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异源性表达载体--爪蟾卵母细胞的内源性离子通道
作为异源性表达载体,非洲爪蟾卵母细胞用于各种蛋白的表达,包括受体、离子通道、转运体等,为研究所表达蛋白的结构、功能及药理学特性提供了重要的手段,已在生命科学研究领域内得到了广泛的应用.本文就近年来对爪蟾卵母细胞内源性离子通道的研究进展作一综述,以期对全面、客观的解释和评价爪蟾卵母细胞所表达的异源性离子通道的研究结果提供帮助.
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激活方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响
目的:探讨电激活及化学激活对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响.方法:采用血清饥饿法同步化处理的SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞,常规超排KM小鼠获得卵母细胞,采用盲吸法去核,显微直接注核法构建重组胚,分别采用6-DMAP+乙醇、放线菌酮、透明质酸酶3种化学激活方法和不同电场强度、脉冲电激活重组胚,CZB培养液中培养,观察重组胚发育.结果:电激活:电场强度(V/cm)/脉冲时间(ms)为:1 000/100,1 500/30,1 800/30,2 400/40时,卵裂率分别为:17.39%,28.07%,26.52%,0.00%.化学激活:使用透明质酸酶、放线菌酮、6-DMAP+乙醇时卵裂率分别为:5.56%,25.00%和33.91%.结论:电激活和化学激活均可有效激活重组胚;电激活时当电压为1 500～1 800 V/cm、脉冲为30～40 ms时,有利于重组胚的发育,电压过高时会将重组胚击碎;本实验所有激活方法中,6-DMAP+乙醇激活法所得卵裂率和桑椹胚率高.
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运动与骨骼肌中钙振荡
Ca2+作为细胞第二信使,对调节肌肉兴奋一收缩耦联、分泌细胞兴奋一分泌耦联、神经元可塑性、递质释放、胞吐作用、卵母细胞受精信号,以及多种酶活性、细胞分化、生长等发挥关键的作用.即使在同一细胞,Ca2+也能激活不同的信号通路[1,2].然而,Ca2+作用原理却似乎十分简单:Ca2+作为单原子二价阳离子既不被分解也不被合成,只是通过与效应蛋白的结合与解离,以及在不同细胞器之间的运动,来实现其对生物学过程的控制[3].
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双苯氟嗪对表达于爪蟾卵母细胞上的KCNQ1/KCNE1钾通道电流的影响
目的 研究双苯氟嗪对KCNQ1/KCNE1钾通道电流的影响,以探讨其抗心律失常作用的可能机制.方法 采用双电极电压钳技术,观察双苯氟嗪对表达于非洲爪蟾卵母细胞上的KCNQ1/KCNE1钾通道电流的影响.结果 双苯氟嗪(0.3～30 μmol·L-1)浓度依赖性地抑制KCNQ1/KCNE1电流,IC50为(8.9±1.8)μmol·L-1.在-10～90 mV范围内双苯氟嗪对KCNQ1/KCNE1电流的抑制作用具有电压依赖性.双苯氟嗪10 μmol·L-1使KCNQ1/KCNE1电流的半数激活电压右移3 mV,增大激活时间常数,减慢KCNQ1/KCNE1电流的激活;降低慢去活时间常数和快去活时间常数,加速KCNQ1/KCNE1电流的去活.结论 双苯氟嗪降低KCNQ1/KCNE1钾通道电流并改变其动力学特征, 提示双苯氟嗪抗心律失常的作用可能与其有关.
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玻璃化冷冻方法中冷冻保护剂及制冷速度对家兔卵母细胞纺锤体的影响
目的:探讨玻璃化冷冻方法中冷冻保护剂及制冷速度对家兔第二次减数分裂中期卵母细胞纺锤体的影响.方法:以冷冻环为载体,单用乙二醇(ethylene glycol,EG)或乙二醇与二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)联合作冷冻保护剂,用直投液氮或使用玻璃化冷冻仪高速制冷冷冻家兔卵母细胞;解冻2 h后固定并免疫荧光法染色纺锤丝及染色体;用共聚焦扫描显微镜观察纺锤体形态.结果:在单用EG以及EG和DMSO联合直投液氮的方案中,纺锤体损伤较严重,但在EG和DMSO联合应用并采用玻璃化冷冻仪提高制冷速度的方案中,纺锤体形态正常的比例与对照组相似.结论:玻璃化冷冻方法中采用冷冻保护剂联合及采用玻璃化冷冻仪高速制冷对保持解冻后家兔卵母细胞纺锤体形态效果好.
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人卵母细胞形态学指标预测受精和胚胎发育潜能
目的:探讨卵母细胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)周期中人卵母细胞形态学测量的指标与受精和胚胎发育潜能之间的关系.方法:利用OCTAX Eye-ware software系统在对卵母细胞行ICSI前,逐一采集卵母细胞图像,测量透明带厚度、卵母细胞大小、极体位置的卵间隙大小和极体形态(完整或破碎),将ICSI后的卵母细胞和受精后的胚胎进行单孔培养,记录每个卵母细胞的受精情况、胚胎发育情况.对卵母细胞的形态数据与受精情况、胚胎发育情况进行逐步多元因素Logistic回归分析.结果:共测量卵母细胞436枚,受精率84.9％ (370/436),胚胎可用率60.8％(225/370),卵母细胞形态学指标中,透明带厚度、极体位置的卵间隙大小和卵母细胞受精与否有关,受精卵较未受精卵有较厚的透明带[(18.0±2.3)μm vs.(16.9 ±2.7) μm]和较大的卵间隙[(14.4±3.3)μm vs.(13.2±3.9)μm];而卵母细胞的大小和极体形态均与取卵后72 h的胚胎发育质量有关,发育为可用胚胎的卵母细胞较发育为废用胚胎者有较大的直径[(116.6±3.7) μm vs.(114.7±3.6) μm]和较高的极体完整率(86.2％ vs.66.7％).结论:人卵母细胞形态学测量的指标可预示卵子受精和胚胎发育的潜能.
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抑制线粒体氧化磷酸化活性对卵子体外成熟、受精及发育的影响
目的:通过建立氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)活性抑制模型,分析线粒体能量代谢在卵子成熟、受精和胚胎发育过程中的作用.方法:卵子体外成熟培养液中引入10和100 nmol/L羰基氰4-(三氟甲氧基)苯腙[carbonyl cyanide p-(tri-fluromethoxy) phenyl-hydrazone,FCCP],以特异性抑制线粒体OXPHOS活性,分析卵子线粒体膜电位强度、三磷酸腺苷含量以及线粒体DNA拷贝数,以验证FCCP效应;检测卵子的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量、纺缍体和染色体结构完整性,并统计分析卵子体外生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率、核成熟率、受精率及囊胚形成率.结果:FCCP(10和100nmol/L)处理组与对照组相比,卵子的核成熟率(55.8％和47.3％,vs.62.9％)、纺锤体/染色体结构完整率(37.9％和34.7％,vs.61.9％)、ROS水平(0.67和0.59,vs.0.94)和囊胚形成率(57.9％和41.8％,vs.68.3％)均有显著降低(P＜0.05);而FCCP处理对卵子的GVBD发生率和体外受精率均没有显著影响(P＞0.05).结论:线粒体能量缺乏显著降低卵子的核成熟率、ROS生成、纺锤体/染色体结构完整率和囊胚形成率,但对卵子的GVBD发生率和受精率没有显著改变.
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人卵母细胞冻融的研究与应用
冷冻卵母细胞与冷冻胚胎对于治疗不孕症都具有重要价值.冷冻胚胎技术于1983年首次成功用于人类胚胎的保存[1].这些年来精子及胚胎冷冻已普遍用于生殖领域,但卵母细胞冷冻仍未在临床上广泛应用.1986年澳洲Chent2]首次报告卵母细胞冷冻合并体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization embryo transfer,IVF-ET)成功妊娠1例.目前这方面成功的经验仍不多.
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线粒体功能在卵母细胞成熟中的作用综述
线粒体为真核细胞的重要细胞器之一,作为细胞的“能量工厂”合成三磷酸腺苷,参与细胞生长、分化、增殖、凋亡、信号传导等细胞活动.在人体中,卵母细胞中线粒体数量多,为卵母细胞成熟、受精及早期胚胎正常发育提供所需的能量.线粒体功能受损会导致卵母细胞老化、妊娠失败或人类辅助生殖成功率下降.本文将线粒体分布、线粒体膜电位、线粒体DNA拷贝或突变对卵母细胞成熟的影响进行综述.
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卵泡代谢及卵巢储备影响因素综述
卵巢在女性一生中极其重要,从出生到发育期、育龄期,后到围绝经期和老年期,卵巢经历了一系列变化,这些变化直接影响生殖功能、性特征及心理.卵巢功能有两个方面:排出卵母细胞和产生女性激素.女性在出生后卵巢内卵母细胞不再增加并随年龄增大逐渐减少.因此,卵母细胞是珍贵有限的,保护卵巢十分重要.卵巢保守性手术时,需尽量保存卵巢组织,减少机械损伤和热损伤.有生育要求的患者,输卵管手术时应尽量保留输卵管.
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昆明小鼠未成熟卵母细胞OPS和SSV冷冻保存的比较
目的 寻找昆明小鼠卵母细胞冷冻保存效率的新途径.方法 选用5～6周龄雌性昆明小鼠的未成熟卵母细胞,在不同前处理液(10%EG或10%EG+10%DMSO)中平衡5 min,然后在冷冻液(EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40)中平衡30 s后进行OPS(Open pulled straw)法和SSV(Solid-surface vitrification)法玻璃化冷冻保存.结果 小鼠未成熟卵母细胞的OPS法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率高为84.4%,成熟率低于16.7%;而在SSV法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率高为86.0%,成熟率为46.5%.OPS法和SSV法冷冻小鼠未成熟卵母细胞形态正常率为91.6%和91.4%,与对照组间差异较显著(P＞0.01);成熟率为42.9%和59.1%,与对照组差异极显著(P＜0.01).结论 多种抗冻保护剂组合使用效果好于单种抗冻保护剂;EDFS冷冻液冷冻保存效果好于EFS,尤其是EDFS30;OPS法可以有效地冷冻保存小鼠未成熟卵母细胞,且新型玻璃化冷冻法SSV法冷冻保存效果优于OPS法.
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卵巢中Smad信号的传导
女性卵巢的主要功能就是产生成熟的卵母细胞生育后代,卵巢还有内分泌功能,主要是促进性成熟和生育能力.现已证明几种属于转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子及其受体和分子内的信号分子、Smad,是卵巢发挥重要作用所必需的.
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卵泡液成分与卵母细胞质量相关性研究进展
在辅助生殖治疗过程中，正确评估卵母细胞的质量对于治疗结局具有重要意义。对卵母细胞质量的评估方法有许多种，卵泡液获取方便，是目前对卵母细胞质量评估的理想非侵入性指标。所以，卵泡液因子在评估卵母细胞质量中备受关注。大量研究表明，卵泡液中的甾体激素水平、促性腺激素水平及卵泡液中一些细胞因子均与卵母细胞质量具有相关性。近年来，卵泡液蛋白组学、代谢组学的研究成为主要趋势，也有望成为卵母细胞评估的重要工具。
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高血糖对卵母细胞和早期胚胎细胞凋亡的影响
妊娠糖尿病妇女流产、畸胎等并发症与高糖环境下卵母细胞、早期胚胎细胞凋亡密切相关.高血糖能通过死亡受体途径诱发卵母细胞凋亡,细胞闻缝隙连接蛋白Connexin-43表达减少与颗粒细胞凋亡密切相关;高血糖还能通过线粒体途径诱导早期胚胎细胞凋亡,Bax、Bcl-2、p53等基因的调控在其中扮演重要角色.葡萄糖转运子表达减少是着床前胚胎细胞凋亡的始发因素,而氧化应激则与着床后早期胚胎细胞凋亡机制相关联.
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卵母细胞冷冻的临床应用进展
人类卵母细胞冷冻作为生育力保存的一种方式,在辅助生殖技术中起关键作用,目前已在辅助生殖领域得到越来越广泛的应用,并成为生殖医学的研究热点之一.卵母细胞冷冻技术经过多年的发展也取得了较大的进步,冷冻方法上新兴的玻璃化冷冻法逐步取代了传统的程序化慢速冷冻.但不同成熟期人卵母细胞冷冻保存的研究仍有诸多争议.卵母细胞的冷冻保存不论冷冻方法还是冷冻技术如何,都有与年龄相关的婴儿出生率下降的趋势.
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温度、冻存液体积和操作时间对小鼠卵子Cryotop玻璃化冻融复苏率的影响
目的 探讨Cryotop法中冷冻操作环境温度、加载覆盖的保护液微滴体积以及投入液氮前暴露于高浓度冷冻保护剂(CPA)的时间对小鼠MⅡ期卵子玻璃化冻融效果的影响.方法 对6周龄KM系小鼠促排卵、脱颗粒细胞以获得形态良好的MⅡ期卵子,用Cryotop法对其进行玻璃化冻融,卵母细胞随机分组后实验方案如下:根据冷冻环境温度的不同,设置37℃操作组和22℃操作组;根据薄膜上包被的保护液微滴体积的不同,设置＜0.1 μL组、0.1 ～0.5 μL组和＞0.5～1.0 μL组;根据与CPA的接触时间的不同,将冷冻卵子分为30～40 s暴露组、＞40～90 s暴露组和＞90～180 s暴露组.随后对各组卵母细胞的复苏率进行统计比较.结果 22℃操作组小鼠卵子的复苏率为81.4％,显著高于37℃操作组的50.7％,差异有高度统计学意义(P＜0.01).选择22℃的操作环境,＜0.1 μL组、0.1～0.5 μL组、＞0.5～1.0 μL组复苏率(85.7％、90.5％、83.2％)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).＞90～180 s CPA暴露组的卵子复苏率为74.7％,低于30～40 s暴露组(83.3％)和＞40～90 s暴露组(78.9％),差异无统计学意义(P＞0.05).结论 使用Cryotop法冻融卵母细胞时,不必刻意追求＜0.1 μL的保护液加载体积.卵子在高浓度CPA中的暴露时间不宜过长,且控制在30～90 s内对其存活率无明显影响.在常温(22℃)环境下进行操作可改善复苏结局.
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白藜芦醇对冻融后小鼠成熟卵母细胞氧化应激水平和线粒体功能的影响
目的 探讨白藜芦醇(Res)对冻融后小鼠成熟卵母细胞活性氧(ROS)水平和线粒体功能的影响.方法 根据是否在冷冻复苏培养液中添加Res,将解冻后存活的卵母细胞分为两组:Res组和对照组.二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)检测ROS水平,JC-1荧光染色检测线粒体膜电位(△Ψm).结果 卵母细胞玻璃化冷冻解冻的存活率为89.0％(267/300),其中125、142枚分别进行ROS和△Ψm检测.Res组的ROS水平(0.64±0.17)较对照组(1.00±0.26)明显降低(P＜0.01),Res组的△Ψm(1.16±0.40)较对照组(0.87±0.28)明显增加(P＜0.01).结论 Res能降低小鼠冻融卵母细胞的氧化应激水平并增加其线粒体功能,可能有助于卵母细胞的损伤修复.
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胎儿卵巢的形态学及细胞凋亡的观察与研究
目的：探讨人胎儿卵泡的发育形成过程及卵细胞凋亡情况。方法收集2013年1~12月于广东省计划生育科学技术研究所行中期妊娠及晚期妊娠(24~32周)引产的女性胎儿卵巢组织18例。其中24~27周(孕中期)胎儿卵巢组织8例,28~32周(孕晚期)胎儿卵巢组织10例。采用免疫组化苏木精-伊红(HE)染色及原位末端标记法(TUNEL),观察胎儿卵巢卵泡发育及形成过程及该过程中卵细胞凋亡情况。结果 HE染色显微镜下观察,孕中期胎龄卵巢原始卵母细胞较多,卵巢间质少,颗粒细胞较少。随着胎龄的增加,颗粒细胞逐渐增多；围绕卵母细胞,原始卵泡逐渐形成并开始增多,卵母细胞数量减少。孕晚期原始卵母细胞明显减少,原始卵泡形成,数量进一步增多,随着孕龄增加,原始卵泡愈发完整。 TUNEL染色观察见阳性凋亡细胞多见于未形成卵泡的卵母细胞,卵细胞周围的颗粒细胞在孕晚期可见少许凋亡,卵泡内卵细胞未见阳性染色。孕中期卵巢卵母细胞凋亡明显多于孕晚期,且凋亡主要发生于未形成原始卵泡的卵母细胞。结论胎儿卵巢发育过程中,原始卵母细胞数量逐步减少,原始卵泡形成,其发育过程中原始卵母细胞不断发生凋亡,导致生殖细胞丢失。
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磷酸二酯酶5选择性抑制剂zaprinast对小鼠卵母细胞成熟的影响
目的 研究磷酸二酯酶5(PDE5)选择性抑制剂扎普司托 (zaprinast) 对小鼠卵母细胞体外成熟的影响.方法 采用小鼠卵母细胞自发成熟、促卵泡刺激素(FSH)诱导次黄嘌呤(HX)阻滞成熟以及卵泡卵母细胞成熟三种体外培养模型.结果 10 μ mol/L 的zaprinast不仅能显著抑制小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs)和裸卵(Dos)的自发成熟(P<0.01),而且还能显著抑制FSH对HX阻滞的COCs的以及卵泡卵母细胞成熟的促进效应(P<0.01).结论 PDE5能促进小鼠卵母细胞的体外成熟.
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小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究
目的对小鼠卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液进行研究.方法用两种玻璃化冷冻液EFS40(高钠)、DEFS40(低钠)对ICR、C57BI/6J小鼠卵母细胞进行冷冻,0.5 mol/L蔗糖液解冻,体外授精前对部分解冻后的C57BL/6J小鼠卵母细胞进行透明带切割.结果DEFS40冷冻液冷冻效果明显高于EFS40冷冻液,ICR小鼠卵母细胞解冻后成活率达75.2%、体外授精率(24.6%)与对照组相比差异无显著性,C57BL/6J小鼠卵母细胞解冻后成活率为87.1%、卵母细胞切割后体外受精率(36.0%)与对照组相比差异也无显著性.结论冷冻液中钠离子浓度影响小鼠卵母细胞冷冻效果,用DEFS40(低钠)冷冻液进行玻璃化冷冻可以取得理想的冷冻效果.
