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多烯脂肪酸对海马神经元细胞脂肪酸构成和生长的作用
目的: 观察长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(AA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)对体外培养新生大鼠海马神经元脂肪酸构成和生长发育的作用. 方法: 采用无血清培养液培养新生大鼠海马神经元,实验组分别在对照组的无血清培养液中添加4 μmol/L AA、4 μ mol/L DHA或总浓度为4 μmol/L、比例为1∶2～16∶1的AA和DHA.采用毛细管气相色谱法分析神经元中脂肪酸的构成,NSE染色鉴定神经元并利用图像分析技术,测量神经元胞体大小和突起长度. 结果: 当培养液中AA和DHA总浓度为4 μmol/L、比例为1∶2～16∶1,海马神经元中AA百分含量、AA/DHA比值与培养液中AA和DHA比例均呈正相关;当培养液中AA和DHA总浓度为4 μmol/L,比例为2∶1或4∶1时,海马神经元的胞体面积、大长径、大短径和平均突起长度均显著高于单一添加4 μ mol/L AA、4 μmol/L DHA、对照组以及其余各比例组. 结论: AA和DHA具有显著促进体外培养海马神经元生长发育的作用.
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低氧状态下海马神经元细胞信号转录因子和活化子3,5的基因表达状况
目的:探讨 STAT3, 5基因在缺氧性海马神经元细胞损伤中的可能作用. 方法:分离新生 Wistar大鼠双侧海马进行体外培养,采用 Tripure试剂提取海马神经元细胞的总 RNA,自行设计大鼠 STAT3, STAT5和阳性对照 HPRT的 PCR引物序列,通过半定量的逆转录多聚酶链反应( RT-PCR)技术检测常氧组、低氧 2, 6, 12 h组海马神经元细胞的 STAT3和 STAT5基因的表达水平;采用 PCR产物纯化试剂盒纯化 PCR产物,而后用四色荧光法直接测序. 结果:图像分析结果显示低氧培养 2 h组海马神经元细胞中 STAT3, 5 mRNA表达水平升高,目的片段与 HPRT的光密度比值分别为 0.57± 0.11和 0.64± 0.09,在低氧 6 h组( 0.85± 0.14和 0.86± 0.11)达高,与正常组( 0.34± 0.12和 0.40± 0.08)比较差别均有显著性意义( t=- 24.59～- 7.37, P< 0.01).低氧 12 h组的表达量低于 6 h组,但高于正常组( P< 0.01).测序显示, PCR扩增的产物 STAT3, STAT5与大鼠 Genbank中的序列完全一致. 结论:低氧增强海马神经元细胞中 STAT3, 5基因的表达,在低氧所致的脑损伤中可能发挥重要作用.
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L型钙通道在"李氏方"水提液保护神经元过程中的作用及该水提液佳剂量
目的:观察L型钙通道在"李氏方"保护神经元中的作用,并找出"李氏方"水提液佳作用剂量.方法:实验于2004-09/2005-08在南方医科大学神经生物学教研室完成.①用MTr法观察不同质量浓度0(对照组),0.062 5,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0g/L"李氏方"(主要成分有龟甲、地龙、石菖蒲、当归及酸枣仁等)水提液分别作用正常条件下培养了9 d的新生大鼠海马神经元24 h的细胞成活率;用Hoechst33258荧光染料标记凋亡的细胞,镜下数三四个视野的总细胞及凋亡细胞数,计算细胞凋亡率(凋亡细胞数占细胞总数的百分比).②借助于共聚焦显微镜和钙荧光指示剂Fluo-3/AM,在海马神经元细胞培养至第8天加处理因素[单纯加入5 μmol/L的L型钙通道阻断剂尼氟的平;单纯加入不同质量浓度的"李氏方"水提液及尼氟的平(5 μmol/L)+不同质量浓度"李氏方"水提液共同作用]继续培养24 h用于实验和细胞培养至第9天观察干扰因素的急性作用.用钙成像技术测定培养的神经元胞浆的荧光值(用30 mmol/L的氯化钾诱导细胞内钙的变化)及钙浓度.③借助于膜片钳全细胞记录技术,观察"李氏方"水提液对L型钙电流的影响.④计量资料差异性比较采用方差分析中的LSD和SNK分析.结果:①0.062 5～2g/L的质量浓度范围"李氏方"水提液明显提高正常培养下的海马神经元的成活率,浓度为0.5 g/L细胞成活率增加大.经5 μmol/L的尼氟的平预处理后,"李氏方"水提液增加神经元成活率的效应明显降低.②"李氏方"水提液明显增加L型钙电流,经尼氟的平预处理后,"李氏方"水提液增加L型钙电流的效应显著降低.③正常培养条件下的海马神经元胞浆游离钙浓度在(75.67±8.65)nmol/L(对照组)."李氏方"水提液作用24 h后,细胞内游离钙浓度提高到(126.35±9.35)nmol/L,明显高于正常培养条件下的(P<0.05).经尼氟的平作用24 h,游离钙降到(40.65±5.65)nmol/L,明显低于正常培养条件下的(P<0.05)."李氏方"水提液与尼氟的平共同作用24h后,细胞游离钙浓度降到(90.75±10.15)nmol/L,明显低于单纯"李氏方"水提液作用(P<0.05).④对正常培养的细胞负载Fluo-3/AM 45 min后,加尼氟的平预处理10 min,30 mmol/L的KCl导致的荧光强度比尼氟的平预处理前明显降低,而"李氏方"水提液预处理10 min,30 mmol/L的KCl导致的荧光强度比"李氏方"水提液预处理前明显升高.尼氟的平预处理10 min后,"李氏方"水提液再预处理10 min,30 mmol/L的KCl导致的荧光强度比"李氏方"水提液预处理的降低,与单纯"李氏方"水提液预处理比较,差异明显(P<0.05).结论:"李氏方"水提液可通过增加L型钙通道活动,导致胞浆游离钙增加而促神经元的成活,且效果佳的浓度为0.5g/L.
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亚力克对大鼠定量脑电图及海马神经细胞的影响
目的 ALEC(亚力克 )是由α-亚麻酸( A)、 L-赖氨酸( L)、维生素 E( E)及维生素 C( C)组成的复方,通过正交试验设计,以脑组织中乳酸含量为指标,确定 4者比例( A: L: E: C为 432: 187: 18: 8) ,研究 ALEC对大鼠在局限性缺血、缺氧状态下的脑细胞保护作用.方法用定量方法分析在体皮层脑电( ECoG)在正常供气与停止呼吸情况下的变化,采用电凝阻断一侧中动脉造成局限性脑缺血模型及判断药物的脑保护作用.结果 ALEC高、中、低 3个剂量组均能延长大鼠急性反复性缺氧皮层脑电消失 /振幅达低时间,缩短脑电恢复时间.ALEC可减少大鼠大脑中动脉梗死( MCAO) 24 h后海马 CA1区细胞死亡数.结论 ALEC对脑细胞具有保护作用.
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电磁脉冲对海马神经元的损伤及其对[Ca2+]i的影响
背景:电磁脉冲照射可影响实验大鼠的学习记忆功能,并造成大鼠海马组织损伤和超微结构改变.目的:观察电磁脉冲对离体培养的海马神经元的损伤效应及其对[Ca2+]i的影响,以深入分析电磁脉冲致脑损伤的可能机制.设计:随机对照动物实验.单位:承德医学院病理教研室.材料:Wistar乳鼠若干只,雌雄各半.电磁脉冲辐射源:高场强电磁脉冲模拟源.方法:实验于2004-03/12分别在军事医学科学院和承德医学院完成.Wistar乳鼠若干只,麻醉下断头取脑,分离海马组织,调整细胞悬液浓度至5×108 L-1接种.分组:①培养细胞分为对照组和照射组,于照射后即刻(0 h)收集细胞进行形态学观察和胞内游离钙离子浓度测定;②另培养细胞分为对照组和照射后0 h组和12 h组,进行细胞凋亡和坏死率的测定.(培养细胞用量:每项检查每组1个培养瓶,重复3次.)电磁脉冲辐射条件为6×104 V/m,脉冲上升时间为20 ns,脉宽为30 μs,频率为2.5脉冲/min,作用2 min.原代培养的海马神经元经电磁脉冲辐射后,倒置相差显微镜下观察照射前后神经元形态学变化;FACS法检测细胞凋亡和坏死;Fluo-3-AM荧光探针负载、激光共聚焦显微镜扫描测定神经元胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i.主要观察指标:神经元形态学变化;细胞凋亡率和坏死率;胞内游离钙 离子浓度[Ca2+]i.结果:①电磁脉冲辐射后即刻,神经细胞逐渐发生液化,神经元突起回缩、变性.②电磁脉冲辐射后12 h凋亡率较辐射后即刻有所恢复,但与对照组相比均显著增加[(59.27±1.27)%,(72.17±6.21)%,(17.45±5.63)%,P＜0.05].③在辐射后即刻和12 h坏死率比对照组升高,但差异无统计学意义[(13.71±2.31)%,(11.96±1.04)%,(8.45±0.67)%,P＞0.05].④电磁脉冲辐射后即刻[Ca2+]i荧光强度显著高于对照组(107.34±26.14,54.93±16.08,P＜0.05).结论:电磁脉冲致海马神经元形态学损伤、坏死与凋亡率增加,神经元内的Ca2+荧光强度明显增加.
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人参皂苷Rb1对睡眠剥夺大鼠学习记忆及脑内生长抑素表达的影响
目的:研究人参皂苷Rb1(ginsenosides Rb1,GSRb1)对睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)大鼠学习记忆与海马及额叶生长抑素(somatostatin,SS)表达的影响.方法:大鼠随机分为睡眠剥夺2d组、4d组、6d组和未睡眠剥夺(SD 0 d)组,每组再分为GSRb1用药组和生理盐水对照组,共8组.采用改良小平台水环境法制作SD大鼠模型.造模前大鼠分别腹腔内注射GSRb1 30 mg/(kg·d)或生理盐水7d.睡眠剥夺2d、4d和6d后采用Morris迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,免疫组织化学法结合图像分析脑内SS阳性神经元数量及SS平均光密度.结果:与SD0d组大鼠比较,SD各组大鼠游泳平均速度减慢(P＜0.01),逃避潜伏期明显延长(P＜0.01);海马CA4&DG区SS表达下降(P ＜0.05);SD 2 d组大鼠额叶SS表达无明显变化(P＞0.05),而SD4 d、6d组SS表达减少明显(P＜0.05).与生理盐水对照组比较,SD组同时段的GSRb1用药组大鼠游泳平均速度显著加快(P＜0.05),逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05),用药组各时段海马内SS阳性神经元数量均明显增多,SS表达增强(P＜0.05).结论:人参皂苷Rb1能显著改善SD大鼠认知功能,该作用可能与增加海马内SS密切相关.
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5-脂氧酶在全脑缺血海马CA1神经元损伤中的作用
目的:观察全脑缺血后海马神经元损伤中5-脂氧酶(5-LOX)的表达变化,并探讨5-LOX选择性抑制剂zileuton对全脑缺血海马神经元损伤的保护作用.方法:在双侧颈总动脉阻断结合降压药诱导大鼠全脑缺血模型,Western blot方法检测脑缺血损伤中5-LOX的表达改变；免疫组织化学及免疫荧光双标染色方法观察5-LOX的分布特征.应用5-LOX选择性抑制剂zileuton(10、30、50 mg/kg,缺血前后2h灌胃给药,以后每日2次,共3d)观察脑缺血后海马神经元的损伤变化.结果:大鼠全脑缺血后3～14d,海马CA1神经元产生迟发性神经元死亡；海马5-LOX表达在全脑缺血后1～7 d增高,并于3d达高峰；在海马CA1区,5-LOX主要表达在神经元胞浆,脑缺血后5-LOX发生核移位现象.5-LOX抑制剂zileuton(30和50 mg/kg)能减少全脑缺血后海马CA1神经元的死亡.结论:5-LOX参与大鼠全脑缺血诱导的海马神经元损伤,5-LOX抑制剂zileuton对全脑缺血海马神经元损伤有保护作用.
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慢性铅暴露大鼠海马脑区自噬相关蛋白表达的研究
目的:观察慢性铅暴露后子代大鼠海马脑区铅含量变化,采用自噬/溶酶体途径关联蛋白标记物探讨慢性铅暴露对海马脑区自噬/溶酶体途径关联信号蛋白表达的影响.方法:以慢性铅暴露子代大鼠为研究对象,随机编号分组为对照组、低剂量铅暴露组(0.5 g/L)和高剂量铅暴露组(2.0 g/L).断乳期仔鼠分笼饲养,仔鼠饮用低、高含量的醋酸铅饮用水直至60天成熟期.分别取血样与海马脑组织样本使用石墨炉原子吸收分光光度法进行铅含量测定,免疫印迹及免疫荧光组化方法分别检测慢性铅暴露后海马脑区自噬相关蛋白Beclin 1、LC3、LAMP2及cathepsin B的表达变化情况.结果:与对照组比较,模型组大鼠血铅含量显著升高(P＜0.O1).同时,低剂量与高剂量铅暴露模型组大鼠海马脑铅含量显著升高,分别为(1.26±0.31)μg/g(低剂量组)与(1.83±0.18) μg/g(高剂量组)vs对照组(0.52±0.13) μg/g.此外,免疫印迹结果显示,高剂量铅暴露组大鼠海马脑区的早期自噬标志物Beclin 1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值较对照组显著增加(P＜0.05或P＜0.001).激光共聚焦显微镜结果显示,慢性铅暴露高剂量组较正常对照组的自噬相关蛋白cathepsin B在海马锥体神经元的阳性表达明显增加.结论:慢性铅暴露诱导大鼠海马脑区发生自噬/溶酶体途径关联信号蛋白表达变化,可能与海马脑区铅含量的增加存在内在关联性.
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三种培养液进行海马神经元原代培养的对比研究
目的 使用3种培养液对海马神经元进行培养,遴选出一种使神经元存活率较高、存活时间较长的培养液.方法 分离SD大鼠胎鼠的海马神经元,分别用DMEM、DMEM/F12和Neurobasal培养液进行培养,应用倒置相差显微镜、台盼蓝排斥实验、MTT法和LDH释放率法进行细胞形态和细胞活力分析.结果 Neurobasal培养液培养的神经元细胞活力,与另二组培养液培养的神经元活力相比差异有显著性(P＜0.05).结论 Neurobasal培养液可作为海马神经元体外培养的良好培养液.
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人胎海马Nestin免疫阳性细胞的形态学观察
目的探讨不同胎龄海马nestin免疫阳性细胞的分布、形态变化.方法采用ABC免疫细胞化学法结合DAB显色技术研究人胎儿海马内nestin神经元的定位和分布.结果 7例胎儿海马内都有nestin免疫阳性细胞的表达,免疫阳性细胞呈现3种形态,3种形态的细胞在不同胎龄胎儿海马内分布形式、数量有明显不同.结论人胎海马Nestin免疫阳性细胞呈3种不同的形态,其分布形式和表达数量随胎龄的变化而变化.
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兴奋和抑制海马神经元对慢波睡眠的影响
目的观察兴奋和抑制海马神经元对慢波睡眠的影响. 方法多导睡眠描记(PSG)和海马微量注射. 结果双侧海马微量注射L-谷氨酸(L-Glu)和环磷酸腺苷(cAMP)引起慢波睡眠(SWS) 和总睡眠时间(TST)增加,觉醒减少;海马微量注射γ-氨基丁酸(GABA)引起SWS和TST减少,觉醒增多. 结论海马参与慢波睡眠的调节,兴奋海马神经元可促进慢波睡眠,抑制海马神经元则抑制慢波睡眠,并且cAMP可能也参与了L-Glu对慢波睡眠的调节.
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花生四烯酸和二十二碳六烯酸对海马神经细胞生长发育的影响
[目的] 观察不同浓度花生四烯酸(AA)和(或)二十二碳六烯酸(DHA)对体外培养海马神经细胞生长发育的影响.[方法] 无血清培养液中分别加入不同剂量的AA和(或)DHA,采用噻唑蓝比色试验(MTT法)反映各组海马神经细胞存活状况,神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色鉴定神经细胞,图像分析技术测量神经细胞的胞体大小和突起长度.[结果] 培养液中分别添加AA为4～8 μmol/L、DHA为2～8 μmol/L时,神经细胞活力高于对照组;当培养液中AA和DHA总浓度为4 μmol/L、比例为2∶1或4∶1时,神经细胞的活力、胞体面积、大长径、大短径和平均突起长度均显著高于单一添加4 μmol/L AA、4 μmol/L DHA和对照组.[结论] AA、DHA均具有促进体外培养海马神经细胞生长发育的作用;与单独添加AA、DHA相比,AA和DHA共同作用的促海马神经细胞生长发育作用更好.
