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运动对c-Jun氨基末端激酶影响研究进展
c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)家族是1990年被发现的丝裂原活化蛋白激酶(mito-gen-activated protein kinase,MAPK)超家族成员之一,涉及多种生理过程.在细胞分化、细胞凋亡、应激反应中起着至关重要的作用.JNK也参与了许多病理过程,可能介导了病理性心脏肥大反应、高血糖引起的血管内皮细胞凋亡、胰岛素抵抗、胰岛β细胞凋亡、神经萎缩和多种人类肿瘤的发生发展.JNK信号通路已成为近年来研究的热点.
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过表达p53对机械负荷导致的心肌细胞肥大反应的影响
目的:观察心肌细胞内过表达p53对机械牵张引起的心肌细胞肥大反应的影响.方法:使用大鼠乳鼠来源的心肌细胞,对贴壁培养在硅胶培养皿内的心肌细胞进行0 min、5 min、10 min、30 min、1 h和2 h的机械牵张.以Western blot法检测心肌细胞肥大反应相关蛋白激酶细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在不同时间牵张后磷酸化水平变化的时间特点;将含p53基因的重组腺病毒载体(p53-Adv)转染心肌细胞使之高表达p53蛋白.再行同样的不同时间的机械牵张,观察磷酸化ERK1/2表达的时间变化特点;后将两部分结果对比以明确p53过表达对机械牵张后ERK1/2磷酸化变化的影响.结果:未行p53-Adv转染时5 min牵张组磷酸化ERK1/2表达比0 min牵张组明显升高(P<0.05).并且随着牵张时间的延长ERK1/2磷酸化水平逐步增高;而p53-Adv转染后,5 min牵张组磷酸化ERK1/2表达较0 min牵张组仍增加(P<0.05),但更长时间牵张组较0 min牵张组ERK1/2磷酸化水平不升反降(P<0.05),以2 h组低(P<0.05).结论:心肌细胞内过表达p53后,虽然不影响短期牵张(5 min)的ERK1/2磷酸化水平的升高,但明显抑制更长时间牵张后的磷酸化ERK一表达,提示心肌细胞内的p53对机械负荷后晚期的心肌肥厚反应有抑制作用,p53可能与心肌肥厚由代偿期向失代偿期的转化有关.
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一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制
本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮(NO)信号 系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制.实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽(ANP)的表达作为心肌肥大反应的指标, 以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平, 以免疫印迹法测定MKP-1蛋白表达, 以RT-PCR测定eNOS mRNA水平.结果发现: (1) L -精氨酸 (L-Arg) 10、 100 μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16%及31%, L-A rg (100 μmol/L)还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 其作用可被NOS抑制剂L-NAME 所抑制; (2) L-Arg (100 μmol/L)可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞A NP mRNA表达水平和蛋白合成速率, 而在L-Arg处理之前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 蛋白合成速率明显增加, 可取消L-Arg的抑制作用, 甚至超过AngⅡ组; (3) L-Arg (100 μmol/L)明显增加MKP-1蛋白表达, 比对照组增加225%, NOS抑制 剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达, 分别抑制88%、 83%, 而AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达, 较对照组增加365%, 增强了L-Arg的作用.以上结果表明, NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG, 促进MKP-1的表达, 从而增加MAPK去磷酸化实现的.
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MKP-1在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的调控作用
本研究主要从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)角度, 研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在血管紧张素Ⅱ介导的新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用及调控机制.实验以心肌细胞蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应的指标, 以凝胶内MBP原位磷酸化测定MAPK活性, 以免疫印迹法(Western boltting)分别测定MKP-1及磷酸化p44MAPK、p42MAPK蛋白表达.结果发现: (1)AngⅡ(10-7 mol/L)处理48 h, 心肌细胞～3H-亮氨酸掺入率、蛋白含量及细胞表面积明显增加, AngⅡ增加～3H-亮氨酸掺入的作用可被血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)拮抗剂CV11974(10-6 mol/L)明显抑制(抑制85%), 被MAPK激酶(MEK)特异性抑制剂PD098059(5×10-5 mol/L)部分抑制(抑制32.5%);(2) CV11974或PD098059可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达及MAPK酶活性(以γ-32P-ATP掺入表示);(3)以磷酸化MAPK蛋白表达反映MAPK活性, 可见AngⅡ处理心肌细胞 5 min, MAPK活性即开始增加, 30 min左右达到高峰, 2 h后基本恢复正常;而MKP-1蛋白表达30 min即见增加, 持续2 h以上;(4) 用放线菌素D (actinomycin D)处理心肌细胞30 min可明显抑制MKP-1的表达, 同时使AngⅡ致磷酸化MAPK蛋白表达时间延长至2 h以上.以上结果表明, MAPK激活在AngⅡ导致的心肌肥大反应中具有重要作用, MKP-1通过使活化的MAPK去磷酸化而使MAPK失活, 从而参与对心肌肥大反应的调节.
关键词： 丝裂原活化蛋白激酶 丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 心肌细胞 肥大反应 血管紧张素Ⅱ -
G蛋白、蛋白激酶C和Na+-H+交换在内皮素-1诱导培养心肌细胞肥大反应中的作用
内皮素-1(ET-1)是一种强的生长因子,并诱导心肌细胞肥大反应.在本实验中,我们探讨了G蛋白、蛋白激酶C(PKC)和Na+-H+交换在ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用.ET-1(10-10～10-7 mol/L)促进3H-亮氨酸掺入,增加细胞蛋白质的含量和心肌细胞的表面积,且呈剂量依赖性,它们的EC50分别为5.2×10-10,5.2×10-10和7.3×10-10mol/L.用蛋白激酶C(PKC)抑制剂,Staurosporin(2 nmol/L)预处理心肌细胞,可完全阻断ET-1诱导的心肌细胞的这些肥大反应,而蛋白激酶C激动剂,佛波醇酯(PMA)(10-8～10-6mol/L)呈剂量依赖性促进心肌细胞的肥大反应.用Na+-H+交换抑制剂,氨氯吡咪(10-4mol/L)预处理心肌细胞,可抑制ET-1诱导的心肌细胞肥大反应,但不影响PMA诱导的心肌细胞肥大反应.百日咳毒素(150ng/ml)预处理心肌细胞,可明显抑制ET-1诱导的心肌细胞肥大反应.这些结果提示,ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应是与百日咳毒素敏感的G蛋白相耦联,蛋白激酶C和Na+-H+交换可能在ET-1诱导的心肌细胞肥大反应中是重要的细胞内信使转导途径.
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雌、孕激素对ET-1诱导的心肌细胞肥大反应的影响
目的 观察不同浓度的17β-雌二醇(E2)和孕酮(P)单独及联合运用对内皮素-1 (ET-1)诱导的心肌细胞肥大反应的影响.方法 以ET-1刺激体外培养的新生大鼠心肌细胞,建立心肌肥大细胞模型,以心肌细胞[3H]-亮氨酸(3H-leu)掺入作为心肌肥大反应的指标.结果 E2可明显抑制ET-1诱导的心肌细胞3H-leu掺入的增加,而P对此无显著作用;E2/P联合运用时,P对E2降低ET-1诱导的心肌细胞3H-leu掺入增加的作用具有一定程度的抑制作用.结论 E2可抑制ET-1诱导的心肌细胞肥大反应,E2/P联合使用时,P可一定程度的抑制E2对心肌的保护效应,应用时应以低浓度为宜.
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一氧化氮在防止内皮素-1诱导心肌细胞肥大中的作用
目的在培养的新生大鼠心肌细胞上,探讨一氧化氮(NO)在防止内皮素-1诱导的心肌细胞肥大反应中的作用.方法用Bradford法测定心肌细胞总蛋白含量,用血红蛋白分光分度法测定心肌细胞NOS活性,用硝酸还原酶-Griess试剂显色法测定培养液中NO浓度,用RT-PCR技术检测心肌细胞原癌基因c-fos的表达(以GAPDH为内标).
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间质细胞在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用
大量研究表明心脏是一个重要的内分泌器官。心肌间质细胞(主要是成纤维细胞、微血管内皮细胞)约占心肌组织细胞总数的40%，但是，单独针对心肌组织中各种间质细胞功能的离体研究较少。尤其是对于成纤维细胞、微血管内皮细胞在受到超负荷力学机械刺激后的内分泌功能有何变化及其在超负荷心肌肥大机制中的作用均不清楚。 我们应用体外细胞牵张刺激模型，采用条件培养基刺激法观察成纤维细胞、微血管内皮细胞在受到牵张刺激后的内分泌活化情况及在心肌细胞肥大中的作用。结果发现，对培养在硅酮膜上的成纤维细胞和微血管内皮细胞进行20%牵张刺激，24h即可见到两种细胞培养上清中血管紧张素Ⅱ和内皮素含量显著升高，牵张时间延长，二者的浓度进一步显著增加。因此，上述结果不仅说明牵张刺激可诱导成纤维细胞、微血管内皮细胞的内分泌活化，还提示牵张刺激对内分泌的活化作用具有时间依赖性。另外，我们发现牵张刺激成纤维细胞、微血管内皮细胞的条件培养基均可显著刺激心肌细胞3H-Leu掺入、c-fos蛋白及β-MHC mRNA的表达，提示牵张刺激可通过诱导心肌间质细胞内分泌活化启动心肌细胞肥大反应。血管紧张素Ⅱ、内皮素受体拮抗剂可明显抑制心肌细胞3H-Leu掺入率、c-fos蛋白及β-MHC mRNA的表达。但是，当联合应用上述两种受体拮抗剂时，3H-Leu掺入率、c-fos蛋白及β-MHC mRNA表达的抑制率可达80%以上，但并不能完全抑制，说明牵张刺激可诱导成纤维细胞和内皮细胞分泌包括血管紧张素Ⅱ和内皮素等在内的多种细胞因子、生长因子参与刺激心肌肥大反应，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子等。因此，研究表明预防或逆转超负荷心肌肥大的佳措施可能仍然是减轻心肌组织受到的过度应力刺激。
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一氧化氮可抑制牵张刺激心肌细胞肥大反应
虽然有大量实验早已证实单纯压力超负荷即可诱导心肌肥大，但是至今尚不清楚这一力学作用的信号转导机制。有报道指出，细胞形变可直接刺激细胞内腺苷酸环化酶活性及cAMP含量升高。本室研究也提示，急性压力超负荷可诱导心肌组织cAMP含量迅速升高、cGMP含量迅速降低，说明环核苷酸系统与压力超负荷心肌肥大的信号转导机制有关。我们采用体外模拟牵张刺激模型，进一步观察了一氧化氮供体硝普钠对牵张刺激心肌细胞肥大反应的影响。 结果表明，应用本室建立的牵张刺激模型进行20%牵张刺激即可显著诱导培养心肌细胞蛋白质合成，同时，牵张刺激使心肌细胞β肌球蛋白mRNA表达也显著升高，而DNA合成未见增加。另外发现，大于3×10－4M／L的硝普钠(NO供体)即可显著抑制牵张刺激诱导的心肌细胞蛋白质合成及β－MHC mRNA表达，在不断保持硝普钠浓度的情况下，则具有持续的抑制作用。在急性压力超负荷大鼠心肌cGMP浓度有一个从正常水平到降低，再到恢复正常的过程，这一变化特点恰与cAMP的变化曲线相反。
