HSD1蛋白在精子发生过程中的空间特异性表达

目的 研究HSD1蛋白在各级生精细胞中的空间特异性表达及其在细胞中的核质穿梭特性.方法 分离小鼠生精细胞,用免疫荧光法观察HSD1蛋白的内源定位.构建pEGFP-C1-HSD1融合表达质粒并转染CHO细胞,用激光共聚焦和电镜观察HSD1融合蛋白的定位及其核质分布情况.结果 HSD1蛋白在初级精母细胞和圆形精子细胞的胞质中表达；在成熟精子细胞中主要表达于顶体和尾部.HSD1蛋白在CHO细胞中存在3种分布形式:细胞核型、细胞质型和核质分布型.进一步研究发现该蛋白在细胞中呈动态分布,存在细胞核-质间的穿梭特性.结论 HSD1蛋白在生精细胞中呈空间特异性表达并且具有核质穿梭能力.

利用CRISPR/CAS9技术构建QKI敲除GC1-spg细胞株及其生物学功能检测

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建QKI敲除的GC1-spg细胞株,并在体外研究QKI对GC1-spg细胞增殖和分化的影响.方法 利用CRISPR/Cas9系统的PX330质粒构建敲除QKI的重组质粒,转染GC1-spg野生型细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和基因测序鉴定出GC1-spg敲除QKI细胞株;常规培养野生型和敲除细胞株,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)绘制增殖曲线和荧光定量PCR(q-PCR)检测减数分裂相关基因变化.结果 本研究成功构建出QKI敲除GC1-spg细胞株,与对照组相比,QKI敲除细胞株的增殖明显下降(P<0.05),减数分裂相关分子标志基因c-kit、Mtl5和Hspa2表达量明显降低(P<0.05).结论 QKI蛋白可以影响GC1-spg的增殖和分化,因此QKI蛋白可能通过影响增殖和分化而影响精子发生.

中心体蛋白centrin在大鼠精子发生过程中的表达

目的　研究中心体蛋白centrin在大鼠生精细胞中的表达情况，以深入了解centrin在精子发生过程中的作用。　方法　通过重力沉降法分离大鼠不同发育阶段的生精细胞，用免疫荧光和蛋白印迹实验检测各级生精细胞中centrin蛋白的表达，用定量RT-PCR检测centrin同源基因centrin1和centrin2 mRNA的表达水平。　结果　间接免疫荧光和蛋白印迹显示精母细胞、圆形、长形精子细胞均有centrin蛋白存在，位于中心粒上，而在附睾的成熟精子中centrin则消失。RT-PCR研究发现，centrin1在睾丸组织中特异性表达，centrin2在多种组织中均有表达。在睾丸中，centrin1仅在生精细胞进入减数分裂后转录，其mRNA水平在圆形精子细胞中高，而centrin2在精原细胞中即有表达，减数分裂后其mRNA难以检测到。　结论　centrin蛋白在大鼠雄性配子的发育过程中终丢失；该基因家族中同源基因centrin1和centrin2表达呈现组织特异性和发育阶段特异性，在精子发生过程中发挥不同功能，centrin1蛋白可能与减数分裂及鞭毛生成相关，centrin2则参与细胞有丝分裂过程。

Smad 2和Smad 4蛋白在成年大鼠睾丸的表达

目的探讨转化生长因子-β超家族肽类的细胞内信号转导分子Smad 2和Smad 4蛋白在成年大鼠睾丸的表达及在精子发生中的作用机理. 方法用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵增强技术,检测成年大鼠睾丸Smad 2和Smad 4蛋白的表达和定位. 结果 Smad 2蛋白主要表达在大鼠睾丸生精小管的精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、支持细胞和间质细胞中,免疫反应物质主要定位于细胞质 ,胞核为阴性;而Smad 4蛋白则主要表达于间质细胞的胞质中,支持细胞呈弱阳性染色. 结论 Smad 2蛋白主要表达于睾丸生精小管各级生精细胞,Smad 4蛋白表达于间质细胞,为揭示TGF-β超家族在精子发生中的分子机理提供了直接证据.

低剂量棉酚与激素联合应用的抗生育作用位点的研究

目的 探讨低剂量棉酚与激素联合应用在8周内使大鼠达到不育效果的作用位点.方法 本实验采用大鼠喂服棉酚12.5mg/(kg·d)+去氧孕烯125μg/(kg·d)+炔雌醇25μg/(kg·d)+十一酸睾丸酮100mg/(kg·d)的联合用药方式,与单独喂服相同剂量的棉酚或激素的大鼠及喂服载体溶剂的大鼠相对照,通过一系列形态学观察和半定量检测,探讨联合用药的具体作用环节.结果 无论在睾丸组织形态还是睾丸精子数量,联合用药组的变化趋势都与单独应用激素组的相似,而不同于单独应用棉酚组和对照组.而在附睾中,3个用药组在精子活力和精子形态方面,都与对照组有显著差异.结论 联合用药组中激素主要使睾丸精子数量迅速下降;而在精子数量大大下降的基础上,棉酚和激素又对已成熟精子的结构和运动能力进一步破坏,从而使雄性大鼠受精能力迅速下降,联合用药组比单独应用其中一种成分更快、更有效地达到使大鼠不育的目的.

渔游蛇生精上皮超微结构的季节性变化

目的研究渔游蛇生精上皮各类细胞超微结构的季节性变化,为探讨蛇类的受精机理及人工养殖提供理论依据.方法以2.5%戊二醛和1%锇酸双固定,按常规制作石蜡切片和超薄切片,分别用光镜和H-600电镜观察.结果渔游蛇4月份生精上皮的细胞呈休止状态;5～7月份是精原细胞复苏、增殖、分化形成精母细胞时期;8～9月份是精母细胞分裂成为精细胞时期;9月末至11月份是精子形成高峰期;12月至次年1月份,精子发生渐趋停滞.结论渔游蛇精子发生的周期性符合羊膜动物的基本规律,又有其自身的特点,特别是精子形成过程有许多独特之处.

mRNA差异显示法克隆小鼠精子发生相关基因-p38 MAPK基因

目的　克隆1、2、3、4周龄小鼠睾丸之间差异表达的基因。　方法　应用改良的mRNA差异显示技术，对1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行了基因表达的差异显示分析，并对其中1个从2周龄小鼠中高表达的cDNA片段进行了克隆和测序。　结果　所克隆的cDNA片段与小鼠大脑、造血干细胞p38 MAPK(p38 beta mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK-β)基因的同源性分别为91%和85%。Northern dot blot结果显示该基因在小鼠睾丸和脑组织中表达高。　结论　小鼠p38MAPK基因可能与小鼠精子发生相关。

大鼠精子发生中核基质-核纤层-中间丝体系的研究

目的研究精子发生中的核基质-核纤层-中间丝体系(nuclear matrix-lamina-intermediate filament,NM-L-IF)的变化趋向. 方法利用整装电镜技术、SDS-PAGE和Southwestern blot等技术观察与分析经单位重力沉降法分离的大鼠精母细胞、早期精子细胞和晚期精子细胞的NM-L-IF的形态结构、蛋白组成及其与A-T重复序列的相互关系. 结果精母细胞核基质由核纤层、核仁残余物及内部纤维网络组成.精子细胞中,中间丝丰富,核基质结构被致密的染色质团簇所掩盖.精子形成Ⅷ～Ⅸ期时,核基质分化出两部分:疏松的头端(Ap)和致密的尾端(Ca),中间丝连接细胞核与细胞膜;精子形成Ⅹ～Ⅺ期时,头端和尾端间形成弯曲;ⅩⅡ～ⅩⅣ期,头端进一步弯曲,一部分中间丝连接头端的顶部和头尾端的连接部.SDS-PAGE显示分子量小于40kD的蛋白在不同细胞中组成有差异,而分子量大于40kD的蛋白没有明显差异.Southwestern blot显示精母细胞的低分子量蛋白对A-T重复序列的吸附能力强,而只有早期精子细胞的部分高分子量蛋白对该序列具有很强的亲和力. 结论精子发生中NM-L-IF的形态结构、蛋白组成及与DNA的相互作用发生显著变化,这可能与精子细胞核的浓缩变形以及形态发生密切相关.

肌动蛋白解聚因子在动物生殖和胚胎发育中的作用

肌动蛋白解聚因子家族Cofilin/ADF(AC蛋白家族)属于肌动蛋白结合蛋白,是微丝骨架的一个重要调节者.AC蛋白家族能够截断微丝,促进肌动蛋白单体的解离和循环以及微丝解聚,调控微丝骨架的重建,进而影响与微丝骨架相关的一些生理功能如细胞增殖、迁移、凋亡及胚胎发育等.本文将着重介绍AC蛋白家族在动物生殖诸如精子发生、卵巢发育、卵子发生、卵裂,以及胚胎发育等过程中的调节与功能.

抗细胞凋亡因子DAD1的研究进展

抗细胞凋亡因子(defender against cell death 1,DAD1)是定位于内质网膜上的寡糖基转移酶(OST)的一个亚基,它维持OST复合物的结构完整性,并参与对蛋白质的N-糖基化修饰.该基因早从对温度敏感的仓鼠肾源性细胞株(tsBN7)的突变株中克隆,并发现具有抑制凋亡的功能.大量研究显示,DAD1基因表达于不同物种中,是高度保守的基因,其除了抗凋亡作用,还显示出促进细胞增殖方面的新作用.本文主要介绍DAD1的结构和功能研究进展,展望DAD1的研究前景和发展方向.

果蝇精子发生相关基因及其功能调控

果蝇精子发生过程经历复杂的细胞分化阶段,这一阶段受许多因素的调控,需要大量基因产物的协调作用,且涉及众多基因及其相互作用.本文从果蝇精子发生过程各阶段的主要相关基因展开,综述了果蝇精子发生过程中精巢干细胞微环境相关基因及主要信号通路的调控方式、有丝分裂过程中各细胞周期检验点的相关基因及影响胞质分裂的基因、影响果蝇精子发生过程中减数分裂和线粒体功能的相关基因以及编码果蝇精子蛋白质组的主要基因及其生物学功能.

睾丸生殖细胞的凋亡及其调控

睾丸生殖细胞在分化过程中存在自发性和诱发性凋亡,这是清除过量或异常生殖细胞的一种重要途径.生殖细胞的凋亡涉及内分泌、细胞社会组成和基因等多因素的调控.深入了解生殖细胞凋亡的调控机制,明确决定睾丸生殖细胞(Germ cells, Gc)凋亡机制的分子组成,将为治疗男性不育和开发男性避孕药物奠定理论基础.

镉对长江华溪蟹精子发生过程中细胞核超微结构的影响

目的:为了研究低浓度镉(1.87mg/L)在三个不同时间段(5d、15d、30d)里对长江华溪蟹(Sinopotamon yangtsekiense Bott 1967)精子发生过程中细胞核起超微结构的影响.方法:应用透射电镜(TEM)技术.结果:在各生精细胞中细胞核均有不同程度的变化,首先受影响的是核的形状,从正常的圆形或卵圆形的核,到处理后形状多样;其次是核膜的变化,先肿胀膨大,进而破裂,核孔增多.同时核内染色质也受到影响,分布不均匀或聚集成块,核仁有或无.结论:低浓度镉对长江华溪蟹精子发生过程中细胞核超微结构的影响,为进一步探讨镉对核内遗传物质的影响奠定了基础.

声触诊组织成像定量技术评价正常成人睾丸生精功能

目的 采用声触诊组织成像定量(VTIQ)技术测量正常成人睾丸剪切波速度(SWV),分析影响睾丸弹性硬度的主要因素,探讨其评价男性睾丸生精功能的价值.方法 招募200名正常成年男性志愿者行睾丸常规超声检查,测量双侧睾丸体积.以VTIQ技术测量双侧睾丸上极、中份、下极的SWV,比较双侧睾丸、不同年龄组睾丸SWV差异,并与年龄、睾丸体积和精子活动率和精子密度进行相关性分析.结果 200名正常成年男性左右侧睾丸SWV均为(1.23士0.18)m/s,左右侧差异无统计学意义(t=-0.376,P=0.710).21～30岁组、31～40岁组、41～50岁与51～60岁组间双侧睾丸SWV值总体差异均有统计学意义(P均＜0.001).睾丸SWV与年龄呈正相关(r=0.454,P＜0.001),与睾丸体积、精子活动率和精子密度分别呈负相关(r=-0.649、-0.668、-0.675,P均＜0.001).结论 VTIQ技术可定量测量睾丸组织硬度,有望用于初步评估睾丸生精功能.

成年男性阴囊局部热压后精液一氧化氮及精子DNA改变

目的：观察成年生育男性阴囊在局部热压后血清生殖激素水平、精液参数、一氧化氮（NO）及精子DNA完整性的改变。方法23例已育成年健康男性志愿者阴囊外部放置恒温加热带（阴囊热压，SHS），热压温度43℃，每周2次，每次50 min，连续3个月。化学发光免疫分析法测定血清生殖内分泌激素T、FSH、LH，硝酸还原法测定精液NO含量，精液常规分析、精子低渗肿胀试验（HOS）及精子染色质扩散试验（SCD）分别在试验开始前和试验后进行。SHS 试验前后进行自身对照。结果 SHS试验1、2及3个月血清T水平、精子密度及存活率比试验前明显下降（P＜0.01），FSH及LH水平、畸形精子、精液NO含量及精子DNA碎片明显增高（P＜0.001）。停止SHS试验3个月后上述各项指标又恢复到试验前水平。精子存活率与精子畸形率呈正相关（r＝0.496，P＝0.016），精液 NO 含量与精子密度呈负相关（r＝-0.497，P＝0.016），与畸形精子比率及精子 DNA 碎片比率呈正相关（r＝0.510，P＝0.013；r＝0.508，P＝0.014）。结论短期恒温睾丸热压能够影响精液质量，抗生育效果明显，SHS停止后可较快恢复。

EAA／EMQN Y 染色体微缺失分子诊断应用指南解读

Y染色体长臂上与精子发生密切相关的区域被命名为无精子因子（ azoospermia factor ， AZF ），分为AZFa、AZFb、AZFc 三个区域， Y 染色体微缺失即AZF区域基因片段的缺失，在精子发生障碍引起的男性不育中，Y染色体微缺失的发生率仅次于克氏综合征（ Klinefelter′s syndrome ），是居于第二位的遗传因素，已作为常规基因检测成为无精症或少精症诊断流程中的重要组成部分。

国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库的构建及意义

目的研究精子发生相关基因的结构与功能,构建中国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库. 方法提取国人正常睾丸组织mRNA,逆转录合成cDNA,SalI/NotI酶切后基因重组法定向克隆于质粒表达载体pSPORT1中,转化细菌后扩增. 结果文库大小为7×105, SalI/NotI酶切鉴定,插入的cDNA片段多为0.5～2.0 kb. 结论国人正常睾丸组织定向克隆表达cDNA文库构建成功,质量较好,可进行包括低丰度mRNA在内的所有丰度mRNA的cDNA克隆筛选,为进一步研究精子发生相关基因的结构与功能提供了实验依据.

细胞因子与男性生育调节

近10余年来，男性生殖系统内细胞因子及其对生殖功能的影响已引起广泛关注。细胞因子是一种免疫活性小分子多肽，是睾丸内各种不同细胞间繁杂的局部调节和信号转导的重要因素，它以自分泌、旁分泌或内分泌形式直接或间接影响精子的发生和功能。细胞因子与生殖系统的关系是相互的, 即生殖系内的各种细胞不仅可以自行产生细胞因子亦可调节细胞因子的分泌，如果细胞因子产生失调，就可能对生殖功能造成一定程度的损害，从而导致免疫性不育。　　一、正常条件下细胞因子对男性生育功能的调节　　在正常条件下，生殖系统内的免疫细胞、间质细胞、支持细胞及精原细胞等分泌IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-10、 IL-11、 IL-12、TNF-α、EGF、IGF、PAF及TGF-β等作为细胞内信号，能够调节生殖细胞的生长与分化，对生殖系的神经内分泌、睾丸功能乃至精子发生有重要的调节作用。同时也维持、调节着睾丸局部的微环境。睾丸内、外分泌功能的多因素调节依赖于促性腺激素的调控及不同类型细胞间的信息交流，在生殖系统内细胞因子与激素实现相互调节。例如人精浆中含有TNF-α、ILs、TGF及其可溶性受体(soluble receptors, sRs)，在体外实验中可调节甾体合成、精子发生及精子功能［1］；人输卵管液中含有高水平的IL-10，在局部免疫调节中发挥重要作用； 而精浆中大量的 TGF-β可为精子提供免疫庇护，但不利的是如此高浓度的TGF-β可能抑制精液留存器官的免疫应答［2］。PAF可明显提高人精子的运动速度，增加精子内cAMP和钙离子浓度，提高精子对金黄田鼠卵的穿卵率［3，4］。新近又发现精浆中IL-10、IL-12及IGF-1水平与精子总数和精子正常形态百分率显著相关，其水平不受精液中白细胞的调控［5］。生育和不育男子精浆中IL-10、IL-12、PGE2、sIL-2Rs和IL-6R的检测结果显示，IL-12、sIL-2R和sIL-6R在两组间无差别，而IL-10在有生殖道感染的精液异常患者中显著降低。在不育者精液中只有IL-1β升高，其它细胞因子及其可溶性受体（IL-2、IL-6、sIL-2R和sIL-6R）两组间无显著差别，而且精浆细胞因子浓度与血清性激素（FSH、LH和T）不相关。实验提示在男性不育症的常规检查中精液细胞因子及其可溶性受体检测不能提供有用的信息［1］。

腺病毒介导的基因转染对小鼠睾丸精子发生和生殖能力的影响

Y染色体新缺失类型gr/gr微缺失对精子发生的影响

目的探讨Y染色体新缺失类型gr/gr微缺失对睾丸精子发生的影响.方法选取Y染色体特异性序列标签点(STS),用多重PCR技术检测严重男性不育患者118例,志愿捐精者120例,观察Y染色体gr/gr微缺失情况.不育患者经2次以上精液分析,均为睾丸性无精子症或精子密度＜1×106/ml.捐精者均经精液分析和染色体检查,符合卫生部标准的正常男性.追踪分析6例gr/gr微缺失者父亲微缺失情况,其中3例为不育者的父亲,另3例为捐精者的父亲.结果多重PCR检测118例男性不育患者gr/gr微缺失12例(10.2%);120例捐精者gr/gr微缺失11例(9.2%).2组比较差异无统计学意义(P＞0.05).6例gr/gr微缺失者的父亲均表现gr/gr微缺失.结论Y染色体gr/gr微缺失既存在于严重不育男性,也存在于生精功能正常的捐精者中,gr/gr微缺失可能遗传自父亲,可能未影响精子的发生,不能认为是精子发生的遗传风险因子.