抗人CD40单克隆抗体偶联纳米胶束药物载体系统的构建及其生物学特性
摘要： 目的:将抗人CD40单克隆抗体5C11与3种含有不同反应基团的聚合胶束(polymeric micelle,PM)偶联,构建相应5C11偶联的聚合胶束(5C11 coupled polymeric micelle,PM-5C11),筛选出其中适合与5C11偶联的PM,并观察该偶联物的生物学特性.方法:分别合成3种不同化学结构的聚合物材料,制备相应PM,与5C11偶联后制备PM-5C11,选择其中偶联率和生物安全性均较高的作为适PM-5C11.将适PM-5C11与人Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株作用,观测其生物学活性及其被Daudi细胞摄取的能力.结果:成功制备了分别含对甲苯磺酸酯基、丙烯基、羧基的3种PM,其中含对甲苯磺酸酯基和羧基的PM与5C11的偶联率均明显高于含丙烯基的PM的偶联率[(28.08±2.24)％、(29.06±1.37)％ vs (21.26±1.04)％,P＜0.05]；由于含羧基的PM在制备过程中易残留细胞毒性物质,故选取含对甲苯磺酸酯基的PM作为适PM.相应的适PM成功偶联5C11形成PM-5C11,适PM-5C11显示出5C11原有的生物学活性,并且可被Daudi细胞摄取.结论:构建的3种PM中,含对甲苯磺酸酯基的PM在生物安全性、偶联率及相应PM-5C11的生物学活性方面优,可作为构建纳米药物载体的佳选择.
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靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体T细胞的构建及其对肿瘤细胞的杀伤
目的:探索通过嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞靶向B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)以治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的方法.方法:构建基于鼠源BCMA scFv的CAR-BCMA分子,包装为慢病毒载体并感染健康人T细胞构建CAR-BCMA-T细胞;构建BCMA阳性细胞系A549-BCMA、A549-BCMAOFP和K562-BCMA作为靶细胞.将CAR-BCMA-T细胞与构建的靶细胞和人骨髓瘤细胞U266共孵育,CCK-8法和流式细胞术检测其对BC-MA阳性肿瘤细胞的杀伤能力.构建MM患者来源CAR-BCMA-T细胞并检测其杀伤靶细胞A549-BCMA的能力,并采用ELISA和流式细胞术检测CAR-BCMA-T细胞IFN-γ的释放水平.结果:健康人来源的CAR-BCMA-T经过11d培养扩增300倍,阳性率达到43％;成功构建BCMA阳性靶细胞.在5:1效靶比下,CAR-BCMA-T对A549-BCMA、K562-BCMA和U266细胞的杀伤率分别在80％、60％和80％左右,显著高于对BCMA阴性细胞的杀伤率,且杀伤力与靶细胞的BCMA表达强度相关.在效靶比20:1时,MM患者来源CAR-BCMA-T细胞对靶细胞A549-BCMA的杀伤率达到95％以上,并且大量分泌IFN-γ.结论:本研究成功构建了健康人及MM患者来源的靶向BCMA的CAR-T细胞,其能够有效特异杀伤BCMA阳性的肿瘤细胞.
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GSDME通过调控细胞焦亡影响乳腺癌MCF-7细胞对紫杉醇的敏感性
目的:探讨GSDME是否通过调控细胞焦亡影响乳腺癌MCF-7细胞对化疗药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)的敏感性.方法:利用RNA干扰技术敲降GSDME在MCF-7细胞中的表达,采用CCK-8法、流式细胞术、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放实验及Wb技术分别检测GSDME低表达前后,PTX对细胞增殖、焦亡、LDH释放、GSDME-N端蛋白及cleaved-caspase-3蛋白表达水平的变化情况.结果:与对照组比较,PTX处理组细胞的焦亡率、LDH释放量、GSDME-N端蛋白及cleaved-caspase-3蛋白的表达水平均显著升高(均P＜0.01);与si-NC组比较,敲低GSDME可使si-GSDME组细胞对PTX的敏感性降低,其细胞焦亡率、LDH释放量及GSDME-N端蛋白表达水平均显著下降(均P＜0.01).结论:敲减MCF-7细胞中GSDME的表达量可显著抑制细胞焦亡并降低细胞对PTX的敏感性.
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肺腺癌相关基因的生物信息学分析
目的:通过生物信息学分析基因表达谱,获取肺腺癌相关基因及信号通路.方法:从GEO数据库下载GSE40791、GSE68571、GSE43458和GSE18842表达数据,将4个微阵列数据集整合获得肺腺癌相关差异表达基因,利用STRING数据库为差异表达基因构建肺腺癌蛋白-蛋白互相作用网络,并挖掘肺腺癌网络中基因模块及关键基因.通过DAVID对各基因模块进行基因富集分析,发掘基因模块在肺腺癌细胞中所执行的调控功能及模块中关键基因与患者的预后关系.结果:初步筛查获得肺腺癌相关37个上调基因、120个下调基因,并成功构建蛋白-蛋白相互作用网络,通过MCODE算法在蛋白-蛋白相互作用网络中构建基因模块以及计算关键基因(KIF14,SEPP1,SPP1,RBP4),终获得的4个模块分别参与细胞周期、血凝变化、细胞黏附和细胞代谢的调控.经验证4个关键基因在肺腺癌和正常组织中有明显表达差异(P＜0.05).生存分析显示KIF14的表达对肺腺癌的预后有显著影响(P＜0.01),SEPP1、SPP1对患者生存率有显著影响(P＜0.05),RBP4对患者的生存率影响无统计学意义(P＞0.05).结论:通过生物信息方法分析肺腺癌和癌旁正常组织的差异基因表达,终筛选出3个差异表达非常显著且对患者预后影响明显的基因,对肺腺癌的诊断和预后治疗提供了新思路,提高肺腺癌机制的研究效率.
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雷公藤甲素对人子宫颈微血管内皮细胞活性的抑制
目的:探究雷公藤甲素对人子宫颈微血管生成的抑制作用,并探讨其作用机制.方法:选择人子宫颈微血管内皮细胞(HCerMEC)作为研究对象,体外培养过程中分别给予0、5、10和20、40 ng/ml的雷公藤甲素处理,采用CCK-8法测定其对细胞增殖的影响,transwell实验检测细胞的迁移能力,western blotting检测细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化.结果:雷公藤甲素抑制HCerMEC的增殖活性和细胞迁移能力,并呈剂量依赖关系(P＜0.05).雷公藤甲素能够抑制HCerMEC细胞内VEGF的表达,药物浓度越高抑制作用越强.结论:雷公藤甲素可以抑制HCerMEC细胞增殖和迁移活性,该作用与其抑制VEGF表达有关.
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miR-140靶向抑制PD-L1表达增强宫颈癌HeLa和Caski细胞对奥沙利铂的敏感性
目的:探究miR-140能否通过靶向抑制程序性细胞死亡蛋白-1 (programmed death-1,PD-L1)表达增强宫颈癌(cervical cancer,CC)细胞对奥沙利铂的敏感性.方法:采用qPCR检测miR-140在人正常宫颈细胞、CC细胞株及其奥沙利铂耐药细胞株中的表达情况;采用miR-140模拟物转染细胞,CCK-8法检测CC正常细胞株及其奥沙利铂耐药细胞株的增殖情况、克隆形成实验检测细胞的克隆形成率.通过Starbase及TargetScan在线分析软件预测miR-140与PD-L1的靶向结合位点,并通过双荧光素酶报告基因验证miR-140与PD-L1的靶向结合关系.采用AnnexinV FITC/PI双染色法和Wb法分别检测过表达miR-140或同时过表达PD-L1,且在使用奥沙利铂处理后CC细胞的凋亡、迁移及凋亡相关蛋白的表达情况.建立裸鼠CC移植瘤模型,检测miR-140加强肿瘤对奥沙利铂处理敏感性的效果.结果:miR-140在奥沙利铂耐药性CC细胞中表达显著下调(P＜0.01),过表达miR-140能够明显上调奥沙利铂耐药CC细胞对奥沙利铂的敏感性(P＜0.05),抑制CC细胞的增殖及克隆形成(均P＜0.01).miR-140与PD-L1 3'-UTR靶向结合并抑制其表达.过表达miR-140显著促进CC细胞的迁移及凋亡(P＜0.01),过表达miR-140的同时过表达PD-L1明显减弱了miR-140对CC细胞迁移的抑制及细胞凋亡的促进作用(均P＜0.05).小鼠异体移植瘤模型验证了miR-140促进肿瘤对奥沙利铂的敏感性.结论:miR-140通过靶向抑制PD-L1表达增加CC细胞对奥沙利铂的敏感性,上调miR-140或抑制PD-L1的表达再与奥沙利铂联合处理有可能作为奥沙利铂耐药CC治疗的新策略.
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LncRNA MALAT1通过调控miR-124-3p/IGF2BP1分子轴促进宫颈癌细胞增殖和转移
目的:探讨lncRNA MALAT1通过调控miR-124-3p/IGF2BP1分子轴介导宫颈癌细胞增殖和转移的影响.方法:选取2014年4月至2017年12月在贵阳市妇幼保健院妇产科收治的、经手术切除的45例宫颈癌患者癌组织及相应癌旁组织标本,以及宫颈癌细胞系SiHa、Caski、HeLa和C33a,采用qPCR法检测癌组织和癌细胞系中MALAT1的表达水平.构建MALAT1敲降载体、miR-124-3p inhibitor及IGF2BP1过表达载体转染宫颈癌细胞,采用CCK-8、Transwell、Wb及免疫荧光实验探讨MALAT1或其敲降后通过miR-124-3p/IGF2BP1分子轴对宫颈癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的影响.采用双荧光素酶报告基因检测lncRNA MALAT1、miR-124-3p及IGF2BP1的靶向调控关系.结果:MALAT1在宫颈癌组织和细胞系中高表达(P＜0.05或P＜0.01).同时,敲降MALAT1显著抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化(P＜0.05或P＜0.01).双荧光素酶报告基因证实MALAT1靶向作用miR-124-3p并下调其表达水平,miR-124-3p可负调控IGF2BP1的表达.实验进一步证实敲降MALAT1通过靶向上调miR-124-3p对IGF2BP1的抑制作用,进而抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化(P＜0.05或P＜0.01).结论:lncRNA MALAT1通过下调miR-124-3p/IGF2BP1分子轴促进宫颈癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化,为临床宫颈癌早期诊断/治疗提供了潜在的分子靶点.
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LncRNA HCG11通过调控miR-144-3p/ZEB1分子轴影响直肠癌的发生及转移
目的:探究lncRNA HCG11通过调控miR-144-3p上调锌指蛋白E-盒结合同源异形盒-1 (zine fingerE box binding homeobox 1,ZEB1)基因的表达促进结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发生及转移的分子机制.方法:收集2013年1月至2018年1月云南省肿瘤医院结直肠外科手术切除的78例CRC组织标本及其癌旁组织标本,采用qPCR检测HCG11在CRC癌组织及细胞系中表达情况,以构建的HCG11敲降载体、miR-144-3p模拟物及抑制剂转染CRC细胞株SW480及SW620,CCK-8法及克隆形成实验检测细胞的增殖情况,Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭情况.通过Wb及免疫荧光实验检测ZEB1及上皮间质特异蛋白(E-cadherin、Vimentin、α-catenin、Sox2、Nestin、Oct4及Nanog)的表达,通过双荧光素酶报告基因检测HCG11、miR-144-3p及ZEB1的靶向调控关系.建立小鼠移植瘤模型验证敲降HCG11后对小鼠移植瘤生长的抑制作用.结果:HCG11在CRC癌组织的表达显著高于癌旁组织(P＜0.01),其在多种CRC细胞系中表达水平明显高于正常肠上皮细胞(均P＜0.05);HCG11的表达与CRC患者肿瘤转移、临床分期及预后密切相关(P＜0.05或P＜0.01).敲降HCG11后显著抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化及干细胞转化(均P＜0.05).敲降HCG11显著上调miR-144-3p的表达水平(P＜0.05),过表达miR-144-3p可显著抑制ZEB1基因的表达(P＜0.05)及明显降低双荧光素酶活性(P＜0.05).结论:HCG11通过调控miR-144-3p上调ZEB1的表达,从而促进CRC的发生及转移,HCG11可作为CRC诊断及治疗的靶点.
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基于生物信息学分析的食管鳞状细胞癌关键枢纽基因的筛选及验证
目的:采用多种生物信息学分析工具,筛选与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发生发展相关的枢纽基因(Hub gene),并分析其生物学功能.方法:选取GEO食管鳞状细胞癌芯片数据GSE 100942为研究对象,采用GEO2R软件对数据进行处理和分析,筛选差异表达基因,并通过生物信息学工具DAVID、String、Cytoscape构建差异表达基因的蛋白互作网络并筛选Hub基因;应用GO及KEGG进行生物功能富集分析;同时通过网络工具MiRDB寻找可能调控Hub基因的miRNA,并构建Hub基因-miRNA调控网络;利用GEPIA在线分析工具对筛选基因的表达和患者生存情况进行验证.结果:分析GSE100942芯片数据共筛选出1229个表达差异达2倍以上及223个表达差异达4倍以上的差异基因,以及在食管癌组织中表达均上调的20个Hub基因;功能富集分析显示这些差异基因主要富集到了癌症相关通路,并主要参与了细胞分裂及有丝核分裂等生物学过程;从Hub基因进一步鉴定了DLGAP5、BUB1B、TPX2、TTK、CDC20、CCNB2、AURKA、DEPDC1为食管鳞状细胞癌相关的8个关键Hub基因,他们参与了细胞增殖、细胞周期、信号通路等重要生物学过程.通过构建的miRNA调控网络分析,鉴定了CEP55、ECT2、NEK2、DEPDC1及NUSAP1等5个Hub基因受该网络高度调控.结论:基因芯片结合生物信息学方法能够有效分析与食管鳞状细胞癌发生发展相关的差异表达基因,筛选出的20个Hub基因和其中的8个关键基因可为进一步研究食管鳞状细胞癌发病的分子机制及分子标志物的筛选提供理论指导.
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miR-424通过靶向调控HMGA1对乳腺癌细胞放疗敏感性的影响
目的:探讨miR-424/高迁移率蛋白A1基因(nigh mobility protein A1,HMGA1)分子轴对乳腺癌细胞放疗敏感性的影响及其分子机制.方法:收集2014年4月至2017年4月无锡市第四人民医院肿瘤放疗科经手术切除的50例乳腺癌患者的癌组织标本,用qPCR和Western blotting检测miR-424和HMGA1 mRNA与蛋白在乳腺癌放疗敏感患者和放疗抵抗患者癌组织中的表达水平.用不同辐射强度(0、2、4、6和8 Gy)的60Coγ-射线处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-468后,观察细胞miR-424和HMGA1的表达变化.向MDA-MB-468细胞中转染miR-424 mimic/inhibitor和pcDNA-HMGA1,采用平板克隆形成实验、MTT法、Transwell小室法和Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测miR-424对辐射处理后乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.用双荧光素酶报告基因验证miR-424与HMGA1的靶向关系.结果:与放疗抵抗的乳腺癌患者比较,miR-424在放疗敏感的乳腺癌患者癌组织中高表达(P＜0.01),HMGA1低表达(P＜0.01).与0、2和4 Gy处理组细胞比较,6和8 Gy的γ-射线处理后乳腺癌MDA-MB-468细胞凋亡率和miR-424的表达水平显著升高(均P＜0.01);细胞的侵袭能力和HMGA1的表达水平显著降低(均P＜0.01).双荧光素酶报告基因证实miR-424靶向作用HMGA1并下调其表达水平.miR-424通过靶向下调HMGA1显著抑制MDA-MB-468细胞的增殖、侵袭并促进细胞凋亡(均P＜0.01),进而上调MDA-MB-468细胞对放疗的敏感性.结论:miR-424/HMGA1分子轴可调控乳腺癌放疗敏感性,过表达miR-424可增强乳腺癌MDA-MB-468细胞对γ-射线放疗的敏感性.
关键词： 乳腺癌 MDA-MB-468细胞 微小RNA-424 高迁移率蛋白A1基因 放疗敏感性 增殖 侵袭 凋亡 -
肿瘤相关巨噬细胞对胃癌MGC-803细胞恶性生物学行为的影响
目的:探讨肿瘤相关巨噬细胞(rumor-associated macrophage,TAM)对胃癌MGC-803细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其可能的作用机制.方法:体外培养人单核细胞株THP-1,加入佛波酯(PMA)和IL-4后,用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-12、IL-10的水平.取对数生长期MGC-803细胞和M2型TAM,根据培养方式不同分为单独细胞培养组、非接触共培养组和接触共培养组,用MTT法、Transwell小室法分别检测MGC-803细胞的增殖、迁移和侵袭能力,用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测MGC-803细胞的凋亡和细胞周期变化,用qPCR、Western blotting分别检测MGC-803细胞中MMP-9、MMP-2 mRNA和蛋白的表达水平.结果:与PMA组相比,PMA+IL-4组细胞上清液中IL-12水平显著降低、IL-10水平显著升高(均P＜0.05),成功将THP-1细胞诱导分化为M2型TAM.与单独细胞培养组相比,非接触共培养组、接触共培养组:(1)MGC-803细胞的增殖率显著升高(均P＜0.05);(2)细胞的迁移、侵袭数量升高(均P＜0.05);(3)细胞凋亡率显著降低(均P＜0.05);(4)S、G2期细胞的数量升高、G1期数量降低(均P＜0.05);(5)细胞中MMP-9、MMP-2 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(均P＜0.05).结论:TAM可促进胃癌MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭,解除细胞G1期阻滞,减少细胞凋亡,其机制可能与上调胃癌细胞MMP-9、MMP-2表达有关.
