组、中年白内障组间LECs中SMP30的表达量差异无统计学意义(P＞0.05),老年白内障组患者LECs中SMP30表达的荧光强度明显低于儿童白内障组、青年白内障组和中年白内障组,差异均有统计学意义(q=3.42、3.21、3.80,P＜0.05).结论 SMP30在白内障患者中表达增高,可能是人LECs的保护性因子,老年患者LECs中其表达量的降低可能是年龄相关性白内障发生的原因之一.
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不同类型年龄相关性白内障晶状体上皮细胞衰老标记蛋白30的表达及与细胞凋亡的关系
背景 随着人口的老龄化,白内障的发病率逐年上升,研究表明,衰老标记蛋白30( SMP-30)与白内障的发生发展关系密切. 目的 了解不同类型白内障晶状体上皮细胞( LECs)中SMP-30的表达及LECs的凋亡情况,探讨不同类型年龄相关性白内障的发病机制. 方法 收集2010年3-10月在武汉大学中南医院眼科行白内障超声乳化摘出术的年龄相关性皮质性白内障59例80眼和核性白内障53例70眼,2个组患者年龄匹配(P＞0.05).白内障手术中环形撕取晶状体前囊膜,应用免疫组织化学法和实时荧光定量聚合酶链反应( real-time PCR)技术分别定性、定量检测SMP-30蛋白及其mRNA在2个组白内障LECs中的表达.用TUNEL标记法观察LECs的凋亡情况,对比分析两种类型白内障晶状体前囊膜中SMP-30的表达及细胞凋亡的差异.结果 免疫组织化学法检测表明,SMP-30主要表达于晶状体囊膜的细胞质中,在晶状体囊膜中央部表达较弱,越近周边表达越强,差异均有统计学意义(核性:45.21±2.79 vs 76.42±11.21,P=0.042；皮质性:108.32±4.32 vs 206.34±15.67,P=0.037).核性白内障LECs中SMP-30 mRNA的表达少于皮质性,差异有统计学意义(60.02±9.08 vs 157.33±13.01,P=0.034).TUNEL染色显示,2个组白内障LECs凋亡百分率中央部明显高于周边部,差异均有统计学意义(核性:19.34％±0.11％vs 8.32％±0.57％,P=0.025;皮质性:42.07％±0.86％vs 13.55％±0.64％,P=0.010),细胞凋亡百分率低于皮质性,差异有统计学意义(14.05％±0.22％vs 27.70％±0.81％,P=0.007). 结论 两种类型年龄相关性白内障的发生均与LECs凋亡有关,SMP-30的表达与其密切相关.
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衰老标记蛋白30对过氧化氢所致人皮肤成纤维细胞衰老表型的影响
目的 观察高表达的衰老标记蛋白30(SMP30)对过氧化氢(H2O2)所致的正常人皮肤成纤维细胞(NHSF)衰老表型的影响.方法 实验分为转染H2O2处理组(NHSF+ SMP30+ H2O2组)、转空载体H2O2处理组(NHSF+空载体+H2O2组)和转空载体组(NHSF+空载体组).NHSF细胞分别转染入SMP30 cDNA或空载体pcD-NA3.1(分别命名为NHSF+ SMP30、NHSF+空载体),然后150 μmol·L-1H2O2处理2h.应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法分析SMP30的表达,显微镜观察细胞形态,并检测与衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)、细胞活性氧(ROS)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性.结果 人SMP30 cDNA明显上调了NHSF中SMP30的表达.NHSF+空载体+H2O2组SMP30 mRNA和蛋白表达水平明显低于NHSF+空载体组(P＜0.05);NHSF+SMP30+ H2O2组SMP30 mRNA和蛋白表达水平高于NHSF+空载体+H2O2组(P＜0.05).NHSF+空载体+H2O2组较NHSF+空载体组SA-β-gal染色率明显增高(P＜0.05);NHSF+ SMP30+ H2O2组较NHSF+空载体+H2O2组SA-β-gal染色率明显下降(P＜0.05).NHSF+空载体+H2O2组较NHSF+空载体组ROS活性明显增高(P＜0.05),而SOD水平明显降低(P＜0.05);NHSF+ SMP30+ H2O2组较NHSF+空载体+H2O2组ROS活性明显下降,而SOD水平明显上升(P＜0.05).结论 高表达的SMP30能够抑制细胞SA-β-gal和ROS的表达,同时上调SOD的活性.
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高表达衰老标记蛋白30对高钙诱导人晶状体上皮细胞株SRA01/04氧化应激的影响
[目的]探讨在高钙诱导细胞氧化应激下,高表达衰老标记蛋白30(SMP30)对人晶状体上皮细胞(HLEC)株SRA01/04增殖活力及抗氧化能力的影响.[方法]实验分3组:SMP30高表达组(OE,实验组)、NCOE组(阴性对照组)及SRA01/04组(空白对照组).用OE及NCOE慢病毒载体分别转染SRA01/04细胞.15mmol/LCaCl2处理细胞24 h建立高钙诱导模型.BrdU法检测细胞增殖、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)/总谷胱甘肽(T-GSH)法检测细胞氧化指标.[结果]荧光显微镜下可见各组转染细胞有大量绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染效率接近80％,提示SMP30高表达SRA01/04细胞模型构建成功.在高钙状态下,OE组细胞相对增殖活力(3.89±0.20)和SOD活力(U/mg,47.5±4.3)均高于NCOE组(2.82±0.34、30.6±4.2)及SRA01/04组(2.96±0.25、26.8±1.5),OE组GSSG/T-GSH比值(2.36±0.51)低于NCOE组(16.36±2.48)及SRA01/04组(20.12±2.54),上述差异均有统计学意义(n=3,P＜0.05),NCOE组与SRA01/04组相比差异均无统计学意义(n=3,P＞0.05).[结论]高表达SMP30增加SRA01/04 (HLEC)细胞增殖活力、SOD活力及下降GSSG/T-GSH水平,提示SMP30在一定程度上可缓解高钙诱导细胞氧化损伤的进程,可能对HLEC有保护作用.
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衰老标记蛋白30在慢性阻塞性肺疾病患者中的表达及意义
目的 初步探索衰老标记蛋白30 (SMP-30)在人肺组织中的表达以及在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)发病中的意义.方法 纳入2012年1月至6月在江苏省人民医院因肺部肿瘤行肺叶切除术的患者20例.肺组织标本从江苏省人民医院组织库申请获得,为距离癌组织＞5 cm的相对正常组织.根据患者肺功能及吸烟情况,将患者分为健康对照组7例,吸烟对照组7例,以及慢阻肺组6例.采用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法检测SMP-30在各组肺组织中的细胞定位及含量.结果 SMP-30在人肺组织中主要分布于肺泡巨噬细胞胞浆,慢阻肺组肺泡巨噬细胞及SMP-30阳性细胞数量均明显增多.蛋白免疫印迹法显示肺组织SMP-30蛋白在吸烟非慢阻肺组的含量明显高于健康对照组(2.16±0.23比1.10 ±0.14,P＜0.01).相较于吸烟非慢阻肺组,慢阻肺组SMP-30蛋白表达进一步增加(4.62±0.97比2.16±0.23,P＜0.05).结论 SMP-30的表达增加可能与肺泡巨噬细胞寿命延长、数量增多有关,有可能是慢阻肺发生发展的一个病理环节.
